3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비 생체

이 절차의 전반적인 목표는 3D 환경의 맥락에서 세포 이동 또는 기타 세포 과정을 관찰하기 위해 정렬된 무작위 3D 콜라겐 매트릭스를 생성하는 것입니다. 이 방법은 실제 조직에서 발견되는 콜라겐 기능을 캡처하도록 설계되었으며, 이는 세포가 정렬되거나 무작위적인 세포외 기질을 인식하는 데 사용하는 메커니즘과 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 3D 환경의 구성, 내부 이미지 셀을 조작할 수 있으며 일반적으로 사용 가능한 장비를 사용하여 비용 효율적으로 이 작업을 수행할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 콜라겐 용액과 중화 완충액을 충분히 잘 혼합하지 않고 채널을 통해 콜라겐을 일관되지 않게 끌어당기기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 선임 과학자인 브라이언 버클(Brian Burkel)입니다. 우선, 콜라겐의 적절한 중화를 보장하기 위해 세포와 배지를 추가하기 전에 콜라겐과 HEPES 완충액을 철저히 혼합하십시오.

그런 다음 세포와 배지를 중화된 콜라겐 혼합물에 추가하고 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 얼음 위에 놓습니다. 콜라겐 겔 외부의 세포의 부착 및 성장을 최소화하기 위해 멸균 비조직 배양 처리된 표면에 얼음처럼 차가운 혼합물을 피펫팅합니다. 피펫을 사용하여 용액을 고르게 펴십시오.

겔이 실온에서 약 10-15분 동안 중합되도록 합니다. 다음으로, 겔을 덮고 섭씨 37도의 인큐베이터로 옮겨 추가로 45-60분 동안 중합을 마칩니다. 중합 시 겔은 불투명하게 변합니다.

중합이 완료되면 2-3 밀리리터의 매체를 첨가하십시오. 그런 다음 우물 둘레에 200 피펫을 실행하여 우물 측면에서 젤을 방출합니다. 접시를 부드럽게 휘저어 바닥 표면에서 젤을 분리합니다.

콜라겐 매트릭스를 정렬하기 위한 PDMS 마이크로채널을 생성하기 위해. 먼저 다른 곳에서 설명한 표준 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 SuA 실리콘 마스터를 준비합니다. 다음으로, 크래프트 스틱을 사용하여 일회용 컵에 엘라스토머 베이스 20g과 경화제 2g을 완전히 혼합합니다.

잘 혼합되면 일회용 컵을 550mm의 수은의 진공 압력 하의 진공 챔버에 넣어 PDMS 혼합물의 가스를 제거합니다. 약 1-1시간 30분 동안 혼합물의 가스를 제거합니다. PDMS를 탈기하는 동안 깨끗한 투명 필름 시트를 핫 플레이트에 놓고 실리콘 마스터를 준비합니다.

마이크로 채널 금형이 위를 향하도록 합니다. 1-1시간 30분 후 진공 챔버에서 가스가 제거된 PDMS를 제거합니다. PDMS를 마스터 중앙에 천천히 붓고 중력이 고르게 퍼지도록 합니다.

다음으로, 기포를 방지하기 위해 실리콘 마스터와 PDMS 위에 두 번째 투명 필름 시트를 조심스럽게 굴립니다. 투명도 위에 고무 시트를 부드럽게 놓고 1/8 인치 아크릴 시트를 놓은 다음 아크릴 시트 위에 3 개의 10 파운드 무게 중 첫 번째 무게를 추가합니다. 처음에는 첫 번째 추가 떠서 나머지 두 개의 추판을 진행하기 전에 안정되고 안정화될 수 있습니다.

계속할 준비가 되면 핫 플레이트를 섭씨 70도로 설정하고 4시간 동안 PDMS를 경화합니다. 경화되면 PDMS를 최소 1시간 더 냉각시킨 다음 웨이퍼의 상단 투명 필름을 조심스럽게 벗겨냅니다. 마지막으로 집게로 채널을 제거합니다.

새 깨끗한 투명 필름에 채널을 거꾸로 놓고 날카로운 집게로 원을 그리며 모든 포트를 청소합니다. 느슨해진 PDMS 조각을 제거합니다. 다음으로, 패킹 테이프 조각을 벤치에 놓고 끈적한 면이 위로 향하게 하고 테이프 위에 PDMS 채널 면을 아래로 놓습니다.

