Name: HPLC 측정을 바탕으로 근적외선 분광법에 의한 블루 베리의 성분 내용의 비파괴 예측을위한 모델의 건설 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 학습하세요 근적외선 분광법을 이용한 블루베리 성분의 비파괴 예측 모델 구축 방법을. HPLC 측정 데이터와 스펙트럼 상관관계 분석을 통해 총당, 유기산, 안토시아닌 함량을 정확히 예측할 수 있습니다.

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이 작업은 일본 농림수산성의 "첨단 기술 배치를 통한 재해 지역의 농수산업 활성화 계획" 프로젝트의 일부 지원을 받았습니다.

샘플 1. 컬렉션 <ol><li> 교정 모델의 대상에 포함되는 품종을 결정합니다. </li><li> 충분한 수의 대상 품종의 샘플 블루 베리의 다양한 종류를 수집합니다. <ol><li> 구축 된 모델의 검증을 위해 바람직하게는 100 보정 모델의 건설을위한 블루 베리, 적어도 10를 수집합니다. 견고한 모델을 구축하기 위해, 다양한 색상, 크기 및 숙성의 다양한 조건, 즉 다양한 유형의 샘플을 수집한다. </li></ol></li><li> 각 블루 베리 무게. 주 : 측정 된 무게는 각각의 베리의 성분 함량 %의 계산을 위해 나중에 사용된다. </li></ol> 스펙트럼 2. 측정 <ol><li> 워밍업 측정하기 전에 분광 광도계 충분히 (이상 1 시간)은 신뢰할 수있는 스펙트럼을 얻을 수 있습니다. </li><li> 분광 광도계를 설정합니다. 조건이 모든 측정을 통해 일정 확인합니다.측정을위한 일반적인 조건의 예는 아래와 같습니다. <ol><li> 12,500-3,600 cm로 측정 범위를 설정 -1. </li><li> 16cm에 스펙트럼 해상도를 설정 -1. </li><li> 32 배에 축적를 설정합니다. </li></ol></li><li> 측정 모드로 확산 반사율을 선택합니다. </li><li> 확산 반사율 측정을위한 분광 광도계의 창에 표준 반사판을 넣습니다. 은 &quot;배경 단일 채널&quot;명령을 사용하여 자동으로 측정 한 후 시료 베리의 스펙트럼에서 상대 반사율 스펙트럼을 계산에 사용되는 배경 스펙트럼을 측정한다. </li><li> 확산 반사율을 측정하기위한 분광 윈도우의 중심에 베리 샘플을 넣어. &quot;샘플 단일 채널&quot;명령을 사용하여, 바람직하게는 과일의 여러 지점에서 각 베리의 스펙트럼을 측정한다. 참고 : Kubelka-Munk은 변환 6,7도 자동으로 수행됩니다샘플 블루 베리의 관찰 된 스펙트럼에 대한 matically은 스펙트럼 취득의 조건이 그렇게하도록 설정되어있는 경우. Kubelka-Munk은 변환은 송신 모드에서 측정 한 고정밀 스펙트럼 분석에 필요한 동등한 스펙트럼을 확산 반사율 모드로 측정 한 스펙트럼을 바꾼다. 흡광도 규모의 스펙트럼 분석에 사용된다. </li><li> 베리 샘플의 스펙트럼이 여러 지점에서 측정하는 경우와 같은 MS 엑셀과 같은 데이터 처리 프로그램을 사용하여 각 샘플의 스펙트럼의 평균 스펙트럼을 구한다. 분석에 대한 평균 스펙트럼을 사용합니다. </li></ol> 당류 및 유기산 (8)의 HPLC 측정 3. 전처리 주 : 다음 초순수 물에 가용성 인 당 및 각 베리의 유기산을 추출한다. 각 블루 베리의 전체를 분석하는 데 사용됩니다. <ol><li> FO 아래 -30 ° C 준비 냉동실에 블루 베리 유지그들은 단지 스펙트럼 측정 후 분석하지 않으면 R 화학 분석. </li><li> 이 쉽게 다음 단계 균질화 될 수 있도록 여러 부분으로 베리 잘라. 이 동결 될 때 해동하지 않고 블루 베리를 잘라. </li><li> 50 ml의 비이커에 조각을 넣어. </li><li> 약 추가 초순수 비커에 (그 전기 전도도가 0.1 μS / cm이다 증류수) 10 ㎖. </li><li> 분석 중에 당류를 분해 할 수있는 효소를 비활성화하기 위해 20 초 동안 전자 레인지에서 초순수에 절단 베리 가열한다. </li><li> 비커에 약을 초순수 물 10ml를 추가합니다. </li><li> 표준 축과 발전기를 구비 한 균질기로 12,000 rpm에서 5 분간 혼합 균일화. </li><li> 3000 RPM (2000 × g에서)에서 10 분 동안 균질 혼합물을 원심 분리기. </li><li> 5B 종이 필터를 사용하여 원심 분리 된 샘플을 진공 여과에 의해 여과 액을 모은다. </li><li> 일에 두 번 단계 3.6-3.9를 반복즉 여과 잔사 모든 당 및 유기산을 수집하고, 여액 전부를 조합한다. </li><li> 여액의 pH를 측정하고, 묽은 염산 (0.1 몰 및 0.01 L-1) 7로 조정하고 수산화 나트륨 (0.1 내지 0.01 몰 L-1)의 수용액을 희석. </li><li> 초순수 50ml로 여과 액을 희석. </li><li> 두에 샘플을 나누어; 당 분석 및 유기산의 분석을위한 다른 하나. </li><li> 안료, 양이온과 음이온을 배제하기 위해 직렬로 접속 된 열을 통해 제 1 샘플 용액 (두 C18, CM 및 QMA)를 통과한다. 열에서 시료 용액의 제 1 ml에 버린다. 이어서 HPLC에 의한 당의 분석 컬럼에서 샘플 용액을 사용한다. </li><li> 안료 및 양이온을 제외 직렬 접속 열 (두 C18 및 CM)을 통해 제 2 샘플 용액을 전달한다. 열에서 시료 용액의 제 1 ml에 버린다. 다음 C에서 샘플 솔루션을 사용HPLC에 의한 유기산의 분석 olumns. </li><li> 원심 HPLC에 의한 분석 전에 소형 원심 분리기와 0.45 μm의 필터를 구비 한 마이크로 튜브에서 10 분 동안 6,600 RPM (5800 × g에서)에서의 각 단계에서 용액 3.14 및 3.15. </li></ol> 설탕 4. HPLC 측​​정 참고 : 본 연구에서, 수 크로스, 글루코스, 각 베리의 과당의 합계 함량이 총 당 함량으로 간주한다. 