마우스 관상 내피 세포의 분리
July 3rd, 2016
이 프로토콜은 이미징 또는 분자 생물학 실험을 수행하기 위해 마우스 관상 동맥 내피 세포를 분리하는 방법을 공유하기 위해 준비되었습니다.
이 실험의 전반적인 목표는 고도로 정제된 고품질 마우스 관상동맥 내피 세포를 대량으로 얻는 것입니다. 이 방법은 심혈관 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 양질의 내피 세포를 높은 수율로 얻을 수 있다는 것입니다.
이 절차를 시연하는 것은 연구 전문가인 Shizhen Luo와 수석 연구원인 Dr.Ayako Makino입니다. 시술 최대 1주일 전까지 샘플당 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브 1개에 1ml의 CD31 버퍼를 추가합니다. 다음으로, sheep antirad IGG 비드를 부드러운 피펫팅과 혼합하고 각 튜브에 적절한 양의 비드를 추가합니다.
모든 구슬을 추가한 후 튜브를 30회 세게 흔들고 자석판에 올려 1분 동안 흔듭니다. 그런 다음 튜브를 플레이트에 부착한 상태에서 버퍼를 버리고 각 튜브에 1ml의 새 CD31 버퍼를 추가합니다. 2마이크로리터의 rad anti-mouse CD31 항체를 추가하고 튜브를 섭씨 4도의 회전기에 하룻밤 동안 놓습니다.
다음날, 튜브를 층류 후드 아래로 옮기고 1분 동안 흔들면서 자성판에 다시 놓습니다. 그런 다음 상층액을 1ml의 새 CD31 완충액으로 교체하고 손으로 튜브를 30회 세게 흔듭니다. 세 번째 세척 후 튜브를 섭씨 4도의 회전기로 되돌립니다.
시술 당일에는 혈액 응고를 방지하기 위해 실험 동물에게 0.1ml의 헤파린을 복강내 주사하는 것으로 시작합니다. 10 분 후, 0.01 밀리리터의 펜토바르비탈 주사로 마우스를 마취시킵니다. 그런 다음 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없는지 확인합니다.
심장과 폐 조직을 함께 제거한 후 크렙스 완충액의 비커에 넣고 부드럽게 흔들어 조직을 헹굽니다. 그런 다음 신선한 크렙이 들어 있는 6cm 접시에 조직을 옮기고 가위와 앞두를 사용하여 폐엽을 제거합니다. 이제 20게이지 카테터를 대동맥에 삽입하고 헤파린이 보충된 HBSS로 관상순환계를 씻어냅니다.
혈액이 모두 제거되면 심실을 작게 절개하고 심장을 부드럽게 흔들어 헹구고 심장 조직을 얼음 위의 샘플 튜브에 넣습니다. 관상 동맥 내피 세포를 방출하기 위해 조직을 소화 한 후, 5 밀리리터의 세척 완충액으로 세포를 두 번 펠릿하고 씻습니다. 그런 다음 미리 준비된 비드 튜브를 마그네틱 플레이트에 놓고 튜브를 세 번 흔들어 비드가 고르게 분포되도록 합니다.
두 번째 세척 후에는 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상층액을 제거하고 세포를 격렬하게 튕기는 것과 연관시킵니다. 다음으로, 부드러운 혼합으로 1ml의 세척 버퍼에 세포를 재현탁시키고 비드에서 CD31 버퍼를 버립니다. 세포와 구슬을 결합하고 튜브를 30회 튕깁니다.
그런 다음 세포와 비드 용액을 섭씨 4도의 회전자에 30분 동안 놓습니다. 세포가 배양하는 동안 샘플당 하나의 도금 챔버 표면을 젤라틴 용액으로 잘 코팅하고 챔버를 섭씨 37도에서 30분 동안 놓습니다. 젤라틴이 응고되면 과도한 젤 용액을 제거하고 챔버 웰 표면을 건조시킵니다.
그런 다음 bead conjugated cells를 후드 아래의 마그네틱 플레이트로 2분 동안 흔들어 놓고 세척 버퍼를 버립니다. 1ml의 새 세척 버퍼를 세포에 추가하고 플레이트에서 튜브를 제거하여 30회 격렬하게 흔든 다음 30회 튕깁니다. 튜브를 플레이트에 다시 넣고 1분 더 흔듭니다.
마지막 교반 후 튜브를 자성판에 다시 넣어 마지막 1분 동안 흔들고 세척 버퍼를 20% 철 강화 송아지 혈청이 보충된 섭씨 37도 내피 세포 배지 1ml로 교체합니다. 튜브를 마지막으로 30번 흔들고 튕깁니다. 그런 다음 500마이크로리터로 설정된 1밀리리터 피펫터를 사용하여 접합 세포를 10회 교반하고 관상동맥 내피 세포의 500마이크로리터 분취량을 각 도금 챔버 웰로 옮겨 섭씨 37도에서 하룻밤 배양합니다.
