Name: 3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비 생체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 정렬 및 무작위 3D 콜라겐 매트릭스를 제작하여 세포 이동과 세포 과정을 관찰하는 방법을. 이 기술은 세포외기질 상호작용을 연구하고 조직 공학에 활용할 수 있습니다.

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저자는이 작품을 자금에 대한 허가 번호 UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 및 T32-GM008692-18을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 CT-화재 분석의 개발 및 지원 궤적의 제레미 Bredfelt 및 Yuming 리우를 인정합니다.

1. 중화, 희석 및 3D 조사 및 세포 수축 분석 실험을위한 콜라겐 솔루션의 중합 <ol><li> 무균 조직 배양 후드에서 얼음에, 콜라겐 (1 : 1) 중화 2 배 PBS에서 살균, 얼음처럼 차가운 100 mM의 HEPES, 15 ML 원뿔 튜브의 pH 7.4,와. 용액이 균질하지 않고 혼합 소용돌이가 더 이상 볼 수 있습니다 때까지 플라스틱 피펫 충분히 섞는다. 혼합 과정에서 공기 방울을 소개 않도록주의하십시오. 얼음에 잠시 저장합니다. </li><li> 세포 미디어와 적절한 농도 (등 RPMI, DMEM, 등)에 중화 된 콜라겐을 희석. <ol><li> N은 = (D은 V *), V는 / (S / 2), N이 필요 중화 콜라겐 양이고는 D 원하는 콜라겐 농도는 인 등식을 사용하여 목적하는 콜라겐의 농도를 확인하는 데 필요한 중화 콜라겐의 양을 계산하는데 바람직한 콜라겐 농도의 최종 부피 및 S는 t이며그는 재고 콜라겐 농도를 시작. </li><li> 세포 및 세포 배지 용액을 첨가하여 부피로 중화 콜라겐의 양을 준비한다. 철저하게 혼합하고 주조 할 준비가 될 때까지 얼음에 저장합니다. <ol><li> 예 : (6 웰 플레이트 또는 50mm 유리 바닥 접시 겔 캐스팅을위한 일반적인 양), 2 ㎎ / ㎖의 1 ㎖의 겔 부피 젤 먼저 원하는 최종 부피 원하는 농도 (2 ㎎ / ㎖)을 곱 (1 mL)을 첨가 하였다. 이 번호 (2 mg)을 가지고 병에 상장 주식 농도 (9.49 ㎎ / ㎖)의 절반을 나눕니다. 이 경우, 중화 된 콜라겐 0.42 mL의 미디어 / 세포 혼합액 0.58 ㎖로 희석한다. </li></ol></li></ol></li><li> 피펫이 아닌 조직 배양 중 하나에 얼음처럼 차가운 콜라겐 / 셀 / 미디어 혼합물을 6 웰 플레이트 또는 50mm의 유리 바닥 접시를 처리 하였다. 균등하게 솔루션을 확산 피펫 팁을 사용합니다. 주 : collag 외부 세포의 부착 또는 성장을 최소화하기 위해 처리 된 플레이트가 아닌 조직 배양을 사용하는 것이 중요젤 갖추고 있습니다. </li><li> 15 분 - 약 10 상온에서 중합 할 수 있습니다. 겔 중합에 불투명 설정해야합니다. </li><li> 중합을 완료 60 분 -이 불투명 설정 한 후, 추가로 45 37 ˚C에 플레이트 접시를 이동합니다. </li><li> 45 후 - 잘 또는 접시의 경계 주위 P200 피펫 팁을 실행하여 잘의 측면에서 젤 미디어의 3 ㎖ 및 해제 - 60 분, 2를 추가합니다. 소용돌이 요리 부드럽게 젤을 분리합니다. 콜라겐 젤은 미디어에 떠되어야한다. </li></ol> 2. 웨스턴 블로 팅, 세포 형태 형성 및 젤 Gontractility 분석은 <ol><li> 십일 분석 - 7에 대한 세포와​​ 시드, 1.6 - 강성을 ECM 관련하여 단백질 수준, 형태 또는 휴대 수축력을 평가하기 위해, 1.1에 따라, 콜라겐 젤을 부어 시작합니다. 