따라서, 세 당의 각 작업 곡선은 제 수득하고 각 베리의 당 합계 함유량이 얻어진다. 표준 내용은 0.3-0.4 중량 % (자당), 3.8-4.8 중량 % (포도당), 및 4.2-5.3 중량 % (과당)로보고됩니다. (9) <ol><li> 정확하게 자당 약 200 mg을 측정하고, 표준 용액을 제조 50ml의 초순수에 용해. 제 표준액을 조제 초순수 50ml로 용액 5 mL를 희석. 마찬가지로 세 번째 스탠드를 준비두 번째 표준 용액에서 ARD 솔루션입니다. </li><li> 유사하게, 포도당과 과당의 표준 용액을 준비합니다. </li><li> 다음과 같은 HPLC 시스템을 배열 : <ol><li> 40 ° C에서 열 오븐 겔 투과 컬럼을 사용한다. </li><li> 용출액을 0.1 ml / 분의 유량으로 탈기 된 초순수를 사용한다. </li><li> 굴절률 검출기를 사용합니다. </li></ol></li><li> 각 측정을위한 20 μL 나누어지는을 주입하여 표준 용액의 HPLC 스펙트로 그램을 측정합니다. 참고 : 여기에, PAC 솔루션은 측정을위한 소프트웨어로 사용됩니다. </li><li> 마우스 오른쪽 버튼으로 &#39;재 해석&#39;을 클릭하여 각 표준 용액의 크로마토 그램에 설탕의 밴드의 면적 강도를 가져옵니다. </li><li> 면적 강도와 농도의 관계를 나타내는 식을 구한다 fo를 선형 회귀 분석에 의해 각각의 설탕 작업 곡선을 얻기 위해 해당 농도 대 면적 강도를 플롯각 당 r에. </li><li> 각 측정을위한 20 μL 나누어지는을 주입하여 시료 용액의 HPLC의 스펙트로 그램을 측정합니다. </li><li> 이전 단계 4.5에 기재된 바와 같이, 각 샘플 용액의 크로마토 그램 당의 대역의 면적 강도를 얻을. </li><li> 단계 4.6에서 얻어진 작업 곡선에 해당하는 방정식을 사용하여 솔루션에서 설탕의 농도를 얻습니다. </li><li> 이전 단계 및 샘플 용액의 총 부피에서 얻어진 시료 용액의 농도로부터 각 베리 각 설탕의 양을 구하는 (단계 50 ㎖ 3.12 참조). </li><li> 세 설탕의 내용을 합산하여 각 과일의 총 설탕의 양을 얻습니다. </li><li> 단계 130에서 측정 된 무게를 이용하여 각 베리의 총 당 함량의 퍼센트를 얻었다. </li></ol> 유기산 5. HPLC 측​​정 참고 : 본 연구에서는, 시트르산, 퀴닌 산의 합계 함유량, 말산산 및 숙신산은 총 유기 산 함량으로 간주한다. 따라서, 네 유기산 각 작업 곡선은 제 수득하고 각 베리의 유기산 함유량을 측정한다. 표준 콘텐츠는 0.42-0.62 중량 % (구연산) 0-0.15 중량 % (닉산), 0.08-0.23 중량 % (말산) 및 0.06-0.25 중량 % (숙신산)로보고한다. (9) <ol><li> 정확하게 시트르산 5mg 정도를 측정하고, 표준 용액을 제조 50ml의 초순수로 용해. 제 표준액을 조제 초순수 50ml로 용액 5 mL를 희석. 마찬가지로 두 번째 표준 용액에서 세 번째 표준 용액을 준비합니다. </li><li> 마찬가지로, 퀴닌 산, 말산, 숙신산의 표준 용액을 준비한다. </li><li> 다음과 같은 HPLC 시스템을 배열 : <ol><li> 40 ° C의 열 오븐 내에서 직렬로 연결된 두 개의 음이온 교환 컬럼을 사용한다. </li><li> 사용 인산의 0.1 % 수용액을 탈기용출액을 0.02 ㎖ / 분의 유속으로 산. </li><li> 210 nm의 자외선 - 가시 광선 검출기 세트를 사용합니다. </li></ol></li><li> 각 측정을위한 표준 용액 20 μL 나누어지는을 주입하여 표준 용액의 HPLC 스펙트로 그램을 측정합니다. </li><li> 마우스 오른쪽 버튼으로 &#39;재 해석&#39;을 클릭하여 각 표준 용액의 크로마토 그램에 유기산의 밴드의 면적 강도를 가져옵니다. </li><li> 면적 강도와 농도의 관계를 나타내는 수학 식을 각각의 유기산에 대해 획득되는 선형 회귀 분석에 의해 각각의 유기산의 작업 곡선을 얻기 위해 해당 농도 대 면적 강도를 플롯. </li><li> 각 측정 용 샘플의 20 μL 분취를 주입하여 시료 용액의 HPLC의 스펙트로 그램을 측정한다. </li><li> 단계 5.5에서 상술 한 바와 같이, 각 샘플 용액의 크로마토 그램에 유기산의 밴드의 면적 강도를 얻을. </li><li> 단계 5.6에서 얻어진 작업 곡선에 대응하는 방정식을 이용하여 용액에 유기산의 농도를 얻었다. </li><li> 이전 단계 및 샘플 용액의 총 부피에서 얻어진 시료 용액의 농도로부터 각 베리 각 유기산의 양을 구하는 (단계 50 ㎖ 3.12 참조). </li><li> 네 유기산의 내용을 합산함으로써 각 베리 총 유기산의 양을 얻었다. </li><li> 단계 130에서 측정 된 무게를 이용하여 각 베리 총 유기산의 함량 백분율을 얻었다. </li></ol> 안토시아닌의 HPLC 측​​정 6. 전처리 <ol><li> 그들은 단지 스펙트럼 측정 후 분석하지 않는 경우 화학 물질에 대한 아래 -80 ° C 준비 냉동실에 블루 베리를 계속 분석. </li><li> 12 시간 동안 진공 동결 건조기 각 냉동 과일을 건조. </li><li> 1 % 메탄올 용액 오에있는 말린 블루 베리의 안토시아닌을 추출F 트리 플루오로 아세트산 [베리 (g)의 중량이 용액의 / 부피 (㎖) = 1/10] 12 시간 동안 4 ℃의 냉장고에 두어 혼합물. </li><li> 원심 분리기 C와 15,000 RPM (21,900 × g) ° 초 원심 분리기에서를 -8 사용하여 2 ml의 마이크로 튜브에 15 분의 추출물. </li><li> HPLC 측​​정을위한 샘플을 얻기 위하여 0.45 μm의 필터로 추출 필터. </li></ol> 안토시아닌 7. HPLC 측​​정 참고 : 약 13 종류의 안토시아닌은 블루 베리에 포함되어 있습니다. 