한 쌍의 집게의 둥근 끝으로 채널을 눌러 좋은 접촉을 보장합니다. 채널을 제거하고 보이는 파편이 모두 제거될 때까지 양쪽에서 이 과정을 반복합니다. 그런 다음 깨끗하고 준비된 PDMS 채널을 70% 에탄올로 채워진 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

30초 동안 최대 속도로 채널을 소용돌이친 다음 용액을 70% 에탄올의 새 제품으로 교체합니다. 무균 기술을 사용하여 PDMS 채널 쪽을 위로 향하게 하여 깨끗하고 멸균된 접시에 넣습니다. 그런 다음 에탄올이 증발할 때까지 채널을 UV 처리합니다.

건조되면 채널을 커버 슬립이나 유리 바닥 접시에 뒤집고 유리 위에 눌러 잘 밀봉합니다. 멸균 PDMS 패치를 추가하여 채널의 중앙 부분을 덮고 닫은 다음 진행하기 전에 설정을 완전히 건조시킵니다. 다음으로, 밀리리터당 10마이크로그램의 콜라겐 용액 100마이크로리터 방울을 채널 상단에 놓고 진공 청소기를 사용하여 채널을 통해 끌어옵니다.

채널을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양한 다음 콜라겐 코팅 용액으로 채워진 채널을 냉장고로 옮깁니다. 약 15-30분 동안 설정을 식힌 다음 흡인기 또는 피펫을 사용하여 채널에서 콜라겐 코팅 용액을 제거합니다. 콜라겐 용액을 중화하고 세포 배지로 희석한 다음 얼음에서 15분 동안 배양하는 것으로 시작합니다.

그런 다음 120-150 마이크로 리터의 콜라겐 용액을 사전 냉각 채널의 포트 A에 놓습니다. 다음으로, 25 밀리리터 피펫을 진공 라인에 부착하고 포트 C.에 놓습니다.이를 사용하여 한 번의 균일 한 동작으로 혼합물을 끌어 당기고 콜라겐이 끝에 도달하면 멈춥니다. 무작위 매트릭스를 생성하는 가장 중요한 단일 단계는 채널을 통해 콜라겐을 천천히 끌어당기는 것입니다.

너무 빨리 당겨지면 채널 부분 또는 채널 전체에 걸쳐 정렬이 증가합니다. 주의깊게 항구 지구에서 어떤 과잉 해결책든지 제거하고 그 후에 두 항구, A와 C.After 2 3 분 둘 다에 메마른 PDMS 헝겊 조각을 두고, 항구 B를 덮는 중앙 PDMS 헝겊 조각을 제거하고 중심 항구로 밀리리터 당 1개에서 3백만개의 세포의 농도로 세포의 2개에서 3개의 마이크로 쓰레기를 추가하십시오. 겔이 실온에서 10-15분 동안 부분적으로 중합될 때까지 기다린 다음 추가로 15-30분 동안 콘스로를 섭씨 37도의 인큐베이터로 옮깁니다.

중합이 완료되면 PDMS 포트 덮개를 제거하고 미디어를 추가하여 채널을 완전히 덮습니다. 여기에서 50, 000 4개의 T 1 세포는 5 일 동안 2 mg/ml 또는 3.5 mg/ml 교원질 젤에서 끼워넣었다. 4 개의 T 세포 한 라인은 고도로 수축성 인 Med Aesthetic 암 라인이지만 같은 기간 동안 약 10 %의 저밀도 젤이 57 % 수축 될 때만 고밀도 젤을 수축 할 수 있습니다.

콜라겐 정렬의 정도는 콜라겐 흐름의 속도에 의해 조절되어 더 높은 콜라겐 흐름 속도가 더 나은 정렬을 산출하도록 합니다. 더 높은 진공 압력과 결합된 더 좁은 채널을 사용하면 콜라겐 네트워크의 정렬이 향상되는 반면, 낮은 진공 압력과 함께 사용되는 더 넓은 채널을 사용하면 무작위 매트릭스가 생성됩니다. 일단 마스터하면 콜라겐 젤 또는 채널을 붓는 것은 적절하게 수행하면 2시간 30분 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 시작하기 전에 구성 요소를 설정해야 한다는 점을 기억해야 합니다. 콜라겐 작업을 시작하면 빠르게 작업해야 합니다. 개발 후 이 기술은 3D 세포 생물학 분야의 연구자들이 3차원 세포 외 환경으로의 세포 접착, 이동 및 침입을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 다양한 밀도의 콜라겐 젤을 붓는 방법과 무작위 및 정렬된 콜라겐 매트릭스를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.