성장률 및 포화 상태에 따라 경험적으로 각 세포주 시드 레이트를 결정한다. 100,000 세포 / 겔 - 10 일 시험의 경우, 파종 밀도에서 20000의 범위 일 수있다. </li><li> 측정세포 수축은 룰러 또는 카메라 매 24 시간을 사용하거나, 적당한 시간 간격으로 겔 직경을 측정한다. 주 : 또한 현미경 수집 대응하는 이미지는 꽈리 형 구조, 세뇨관 상피 세포 돌기 및 lameliapodia 같이 겔 시드 세포주의 형태 적 특징의 특성을 검사 할 수있다. </li><li> , 단백질 수준을 평가 워즈니악 등. (17)와 갤러거 등. (18)의 설명에 따라 관심의 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 위해 RIPA에서 젤은 버퍼 용균 및 방법에 관한 것이다. <ol><li> 중요 : 세포 라인 사이의 수축의 비교에서, 루이에 의해 설명 된대로 젤에서 추출 할 수있는 전체 DNA에 수축력을 정상화, 등 (19), 또는 서양에 의해 변하지 않는, 가사 단백질 (히스톤, GAPDH, 등). 블롯 분석, 워즈니악 등. (17)와 갤러거 등의 설명에 따라. (18). 겔 내에서 계산 세포는 혈구를 사용하는 경우, 세포를 집중 계약 젤 등 총 젤 지역에 휴대폰 번호를 정상화해야합니다. </li></ol></li><li> 매체 1 ㎖를 제거하고 신선한 미디어 1 ㎖로 교체하여 4 일 - 피드 겔 매 3. 측정이 수축에 스파이크가 발생할 신선한 미디어 / 혈청의 첨가로 촬영 한 후 젤을 공급해야합니다. </li></ol> 콜라겐 섬유 정렬을위한 PDMS 마이크로 채널 3 세대 참고 : 정렬 된 콜라겐 매트릭스를 생성하려면, PDMS 마이크로 채널 (그림 2A)을위한 금형은 소프트 리소그래피 (15)를 통해 만들어진 SU-8 실리콘 마스터가 필요합니다. <ol><li> PDMS 채널을 만들기 위해, 공예 막대기로 일회용 컵에 철저하게 PDMS를 섞는다. 6 인치 실리콘 마스터를 들어, 경화제 2 g의 엘라스토머베이스 20g을 혼합한다. </li><li> 탈 가스를 진공 압력으로 진공 챔버의 일회용 컵을 배치하여 PDMS 혼합물550mm 수은. 드 가스 1 - 1.5 시간. </li><li> PDMS의를 드 가스 배출하지만, 쏟아져의 실리콘 마스터를 준비합니다. 실리콘 마스터이어서, 핫 플레이트 상에 투명 필름의 깨끗한 시트를 배치하여 준비한다. 마이크로 몰드가 직면하고 있는지 확인합니다. 주 : PDMS 주조 및 경화 동안 실리콘 마스터 투명 필름 두 장 사이에 개재된다. </li><li> 한 후 - 1.5 시간, 진공 챔버에서 탈기 PDMS를 제거하고 천천히 실리콘 마스터 위에 붓는다. 중요 : 공기 방울을 피하십시오. 마스터의 중심에 부어, 그리고 중력이 균등하게 확산 할 수 있도록 계속합니다. 주 : PDMS 드롭 마스터 가장자리 끝까지 연장 할 필요는 없다. </li><li> PDMS 마스터에 부은 후 실리콘 마스터와 PDMS 위에 투명 필름의 제 2 시트를 적용한다. 조심 기포 않도록 아래 PDMS / 실리콘 마스터 위에 제 투명성 시트 롤. 서두르지 마. PDMS는 지금 균등 O를 확산해야버전 마스터. </li><li> 부드럽게 1/8 &quot;아크릴 시트 뒤에 투명성의 상단에 고무 시트를 배치합니다. </li><li> 아크릴 시트의 상단에 세 10 파운드 무게를 추가합니다. 초기에, 가중치는 &quot;부유&quot;한다. 그들이 더 진행하기 전에 정착 및 안정화 할 수 있습니다. </li><li> 4 시간 동안 70 ℃ 및 치료 PDMS에 열판의 온도를 설정합니다. 