그것은 모든 안토시아닌 위해 작동 곡선을 얻는 것이 곤란하기 때문에, 단지 시아 -3- O의 -glucoside 클로라이드 작업 곡선, 블루에서 가장 인기 안토시아닌 중 하나가 얻어진다. 작업 곡선은 다른 안토시아닌의 대략적인 정량화 적용됩니다. <ol><li> PR 정확하게 시아 -3- O의 -glucoside 클로라이드 1.5 mg을 측정하고, 트리 플루오로 아세트산, 1 % 메탄올 용액을 10mL로 용해표준 용액 epare. 제 표준 용액을 제조 트리 플루오로 아세트산, 1 % 메탄올 용액 10 ml의 용액 5 ㎖를 희석. 이와 유사하게, 세 번째와 네 번째의 표준 용액을 순차적으로 준비한다. </li><li> 다음과 같은 HPLC 시스템을 배열 : <ol><li> 40 ° C에서 열 오븐에서 C18 역상 컬럼을 사용합니다. </li><li> 0.1 ㎖ / 분의 유량과 아세토 니트릴 (용출 B)을 0.1 % 수성 트리 플루오로 아세트산 (용출 A) 및 0.5 % 트리 플루오로 아세트산 용출액을 이용한 구배 법 적용되는 경우 8 % 내지 15 %로 용출 B 증가 비율 0-50 분 주입 후에, 상기 주입 후 50 ~ 60 분 동안 75 %에서 15 % 중. </li><li> 520 nm에서 포토 다이오드 어레이 검출기 모니터링을 사용한다. </li></ol></li><li> 각 측정을위한 10 μL 나누어지는을 주입하여 표준 용액의 HPLC 스펙트로 그램을 측정합니다. &quot;LC 용액의&quot;측정 소프트웨어로서 사용된다. </li><li> 대역의 면적 강도를 얻을 수마우스 오른쪽 버튼으로 &#39;재 해석&#39;을 클릭하여 각 표준 용액의 크로마토 그램에 시아 니딘 -3- O의 -glucoside 염화. </li><li> 면적 강도와 농도의 관계를 나타내는 수학 식이 시아 -3- O의 -glucoside 클로라이드 수득 된 선형 회귀에 의해 시아 -3- O의 -glucoside 클로라이드 작업 곡선을 얻기 위해 해당 농도 대 면적 강도를 플롯. </li><li> 각 측정을위한 10 μL 나누어지는을 주입하여 시료 용액의 HPLC의 스펙트로 그램을 측정합니다. </li><li> 이전 단계 7.4에 기재된 바와 같이, 각 샘플 용액의 크로마토 그램의 각 안토시아닌 밴드의 면적 강도를 얻을. </li><li> 단계 7.5에서 얻어진 작업 곡선에 대응하는 방정식을 사용하여 용액의 안토시아닌의 농도를 구합니다. </li><li> 이전에 얻어진 농도에서 각 베리 각 안토시아닌의 양을 구하는단계 6.3 단계에 사용되는 시료 액의 총 부피. </li><li> 열세 안토시아닌의 내용을 합산하여 각 블루 베리의 안토시아닌의 총량을 얻습니다. </li><li> 단계 130에서 측정 된 무게를 이용하여 각 베리의 총 안토시아닌의 함량 백분율을 얻었다. </li></ol> 성분 내용의 예측에 대한 교정 모델 8. 건설 주 : PLS 회귀 잠상 변형하여 회귀 기법의 종류 4,5 관측 ​​된 스펙트럼 및 화학 분석에 의해 결정되는 성분 함량의 각 성분에 대한 보정 모델의 구성에 사용된다. PLS 회귀는 상용 프로그램 또는 집에​​서 만든 프로그램 중 하나를 수행합니다. 모델의 건설의 세부 프로세스에 대한 참조의 5, 10을 참조하십시오. <ol><li> 관찰 된 스펙트럼에 대한 전처리 정확한을위한 가장 효과적인 검사 및강력한 예측. <ol><li> 다음 전처리 중 하나 또는 두 개의 적용하여 보정 모델을 구축 : MSC (곱하기 분산 보정), 1,2,5 SNV (표준 정규 변량), 1,2,5 MMN (최소 - 최대 정상화를) COE (상수는 제거 오프셋 ), 제 1 또는 SG에 의해 제 2 미분 연산 (Savitzky-골 레이) 방법. 1,2,5 구성된 모델들은 스펙트럼에서 설정할 검증의 성분의 콘텐츠를 예측한다. 주 : 최소 및 최대 값은 각각 0과 1이되도록 MMN에서, 스펙트럼 정규화된다. 최소 값이 0이되도록 COE에서, 스펙트럼의 종축이 시프트된다. </li><li> 관찰과 관찰 된 스펙트럼이 가장 효과적인위한 전처리하는 검사 설정 유효성 검사의 값을 예측 사이에 결정, R 2, 및 잔여 예측 편차, RPD의 계수를 계산합니다. 더주는 전처리의 조합을 선택R 2 및 RPD. </li></ol></li><li> 유효 영역을 검색, 파수 영역은 예를 들어, 적용하여 정확하고 강력한 예측을위한 효율적인있는 이동 - 창 PLS 기술 (11)를 검사합니다. 참고 :이 절차는 스펙트럼 예측에 대한 효과적인 정보를 포함하거나 예측을 방해하는 정보를 포함 파수 영역을 제거에 해당합니다. </li></ol> 구축 된 교정 모델의 9 검증 참고 : 구성 모델의 검증의 세부 프로세스에 대한 참조를 5, 10을 참조하십시오. <ol><li> 전처리 및 예측에 유효한 파수 영역에 대한 최적의 조합으로 구성된 교정 모델과 함께 자신의 스펙트럼에서 설정 한 검증의 성분 내용을 예측한다. 5, 10을 </li><li> 관측 및 예측과 R 2 및 RPD를 계산검증 세트의 값. 5, 10 </li><li> 교정 모델의 실제 성능, 12, 13 R의 일반 기준 2&gt; 0.85 및 RPD&gt; 2.5, 만족 여부를 검사합니다. 기준을 만족하지 않는 경우 모델의 재구성을 고려하십시오. </li></ol>

