심근 DNA 합성 및 배수성의 동시 평가 : Method는 심근 재생 및 회전율의 정량을 지원합니다

이 프로토콜의 전반적인 목표는 장기 뉴클레오시드 라벨링 및 유세포 분석을 사용하여 심근세포 회전율을 정량화하는 동시에 핵의 배수체화를 고려하면서 neo cardiomyocyte nuclei를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 심근세포 재생 분야의 주요 질문을 해결하는 데 사용할 수 있으며 심근세포 생성 역학의 변화를 정량화하기 위한 스크리닝 도구로 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 세포 소스에 관계없이 신심근세포 생성을 민감하고 정확하게 정량화하고 다배체화를 제어할 수 있다는 것입니다.

6번째 EdU 주사 후 24시간 후, 투여된 동물을 누운 자세로 눕힌 자세로 놓고 수술용 가위를 사용하여 복부 중앙에서 횡격막까지 피부를 절개합니다. 다음으로, 흉골을 체강에서 멀리 떨어뜨리고 횡격막을 양측으로 잘라 심장을 노출시킵니다. 그런 다음 심장을 약간 들어 올리고 유출로의 주요 혈관을 잘라 흉강에서 심장을 절개합니다.

수확 즉시 섭씨 4도로 냉각된 PBS 10mL가 들어 있는 개별 15mL 원심분리 튜브에 심장을 넣습니다. 그런 다음 샘플을 개별 10cm 페트리 접시에 옮기고 메스를 사용하여 각 심장을 시상 방향으로 두 조각으로 자릅니다. 다음으로 한 쌍의 집게로 하트 조각을 부드럽게 짜십시오.

두 심장 조각을 모두 제거하고 신선한 PBS 20mL가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 새 페트리 접시와 신선한 PBS 20mL로 다시 한 번 반복합니다. 심장의 두 부분을 동일한 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 25게이지 바늘을 사용하여 각 튜브의 뚜껑에 작은 구멍을 뚫어 심장이 처리되었을 때 뚜껑이 열리지 않도록 합니다.

그런 다음 각 튜브에 라벨을 붙이고 액체 질소 용기에 심장 조직을 동결합니다. 분석할 각 심장에 대해 울트라 원심분리기 튜브에서 1% BSA 및 PBS 36mL를 배양합니다. 30분 후에 용액을 버리십시오.

튜브가 공기 건조되면 각 튜브에 10mL의 자당 구배 용액을 추가합니다. 메스로 액체 질소 냉동 심장 샘플을 개별적으로 다진 후 각 심장의 조직 조각을 15mL의 세포 용해 완충액이 들어 있는 개별 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 25, 실온에 조사 균질화기로 000 분당 회전수에 15 초 동안 표본을 균질화하십시오.

그런 다음 각 튜브에 15mL의 용해 완충액을 더 추가하고 큰 클리어런스 유봉을 사용하여 샘플을 한 번에 하나씩 40mL 덩어리로 옮깁니다. 유봉으로 10회 스트로크를 수행하고 100미크론 스트레이너를 통해 세포 슬러리를 여과한 다음 40미크론 세포 스트레이너를 사용하여 개별 50mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 그런 다음 원심분리로 핵 심장 펠릿을 수집하고 각각 25mL의 자당 구배 용액에 세포를 재현탁합니다.

준비된 초원심분리기 튜브의 핵이 없는 자당 구배(sucrose gradient) 위에 세포를 층을 쌓고 스윙 아웃 튜브 로터를 사용하여 층을 원심분리합니다. 원심분리 후 1, 300마이크로리터의 핵 저장 버퍼에 핵 펠릿을 재현탁하고 핵을 PCM1이라고 표시된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. PCM1 튜브에서 각 현탁액 300마이크로리터를 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 700마이크로리터의 새로운 핵 저장 버퍼와 라벨 ISO 컨트롤을 추가합니다.

다음으로, PCM1 핵을 항-PCM1 항체로 라벨링하고 ISO 대조 핵을 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 빠른 IGG 동형 대조 항체로 표시합니다. 다음 날, 샘플을 스핀다운하고 펠릿을 1mL의 새로운 핵 저장 버퍼에 재현탁시켜 동일한 조건에서 두 번째 원심분리를 수행합니다. 두 번째 스핀 후, 펠릿을 1mL의 새로운 핵 저장 완충액에 재현탁시키고 암흑 속에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 염소 광견병 방지 IGG 항체의 fitzy conjugated F(ab'2 단편) 1마이크로리터로 핵을 배양합니다.

EdU 혼입 정도를 평가하기 위해 PCM1 및 ISO 대조군은 핵 현탁액을 라벨링하고 펠릿을 1mL의 1%BSA PBS에 2회 연속 세척하여 2회 재현탁합니다. 두 번째 세척 후 상등액을 100마이크로리터의 EdU 정착제로 교체하고 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 고정이 끝나면 PBS BSA 1mL로 핵을 두 번 더 세척한 다음 실온에서 100마이크로리터의 사포닌 기반 투과 용액으로 샘플을 배양합니다.

15분 후, 갓 준비한 EdU 라벨링 칵테일 500마이크로리터를 각 튜브에 첨가하여 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 샘플을 세 번 스핀다운하고 두 번째 두 번의 원심분리 동안 1mL의 PBS BSA로 핵을 세척합니다. 마지막으로 샘플에 400마이크로리터의 DNA 염색 용액으로 라벨을 붙입니다.

맥박이 뛰는 심장의 면역조직학적 분석은 EdU를 통합한 심근세포를 발현하는 PCM1의 존재를 보여줍니다. 그러나 면역조직학적 방법을 사용하여 얻은 데이터는 EdU를 통합한 다른 세포 유형이 심근세포로 잘못 식별될 수 있으므로 잘못 해석될 수 있습니다. mdx 및 control 마우스에 대한 연구에서 이 프로토콜에 자세히 설명된 유세포 분석을 통해 neo cardiomyocyte 핵 생성을 신속하게 정량화하는 동시에 EdU를 depolyploidization에 통합한 세포를 배제할 수 있습니다.

이전에 발표된 데이터와 유사하게, 이 대표적인 실험에서는 연령이 일치하는 대조군과 비교하여 mdx 마우스 심장에서 neo cardiomyocyte nuclei 생성 속도의 증가가 관찰되었습니다. 이 기술을 마스터하면 이틀에 걸쳐 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 분석 중에 게이트를 정확하게 설정할 수 있도록 EdU 및 PCM1 음성 대조군을 모두 기억하는 것이 중요합니다.

이 기술은 또한 여러 가지 추가 다운스트림 면역조직학 기술과 호환되므로 다양한 심장 세포 유형에서 핵세포 통합을 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 비허혈성 심근병증의 mdx 모델에서 심근세포 재생의 변화를 연구하기 위해 심혈관 연구 분야에서 사용되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신심근세포 핵을 신속하게 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 심근세포 재생 및 회전율의 변화를 스크리닝하기 위해 배수성 계수를 관찰