다음날, 10%의 FBS가 보충된 내피 세포 배지에서 세포를 세척합니다. 이 방법으로 분리된 관상동맥 내피 세포의 순도는 내피 세포 표면 마커, BS 렉틴 및 AC LDL에 대한 면역조직화학적 염색으로 확인할 수 있으며, 세포의 90% 이상이 일반적인 마우스 관상 동맥 내피 세포 배양에서 두 마커의 이중 양성 발현을 보여줍니다. 이 절차에 따라 다양한 혈액, 면역 수용 및 형광 이미징을 수행하여 다양한 질병 상태에서 어떤 단백질이 변형될 수 있는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.
개발 후 이 기술은 연구자들이 관상 동맥 내피 세포 분야로 연구를 확장하는 데 필요한 도구를 제공합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 많은 양과 품질의 마우스 관상 동맥 내피 세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에는 몇 가지 핵심 사항이 있습니다.
가장 중요한 것은 격리 기간 동안 무균 환경을 유지하는 것입니다. 두 번째는 모세혈관망의 혈액 응고를 피하기 위해 가능한 한 빨리 혈액을 완전히 씻어내는 것입니다. 세 번째는 모든 완충액, 특히 CD31 완충액의 pH를 측정하는 것입니다.
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개요
이 프로토콜은 영상 및 분자 생물학 실험에 활용할 수 있는 마우스 관상동맥 내피 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 많은 양의 순수한 내피 세포를 얻는 것을 목표로 하며, 심혈관 연구를 지원합니다.
주요 연구 구성요소
과학 분야
- 심혈관 연구
- 세포 생물학
- 내피 세포 분리
배경
- 내피 세포는 심혈관 건강에 중요한 역할을 합니다.
- 이러한 세포를 분리하는 것은 다양한 실험 응용을 위해 필수적입니다.
- 고품질 내피 세포는 심혈관 질환에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
- 이 방법은 분리된 세포의 수율과 순도를 향상시킵니다.
연구 목적
- 마우스 관상동맥 내피 세포를 분리하는 신뢰할 수 있는 프로토콜을 개발합니다.
- 고품질 세포를 사용한 영상 및 분자 실험을 용이하게 합니다.
- 심혈관 메커니즘을 이해하는 연구를 지원합니다.
사용된 방법
- 세포 분리를 위한 CD31 버퍼 준비.
- 세포 정제를 위한 양의 antirad IGG 비드 사용.
- 샘플을 섞고 준비하기 위한 부드러운 피펫팅.
- 훈련받은 전문가에 의한 절차 시연.
주요 결과
- 고수율의 순수한 내피 세포 분리 성공.
- 해당 분야의 전문가에 의한 프로토콜 시연.
- 심혈관 연구에서의 잠재적 응용 강조.
- 세포 분리 효과에 대한 방법 검증.
결론
- 이 프로토콜은 내피 세포를 분리하는 강력한 방법을 제공합니다.
- 고품질 세포는 심혈관 연구를 발전시키는 데 필수적입니다.
- 이 기술은 심혈관 질환에 대한 더 나은 이해와 치료로 이어질 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
High-purity isolation of mouse coronary endothelial cells enables robust investigation of vascular biology and disease mechanisms in preclinical cardiovascular research. This capability supports early discovery, target validation, and mechanistic de-risking for therapeutic programs focused on endothelial dysfunction. Reliable access to well-characterized primary cells enhances predictive confidence and translational continuity across the R&D pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of endothelial cell function and pathway analysis in disease-relevant systems.
- Supports biological de-risking and functional target validation for cardiovascular indications.
- Facilitates predictive confidence in early-stage hypothesis testing and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized source of primary endothelial cells for downstream imaging and molecular assays.
- Ensures reproducibility and quantitative output through high-purity cell preparations.
- Enables reliable evaluation of compound effects on endothelial biology in screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker studies in cardiovascular research.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic studies in primary cells.
- Reduces biological risk in advancing candidates targeting endothelial dysfunction.
Pipeline & Workflow Integration
This isolation protocol positions primary coronary endothelial cells as a foundational resource from early discovery through preclinical research in cardiovascular drug development.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and mechanistic studies in authentic vascular cell systems.
- Screening: Delivers assay-ready, high-purity cells for reproducible compound evaluation.
- Analytics: Supports quantitative measurement of endothelial markers and functional outputs.
- Translational Research: Provides a bridge to in vivo validation and biomarker alignment in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse cardiovascular research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vascular biology studies.
- Operational Value: Standardizes cell isolation for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiovascular programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in sterile dissection and cell isolation procedures.
- Needs access to magnetic bead separation and immunostaining infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for buffer preparation and cell handling.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or disease models.
- Maintaining sterility and buffer pH is critical for cell viability and purity.