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</ol>

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프로토콜에 대한 몇 가지 추가 의견은 여기에 설명되어 있습니다. 먼저, 단계 1.1, 대상에 포함 된 품종을 결정하는 언급된다. 이 많은 품종 또는 품종을 지정하지 않고 블루 베리를 포함하는 모델을 구축 할 수 있지만, 모델 예측 정확도는 때때로 단일 품종의 모델보다 제한된 품종 훨씬 낮다. 또한 캘리브레이션 모델은 상이한 생산 현장에서 수확 블루 베리, 예측 성능에 영향을 미치는 다른 특성을 갖기 때문에 높은 예측 성능을 얻기 위해 각각의 생산 현장에서 블루 베리 구성되어야한다는 것을 주목해야한다. (1) 둘째로, 단계 230에서, 스펙트럼 측정에 대한 확산 반사율 모드를 선택 언급된다. 송신 모드는 분광 광도계 측정에 제조된다. 투과 모드에서 측정 된 스펙트럼이지만보정 모델의 구성 가능한 LSO가 더 정확하고 더 강력한 모델은 대부분의 경우에 확산 반사율 모드로 측정 한 스펙트럼으로 구성 될 수있다. 총 유기산 내용이 투과 모드에서 측정 한 스펙트럼을 ...

근적외선 (NIR) 분광 널리 다양한 종류의 과일의 내용과 야채를 분석하는 비파괴 기법으로 적용됩니다. 1, 2 비파괴은 보장 품질 만 맛있는 과일과 채소의 운송을 가능하게 NIR 분광법으로 분석한다. NIR 분광법 등 이미 오렌지, 사과, 멜론, 체리, 키위, 망고, 파파야, 복숭아에 적용된 등 총 당 함량에 대응하는 자신의 당도, 산도, TSC (총 고체 함량)를 알아야하고, . 최근에는. 베리의 품질 평가 NIR 스펙트럼의 적용을보고 3 우리는 전체 당도 및 산도에 대응하는 총 유기 산 함량뿐만 아니라 총 안토시아닌 함량뿐만 아니라 측정 하였다. 안토시아닌은 인간의 건강을 개선하기 위해 생각하는 생리 활성 구성 요소입니다. 그들이 당도, 교류의 확신 맛있는 블루 베리를 구입할 수 있다면 그것은 소비자를위한 편리가 상한 및 안토시아닌 함량. 과일과 야채의 근적외선 흡수 스펙트럼에서, 단지 넓은 흡수 밴드가 관찰된다. 그들은 주로 섬유와 수분에 의한 밴드입니다. 인해 비 이것을 파괴 대상의 여러 성분 많은 약한 밴드가 동시에 관찰되지만, 관찰 된 밴드는 대부분의 경우, 대상의 특정 구성 요소의 특정 진동 모드에 할당 될 수 없다. 따라서, 램버트 - 비어의 법​​칙을 이용하여 특정 성분의 함량을 측정하는 기존의 기술은 NIR 스펙트럼은 유효하지 않다. 대신, 캘리브레이션 모델은 관찰 된 스펙트럼과 스펙트럼에 대응하는 성분 함량 사이의 상관 관계를 검토하여 chemometrics를 이용하여 구성하는 관찰 된 스펙트럼에서 대상 부품의 내용을 예측할. 4,5 여기서, 프로토콜 구성 및 모델을 확인하는 총당의 예측 총 유기산 함유량 acidi 대응타이 및 NIR 스펙트럼에서 블루 베리의 총 안토시아닌 함량이 표시됩니다. 그림 1은 안정적이고 강력한 보정 모델을 구축 할 수있는 일반적인 흐름도를 보여줍니다. 충분한 수의 샘플을 수집됩니다. 다른 구성은 모델의 검증을 위해 사용되는 동안 그들의 일부는 모델의 구성에 사용된다. 수집 된 각각의 시료를 들어, NIR 스펙트럼을 측정하고, 다음 피 처리 성분이 파괴 전통적인 화학 분석법으로 정량한다. 여기서, 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC)는 당, 유기산 및 안토시아닌의 화학적 분석에 사용된다. 부분 최소 제곱은 (PLS) 회귀 분석 화학에 의해 결정되는 관찰 된 스펙트럼 성분과 함량 사이의 상관 관계가 조사 분석 캘리브레이션 모델의 구성에 사용된다. 강력한 최선의 예측 능력을 가진 모델, obser의 전처리를 구축하기 위해VED 스펙트럼 및 상기 예측에 이용되는 파장 영역은 또한 관찰된다. 마지막으로, 구성 모델들은 충분한 예측 능력을 확인하기 위해 확인됩니다. 검증에서, 내용이 화학 분석 (관측 값)에 따라 결정 내용을 비교 구성된 모델 (예측값)에 의해 관측 된 스펙트럼으로부터 예측. 충분한 상관 관계가 관찰 예측 값 사이에서 찾을 수 없으면, 충분한 상관이 얻어 질 때까지 상기 보정 모델을 재 구축한다. 이 도면 (외부 검증)에 나타낸 바와 같이이 모델의 구축 및 검증을위한 샘플들의 서로 다른 그룹을 사용하는 것이 바람직하지만, 동일한 그룹의 샘플 구성 및 검증 (교차 검증) 모두를 사용하는 경우의 수 샘플은 충분하지 않다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53981/53981fig1.jpg" /> 에프교정 모델의 건설 및 검증을위한 igure 1. 플로우 차트. 파란색과 녹색 선으로 둘러싸인 절차는 교정 모델과 그 검증의 건설에 각각 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53981/53981fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>FT-NIR 분광 광도계</td><td>Bruker Optics GmbH</td><td>MPA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>고성능 액체 크로마토 그래</td>피 <td>Shimadzu Corporation</td><td>228-45041-91, 228-45000-31, 228-45018-31</td><td>설탕 분석</td></tr><tr><td></td><td></td><td>용 223-04500-31, 228-45010-31, 228-45095-31</td><td>굴절률 검출기</td></tr><tr><td>고성능 액체 크로마토 그래</td>피 <td>Shimadzu Corporation</td><td>228-45041-91, 228-45003-31, 228-45000-31</td><td>유기산 분석 용</td></tr><tr><td></td><td></td><td>228-45018-31, 228-45010-31, 223-04500-31</td><td>자외선 검출기</td></tr><tr><td>고성능 액체 크로마토그래</td>피 <td>Shimadzu Corporation</td><td>228-45041-91, 228-45018-31, 228-45000-31</td><td>안토시아닌 분석</td></tr><tr><td></td><td></td>용 <td>228-45012-31, 228-45119-31, 228-45005-31</td><td>포토다이오드 어레이 검출기</td></tr><tr><td></td><td></td><td>228-45009-31</td><td></td></tr><tr><td>pH 미터</td><td>Mettler-Toledo</td><td>30019028</td><td>S220, 자동 온도 보상</td></tr><tr><td>초순수 처리 장비</td><td>ORGANO Corporation</td><td>ORG-ULXXXM1; PRA-0015-0V0</td><td>퓨어랩 울트라; PURELITE</td></tr><tr><td>바이오메디컬 프리저&nbsp;</td><td>SANYO</td><td>2-6780-01</td><td>MDF-U338</td></tr><tr><td>초저온 냉동고</td><td>Panasonic healthcare Co., Ltd.