여러 색상과 고속에서 구조화 조명 TIRF 현미경에 가이드

이 프로토콜의 전반적인 목표는 TIRF 및 여러 색상의 광학 절편 모드에서 작동할 수 있는 고속 라이브 셀 초고해상도 이미징에 적합한 구조화 조명 현미경을 구성하고 정렬하는 것입니다. 이 방법은 현재 표준 회절 제한 TIRF 현미경을 사용하여 답변할 수 없는 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 초고해상도 현미경 기술에 비해 빠른 시간 해상도로 살아있는 세포의 동적 프로세스를 이미징하는 데 적합합니다.

이 프로토콜은 TIRF-SIM 현미경의 구성 단계를 설명하지만, 3D-SIM, 다초점 SIM 및 비선형 SIM과 같은 이미징 방식을 구현하기 위해 설정이 유연하고 쉽게 수정됩니다. 구조화 조명 현미경의 여기 경로를 정렬하고 정렬하려면 먼저 여기에 표시된 대로 광학 테이블에서 구성 요소의 위치를 표시하십시오. 첫 번째 이색성 미러 DM4를 현미경 프레임의 필터 큐브 터렛에 삽입한 후, 두 번째 이색성 미러 DM3를 1인치 정사각형 키네마틱 미러 마운트에 삽입하고 집광 렌즈 L5에서 한 초점 거리 떨어진 곳에 배치합니다. 다음으로, 시스템에 대한 광학 접근을 정확하게 정의하려면 터릿에서 대물 렌즈 OB를 제거하고 대신 정렬 도구를 나사로 조입니다.

그런 다음 이색성 미러 DM3와 SLM의 대략적인 최종 위치에 위치한 임시 정렬 미러를 사용하여 레이저 1의 시준 참조 빔을 두 정렬 디스크의 구멍 중심을 통해 조종합니다. 여기에 묘사된 것처럼 3개의 미러와 다이크로익 미러 DM2를 사용하여 레이저 1의 빔을 임시 미러로 향하게 합니다. 거친 광축이 결정되면 정렬 도구를 제거합니다.

그런 다음 조리개가 현미경 본체에 들어가기 전에 빔 경로에 조리개를 삽입하고 빔의 중앙에 놓습니다. 홍채 중앙에 작은 구멍이 있는 흰색 카드를 부착한 다음 대물 렌즈를 다시 삽입합니다. 다음으로, 미러 DM3에 대한 반복적인 각도 조정을 수행하고 SLM 위치에서 들어오는 빔이 있는 카드의 후면 반사를 중앙에 배치합니다.

그런 다음 대물 렌즈를 임시로 제거하고 천장에 레이저 스폿을 표시하여 기준 위치를 만듭니다. 튜브 렌즈 L5를 대물렌즈에서 대략 한 초점 거리 떨어진 곳에 삽입하고 선형 평행 이동에 장착합니다.tage 기준 빔의 방향을 따라 이동하도록 설정합니다. 대물렌즈를 떠나는 빔이 시준되어 천장의 참조 지점에 닿도록 튜브 렌즈 위치와 각도를 조정합니다.

조리개와 흰색 카드로 후면 반사를 다시 확인하여 렌즈가 빔에 수직인지 확인하십시오. 그런 다음 대물 렌즈를 제거하고 이미지 릴레이 망원경 L4의 두 번째 렌즈를 삽입합니다. linear translation stage를 사용하여 이 렌즈의 위치와 각도를 조정하여 시준을 유지하고 reference beam이 천장의 표시된 지점에 계속 닿도록 합니다. 대물 렌즈를 교체하고 망원경의 첫 번째 렌즈 L3을 삽입합니다. 앞에서 설명한 대로 시준과 편향이 없도록 이 렌즈의 위치와 각도를 조정하십시오.

텍스트 프로토콜에 따라 SLM 칩을 장착한 후 렌즈를 정렬한 상태에서 미러 대신 SLM을 삽입합니다. 참조 빔이 SLM 칩의 중앙에 위치하도록 SLM의 위치를 조정하고 빔이 두 개의 릴레이 렌즈를 통과하도록 각도를 조정합니다. 그런 다음 참조 빔이 여전히 표시된 지점의 중앙에 있는지 확인합니다.

입사 편광에 대해 45도에서 빠른 축을 가진 액정 가변 지연제(LCVR)를 장착합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 편광 회전기의 정렬을 완료한 후 접안렌즈를 통해 투과된 빛을 사용하여 십자선에 초점을 맞추고 이 위치에 대물 렌즈를 고정합니다. 그런 다음 100 나노 미터의 다색 구슬 한 방울을 1.5 개의 커버 유리에 펴서 형광 구슬의 단층을 준비합니다.

물에 다시 담그기 전에 비드를 유리에 흡착시키기 위해 비드를 건조시키십시오. 이멀젼 오일을 사용하여 비드 s를 놓습니다.amp대물렌즈에. 형광 비드 층에 초점이 맞도록 카메라의 위치를 미세하게 조정합니다.

SIM 바이너리 격자 패턴을 비트맵 파일로 생성하고 텍스트 프로토콜에 따라 SLM에 업로드한 후 SLM 제어 소프트웨어를 로드하고 연결을 클릭합니다. 레퍼토리" 탭에서 로드"를 클릭하여 레퍼토리 파일을 열고 파일에 포함된 실행 중인 주문 수를 확인합니다. 보드로 보내기"를 클릭하여 레퍼토리 파일을 SLM에 업로드합니다.

그런 다음 상태"탭을 선택하고 실행중인 주문 번호를 입력하십시오. 선택"을 클릭하여 실행 순서를 정렬 격자로 변경합니다. XY 스테이지에 장착된 공간 마스크 또는 SM을 L3의 초점 위치에서 빔 경로에 삽입하고 원하는 첫 번째 차수만 전달되도록 광축에 대한 위치를 변환합니다.

공간 필터 바로 뒤에는 두 개의 원형 빔만 표시됩니다. 카메라의 형광 비드 층 이미지를 확인합니다. 두 개의 원형 빔이 여기에 표시된 것처럼 겹치지 않으면 샘플 평면의 위치를 변경하여 대물 렌즈와 카메라 위치를 반복적으로 조정합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 초점을 미세 조정하고 샘플 평면을 설정한 후, 예를 들어 염료에 초점을 맞춰 10마이크로몰 로다민 6G 염료 용액을 이미징하여 TIRF 조명을 확인합니다. 두 빔이 올바른 TIRF 각도에서 입사하면 높은 배경 없이 단일 분자를 볼 수 있고 원형 조리개의 가장자리에 초점이 맞춰집니다. 빔의 위치에 대한 미세 조정은 이색성 미러 DM3를 조정하여 수행할 수 있습니다.

시스템을 동기화하고 보정하려면 비드 단층 샘플을 대물렌즈에 놓고 초점을 맞춥니다. SLM 제어 소프트웨어를 사용하여 첫 번째 패턴 배향에 대해 3개의 위상 편이 이미지 각각을 차례로 표시하도록 SLM을 프로그래밍할 수 있습니다. 그런 다음 예제 레퍼토리 중 네 번째 실행 순서로 전환합니다.

획득 소프트웨어에서 "고급 카메라 속성"을 선택하고 출력 트리거 종류 1"을 양수로, 출력 트리거 종류 2"를 음수로 설정하여 전역 노출 기간에 대해 카메라를 구성합니다. Scan Type(스캔 유형)의 Sequence(시퀀스) 창에서 Hard Disk Record(하드 디스크 레코드)를 선택하고 프레임 수를 3으로 설정합니다. 그런 다음 시작"을 클릭하여 세 개의 프레임을 획득합니다.

SLM 패턴은 노출될 때마다 변경됩니다. 텍스트 프로토콜에 따라 시스템을 보정한 후 SLM 제어 소프트웨어에서 SLM 실행 순서를 TIRF-SIM에 필요한 9개의 이진 격자 이미지의 전체 시리즈로 전환합니다. 이것은 예제 레퍼토리에서 순서 0을 실행하고 있습니다.

비드 샘플의 이미지 9개를 획득한 후 카메라 소프트웨어의 시퀀스 창에서 스캔 유형으로 Hard Disk Record"를 선택하고 프레임 수를 9로 변경합니다. 그런 다음 시작"을 클릭하여 이미지를 획득합니다. 마지막으로 버퍼링된 이미지 저장에서 이미지 유형으로 TIFF를 선택하고 확인을 클릭합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 초고해상도 이미지를 재구성합니다.

여기에 표시된 것은 표준 TIRF와 TIRF-SIM을 비교하기 위해 다색 100나노미터 직경의 형광 비드를 이미지화한 것입니다. TIRF-SIM은 분명히 TIRF에 비해 측면 해상도가 훨씬 더 높았습니다. 현미경의 예상 해상도는 488 및 640 나노미터 TIRF-SIM의 경우 각각 90나노미터 및 120나노미터입니다.

이는 이론적 회절 제한 사례와 비교하여 두 파장에 대한 측면 분해능이 2배 향상되었음을 나타냅니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 형광 표지된 아밀로이드 피브릴은 in vitro에서 형성되었으며 2배 해상도를 입증하기 위한 테스트 샘플로도 사용되었습니다. emGFP 표지 미세소관 또는 LifeAct-GFP와 같은 고대비의 세포 내 구조는 TIRF-SIM 이미징에 이상적이며 고대비, 초고해상도 이미지를 생성합니다.

시연된 설정을 사용한 TIRF-SIM 이미징을 통해 기저 세포 피질 부근에 위치한 미세소관의 하위 집단을 관찰할 수 있으며, 시간이 지남에 따라 미세소관 중합 및 해중합을 볼 수 있습니다. 불연속 구조가 없는 저대비 샘플은 원형질막의 가장자리를 제외하고는 고해상도 정보가 부족하므로 TIRF-SIM 이미징에 적합하지 않습니다. 마지막으로, 높은 변조 대비는 성공적인 SIM 이미징에 필수적입니다.

여기에서 볼 수 있듯이 복원된 이미지의 푸리에 변환을 통해 SIM 광학 전달 함수를 시각화할 수 있습니다. 이 기술을 완전히 익히면 필요한 모든 부품을 습득한 경우 약 일주일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 TIRF-SIM을 성공적으로 구현하기 위한 가장 중요한 문제를 알고 있어야 합니다.

첫째, 빔의 정확한 정렬이 필수적입니다. 이것은 대물 렌즈 조리개의 가장자리에 위치해야 하기 때문에 어려울 수 있습니다. 둘째, 빛의 편광 상태가 패턴과 함께 회전하는 것이 중요합니다.

이것이 없으면 샘플의 패턴 대비가 낮아지고 후속 이미지 구성이 불가능해집니다. 이 비디오를 시청한 후에는 SLM 기반 TIRF-SIM 현미경의 구성 및 정렬에서 가장 중요한 단계를 잘 이해하게 될 것입니다. 클래스 3B 레이저로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

레이저 출력은 TIRF 대물렌즈와 함께 정렬 프로세스를 수행하는 동안 눈에 안전한 수준으로 유지되어야 합니다.