</td><td>KM-DU73Y1-80</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>진공 동결 건조기</td><td>IWAKI 유리 Co., 주식 회사</td><td>119770</td><td>DRC-3L; FRD-82M</td></tr><tr><td>호모기나이저</td><td>마이크로텍 주식회사&nbsp;</td><td>Physcotron</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Hitachi Koki Co.,Ltd</td><td>S204567</td><td></td></tr><tr><td>CF15RXII 미니 원심분리기</td><td>LMS CO.,LTD.</td><td>KN3136572</td><td>MCF-2360</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Kokusan Co., Ltd</td><td>2-5534-01</td><td>H-103N</td></tr><tr><td>여과지&nbsp;</td><td>Advantec</td><td></td><td>1521070 5B, Whatman 40</td></tr><tr><td>Sep-Pak C18 컬럼</td><td>Waters Corporation Milford</td><td>WAT020515</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak CM 컬럼</td><td>Waters Corporation Milford</td><td>WAT020550</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak QMA 컬럼</td><td>Waters Corporation Milford</td><td>WAT020545</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal Filter Unit</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>R2SA18503</td><td>PVDF, 0.45 &뮤; m</td></tr><tr><td>Microtube</td><td>As One Corporation</td><td>1-1600-02</td><td>PP, 2ml</td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>GE Healthcare CO.,LTD.</td><td>6788-1304</td><td>쪽, 0.45 &mu; m</td></tr><tr><td>설탕</td><td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>194-00011</td><td>시약 등급</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>049-31165</td><td>시약 등급</td></tr><tr><td>과당</td><td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>123-02762</td><td>시약 등급</td></tr><tr><td>구연산</td><td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>036-05522</td><td>시약 등급</td></tr><tr><td>사과산</td><td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>355-17971</td><td>시약 등급</td></tr><tr><td>숙신산&nbsp;</td><td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>190-04332</td><td>시약 등급</td></tr><tr><td>퀸산</td><td>Alfa Aesar, A Johnson Matthey Company</td><td>10176328</td><td>시약 등급</td></tr><tr><td>인산</td><td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>162-20492</td><td>HPLC 등급</td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>208-02746</td><td>시약 등급</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Wako Pure Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>131-01826</td><td>시약 등급</td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>015-08633</td><td>HPLC 등급</td></tr><tr><td>시아니딘-3-O-글루코시드 클로라이드</td><td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>306-37661</td><td>분석용 HPLC 등급</td></tr><tr><td>소프트웨어</td><td>Bruker Optics GmbH</td><td>OPUS ver. 6.5</td><td></td></tr><tr><td>Softoware 전처리</td><td></td><td>: Visual Basic으로 구동되는 Microsoft Excel</td>, 모델 구축을위한 응용 프로그램 <td></td></tr><tr><td>소프트웨어 Freemat 4.0</td><td>http://freemat.sourceforge.net/</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hplc 측​​정을 바탕으로 근적외선 분광법에 의한 블루 베리의 성분 내용의 비파괴 예측을위한 모델의 건설

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

농산물의 성분 함량에 대한 비파괴 예측은 품질이 보장된 제품을 선적하고 판매하는 데 유용합니다. 여기서 근적외선 분광법은 각 블루베리의 총 당, 총 유기산 및 총 안토시아닌 함량을 비파괴적으로 예측하는 데 사용됩니다. 이 기술은 수확 된 모든 블루베리 중에서 맛있는 블루 베리 만을 선택할 수 있을 것으로 기대됩니다. 블루베리의 근적외선 흡수 스펙트럼은 꽃받침이 아닌 위치에서 확산 반사 모드로 측정됩니다. 고성능 액체 크로마토그래피로 측정된 블루베리의 성분 함량은 관찰된 스펙트럼에서 성분 함량을 예측하는 모델을 구성하는 데 사용됩니다. 부분 최소 제곱 회귀 분석은 모델 구성에 사용됩니다. 관찰된 스펙트럼에 대한 전처리와 분석에 사용되는 스펙트럼의 파장 영역을 적절하게 선택해야 합니다. 구성된 모델에는 성분 함량이 실제 정확도로 예측되는지 확인하기 위해 검증이 필요합니다. 여기에서는 근적외선 분광법으로 블루베리의 성분 함량을 비파괴적으로 예측하기 위한 모델을 구성하고 검증하는 프로토콜을 제시합니다.

예를 들어, 블루 베리 (70)의 스펙트럼을 동시에 나타낸다 베리의 근적외선 흡수 스펙트럼의 집합이 보여 도표. 당분, 유기산, 또는 안토시아닌에 확실히 할당 대역은 NIR 스펙트럼에서 관찰되지 않기 때문에, 기존의 램버트 - 비어의 법​​칙은 성분 함량을 정량화하기 위해 적용 할 수 없습니다. 따라서, 내용물의 성분 예측 모델의 구축이 필요하다. 그림 3은 블루 베리에 설탕의 정량 분석에 대한 전형적인 크로마토 그램을 보여줍니다. 위쪽에서 세 개의 패널은 각각 슈 크로스, 글루코스 및 프럭 토스의 표준 용액의 크로마토 그램이다. 바닥 판은 베리 추출물, 즉 시료 용액의 크로마토 그램을 나타낸다. 시료 용액 중의 당류의 종류 및 농도는 체류 시간에서 공지...

우리는 근적외선 분광법으로 개별 블루베리의 총 당, 총 유기산 및 총 안토시아닌 함량을 비파괴적으로 예측하기 위한 모델을 구성하고 검증하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

HPLC 측​​정을 바탕으로 근적외선 분광법에 의한 블루 베리의 성분 내용의 비파괴 예측을위한 모델의 건설

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

이 절차의 전반적인 목표는 근적외선 분광법을 이용하여 개별 블루베리의 총 당 함량, 총 유기산 함량 및 총 안토시아닌 함량을 비파괴적으로 예측하는 모델을 구축하고 검증하는 것입니다. 이 방법은 과일 및 채소와 같은 농산물 평가 분야의 주요 문제들을 해결할 것입니다. 본 기술의 장점은 많은 제품을 분광법을 통해 비파괴적으로 확인할 수 있다는 점입니다.그리고 본 절차를 통해 구축된 모델입니다. 근적외선 분광법은 농산물의 비파괴 평가를 위한 강력한 도구입니다. 예측 모델은 스펙트럼과 각 대상의 화학적 분석으로 결정된 함량 사이의 상관관계를 조사하여 구축됩니다.시연은 본 연구실 졸업생인 Yusuke Kimura와 본 프로토콜의 저자 중 한 명인 대학 소속의 Jingai Che가 진행하겠습니다. 대상 품종에서 충분한 수와 다양한 유형의 블루베리 샘플을 수집하십시오. 검정 모델 구축을 위해 가급적 100개의 블루베리를 수집하는 것이 좋습니다.그리고 구축된 모델의 검증을 위해 최소 10개를 준비합니다. 강건한 모델을 구축하려면 다양한 색상, 크기 및 다양한 숙성 조건과 같이 다양한 유형의 샘플을 수집하십시오. 각 블루베리의 무게를 측정합니다.측정한 무게는 이후 각 블루베리 성분의 함량 백분율을 계산하는 데 사용됩니다. 다음으로, 확산 반사 측정을 위해 블루베리 시료를 근적외선 분광광도계의 윈도우 중앙에 놓습니다. 시료 단일 채널 명령을 사용하여 각 블루베리의 스펙트럼을 측정합니다.가급적 과일의 여러 지점에서 측정하십시오. 스펙트럼 측정 직후에 분석하지 않을 경우, 블루베리를 영하 30 °C 이하의 냉동고에 보관하십시오. 전처리를 시작하려면, 블루베리를 쉽게 균질화할 수 있도록 여러 조각으로 자르십시오.냉동 상태의 블루베리를 해동하지 않고 절단합니다. 절단된 조각들을 50 milliliter 비커에 넣습니다. 비커에 약 10 milliliters의 초순수를 추가합니다.분석 중에 당을 분해할 수 있는 효소를 불활성화하기 위해, 자른 블루베리를 초순수로 채운 용기에 넣고 전자레인지에서 20초 동안 가열합니다. 비커에 초순수를 약 10 mL 추가합니다. 표준 샤프트와 제너레이터가 장착된 균질기로 12,000 RPM에서 5분 동안 혼합물을 균질화합니다.균질화된 혼합물을 3,000 RPM에서 10분 동안 원심 분리합니다. 다음으로, 5B 여과지를 사용하여 원심 분리된 샘플을 진공 여과하여 여과액을 수집합니다. 균질화 단계를 두 번 반복한 후, 여과액의 pH를 측정하고 묽은 염산과 묽은 수산화나트륨 수용액을 사용하여 pH 7로 조정합니다.여과액을 초순수로 50 milliliters까지 희석합니다. 시료를 두 부분으로 나눕니다. 하나는 당 분석용으로, 다른 하나는 유기산 분석용으로 사용합니다.첫 번째 시료 용액을 직렬로 연결된 컬럼들에 통과시켜 색소, 양이온 및 음이온을 제거합니다. 컬럼에서 나오는 시료 용액의 처음 1 mL는 버립니다. 그 후, 컬럼에서 얻은 시료 용액을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC로 당 분석을 수행합니다.HPLC 분석 전, 0.445 micron 필터가 장착된 마이크로튜브에 용액을 넣고 미니 원심분리기를 사용하여 6,600 RPM에서 10분 동안 원심분리합니다. 컬럼 오븐 내의 40 °C에서 겔 투과 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 HPLC 시스템을 구성합니다. 탈기된 초순수를 유속 0.1 mL/min으로 용리액으로 사용합니다.굴절률 검출기도 함께 사용하십시오. 각 측정마다 20 µL의 분취량을 주입하여 표준 용액의 HPLC 스펙트로그램을 측정합니다. 본 과정에서는 측정에 packed solution 소프트웨어가 사용됩니다.마우스 오른쪽 버튼으로 재분석(re-analysis)을 클릭하여 각 표준 용액의 크로마토그램에서 당 밴드의 면적 강도를 구합니다. 그런 다음, 각 당의 표준 곡선을 얻기 위해 면적 강도를 해당 농도에 대해 선형 회귀 분석합니다. 이 곡선을 통해 각 당의 면적 강도와 농도 사이의 관계를 나타내는 식을 얻을 수 있습니다.표준 곡선을 얻은 후, 각 측정마다 20 µL의 분취량을 주입하여 시료 용액의 HPLC 스펙트로그램을 측정합니다. 이전과 동일하게 각 시료 용액의 크로마토그램에서 당 밴드의 면적 강도를 구합니다. 유기산의 HPLC 측정 수행 단계에 대해서는 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.스펙트럼 측정 직후에 안토시아닌 분석을 수행하지 않을 경우, 블루베리를 -80°C 이하의 냉동고에 보관하십시오. 안토시아닌의 HPLC 측정을 위한 전처리를 수행하려면, 냉동된 각 과일을 진공 동결건조기로 12시간 동안 건조하십시오. 건조된 블루베리에서 안토시아닌을 추출하기 위해, 1% trifluruocetic acid 메탄올 용액에 혼합물을 넣고 4°C 냉장고에서 12시간 동안 두십시오.초원심분리기를 사용하여 -8°C, 15,000 RPM 조건에서 2mL 마이크로튜브에 담긴 추출물을 15분 동안 원심분리합니다. 그 다음, 0.45 µm 필터로 추출물을 여과하여 HPLC 측정용 시료를 준비합니다. 40°C의 컬럼 오븐 내에 C18 역상 컬럼을 장착하여 HPLC 시스템을 구성합니다.0.1% 수성 trifluroacetic acid를 LUNA로, 아세토니트릴 내의 0.5% trifluroacetic acid를 LUNB로 사용하여 기울기 용리법(gradient method)을 적용합니다. 유속은 0.1 milliliters per minute로 설정하며, 주입 후 0분에서 50분 동안 LUNB의 비율이 8%에서 15%로 증가하도록 합니다.주입 후 50분에서 60분 동안 15%에서 75%까지 변화시킵니다. 520 nanometers에서 모니터링하는 포토다이오드 어레이 검출기를 사용하십시오. 각 측정 시 자동 시료 주입기를 통해 10 microliter 분취량을 주입하여 표준 용액의 HPLC 스펙트로그램을 측정하십시오.측정을 위해 LC 솔루션 소프트웨어를 사용하십시오. 마지막으로, 각 측정마다 오토샘플러를 통해 10 µL의 분취액을 주입하여 시료 용액의 HPLC 스펙트로그램을 측정합니다. 이 단계에서 성분 함량 예측을 위한 검량 모델의 구축과 구축된 모델의 검증을 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 수행합니다.관측된 스펙트럼과 본 절차를 통해 결정된 성분 함량을 사용하여 예측 모델을 구축합니다. 총 당 함량 예측을 위해 구축된 모델의 교차 검증 결과 예시가 여기에 제시되어 있습니다. 근적외선 분광법으로 예측된 값과 HPLC로 결정된 값 사이의 상관관계는 만족스러운 수준입니다.총 안토시아닌 함량에 대한 모델의 교차 검증에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다. 이 경우에도 예측 값과 관찰 값 사이의 상관관계는 만족스러운 수준입니다. 이 영상을 시청하신 후에는 HPLC를 이용해 블루베리의 함량 이전 값들을 구하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.파괴적 화학 분석으로 측정된 사전 설정 콘텐츠를 기반으로 적절하게 구축된 모델을 사용해야만 서로 다른 평가가 가능합니다. 이는 고성능 예측 모델을 구축하기 위해 대상에 대한 이전의 화학 분석이 필수적임을 의미합니다. 이 영상에 나타나지 않은 예측 모델 구축 절차에 대해서는 텍스트 프로토콜을 참조하시기 바랍니다.적절하게 구축된 예측 모델은 블루베리의 당분, 유기산 및 기타 함량 예측에 적용 가능합니다. 여기서 보여준 것과 같이, 근적외선 분광법은 다양한 종류의 농산물 상관관계 분석에 적용될 수 있을 것으로 기대됩니다. 근적외선 분광법을 농산물 평가에 적용할 때, 우수한 모델을 구축하기 위해서는 화학적 분석을 통해 함량의 사전 기준치를 설정하는 것이 필수적임을 유념하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

식물의 휘발성 물질을 수집을위한 푸시풀 방식이 설명되어 있습니다. 방법은 herbivore 먹이, 외인성 메틸 jasmonate, 기계적 손상에 의해 유발되는 휘발성 물질의 비교를 허용합니다. 이 기술은 또한 블루베리 식물 이내 herbivore - 손상된 지점에서 휘발성 물질에 노출 피해가 가지의 휘발성 반응을 조사하는 데 사용됩니다.

Herbivore 유도 블루베리 휘발성 물질과 내부 식물 신호

열매의 휘발성 화합물 분석을위한 신속한 방법을 설명합니다. 샘플의 homogenate의 헤드 스페이스에 존재하는 휘발성 화합물은 급속하게 분리되어 표면 탄성파 (SAW) 센서와 결합 초고속 가스 크로마 토그래피 (GC)로 검색됩니다. 데이터 처리 및 분석을위한 절차도 논의하고 있습니다.

전자 코를 사용하여 과일 휘발성 분석

Proton Transfer Reaction Time of Flight 질량 분석기를 사용하면 휘발성 유기 화합물의 고감도, 신속 및 비침습적 분석을 수행할 수 있습니다. 그 잠재력을 입증하기 위해 요구르트의 젖산 발효(온라인 바이오프로세스 모니터링), 다양한 사과 유전자형(대규모 스크리닝) 및 커피 마신 후 후비강 공간(노즈스페이스 분석)의 세 가지 예를 제공합니다.

자동 샘플링 시스템과 결합 된 PTR-ToF-MS 및 식품 연구를위한 맞춤형 데이터 분석 : 바이오 프로세스 모니터링, 스크리닝 및 코 공간 분석

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HPLC 측​​정을 바탕으로 근적외선 분광법에 의한 블루 베리의 성분 내용의 비파괴 예측을위한 모델의 건설

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