방해하기 전에 1 추가 시간의 최소 냉각시킵니다. </li><li> 조심스럽게 웨이퍼에서 투명 필름 위에 시트를 벗겨, 그리고 집게로 채널을 제거합니다. </li><li> 준비가 될 때까지 먼지가없는 접시에 스토어 사용할 수 있습니다. </li></ol> 사용 4. 준비하고 PDMS 마이크로 채널 <ol><li> 거꾸로 새로운, 깨끗한 투명 필름에 배치 채널. 날카로운 집게로 원 운동을 사용하여 청소 모든 포트 (그림 2b). PDMS의 조각을 제거합니다. </li><li> 압정으로 천 테이프 포장의 일부를 이용하여 채널 면도. 벤치의 표면 (최대 접착면)에 테이프를 적용하고 채널 O를 설정n 개의 최고. 좋은 접촉을 보장하기 위해 집게의 둥근 끝 채널 아래로 누릅니다. 분리 보이는 이물질이 제거 될 때까지 양쪽 반복한다. </li><li> 전사 세정은, 70 % EtOH로 50 ml의 원추형으로 PDMS 채널 수험 공부. 30 초 동안 최대 속도로 소용돌이. EtOH를 폐기하고 신선한 70 % EtOH로 교체합니다. 준비가 될 때까지 70 %의 EtOH에 보관 사용하기. </li><li> 조직 문화 후드 및 무균 기술을 사용하여, 깨끗하고 무균 커버 유리 또는 유리 바닥 요리에 PDMS 채널을 전송할 수 있습니다. EtOH로 증발 할 때까지 채널면이 위로와 UV 치료를 넣습니다. </li><li> 채널은 커브 글라스를 향해 아래로 향하게되도록 일단 건조의 PDMS를 뒤집습니다. 좋은 도장을 확인하기 위해 유리에 PDMS 채널을 누르십시오. 커버하는 멸균 PDMS의 패치를 추가 / 중앙 포트습니다 (포트 B를 그림 2B). 진행하기 전에에 철저하게 건조 할 수 있습니다. </li><li> 프리 코트 멸균 10 μg의 / ㎖의 콜라겐으로 채널 내부. 코팅하는 chann의 상부에 100 μL 방울을 배치엘, 그리고 진공을 통해 그립니다. 37 ℃에서 1 시간 후, 냉장고 콜라겐 코팅 용액으로 채워져 전송 채널. 30 분 - 약 15 침착 해. </li><li> 흡입기 또는 피펫으로 콜라겐 코팅 용액을 제거하고, 콜라겐의 제조를 시작한다. </li></ol> 마이크로 채널 사용 5. 콜라겐 준비 <ol><li> 배 PBS, pH를 7.4에서 얼음처럼 차가운 100 mM의 HEPES와 : 얼음에, 콜라겐 (1 일)을 중화. 균질 할 때까지 철저하게 믹스 (자세한 내용은 섹션 1.1 참조). </li><li> 세포 미디어와 적절한 농도 중화 콜라겐을 희석 (자세한 내용은 1.2 절 참조). 얼음에 15 분 동안 품어. </li><li> 동시에, 냉각 얼음에 채널을 탑재. 참고 : 목표 아래 4 C 또는에서 채널 프로세스의 모든 구성 요소를 가지고있다. 콜라겐 핵 생성 온도 및 시간은 중합 공정에 중요한 파라미터이고, 필요한 경우, 추가의 최적화를위한 시작점이 될 수있다. </li><li> COUN이때 적절한 접종 밀도에서 hemacytometer와 함께 재현 탁 t 세포. 3,000,000 세포 / ml - 계산의 편의를 위해, (1)에 재현 탁. (자세한 내용은 또한 2.1 절 참조). </li><li> 세포가 계산되었고, 15 분 경과하면, 쏟아지는 콜라겐을 진행합니다. </li></ol> 6. 정렬 및 임의의 콜라겐 마이크로 채널 붓는 <ol><li> 채널을 통해 콜라겐을 그리기 전에, 조정​​ 및 인라인 진공 레귤레이터 진공 압력을 설정합니다. 진공 압력은 유도 및 정렬의 정도를 결정 콜라겐 유량을 제어 할 수있는 힘을 제공한다. <ol><li> 랜덤 또는 정렬되지 않은 매트릭스를 들어 10 mmHg의 이하의 진공 압력으로 다양한 채널 (3mm x 세로 200 ㎛의 높이)를 사용한다. </li><li> 정렬 행렬를 들어, 60mm 수은 이상의 진공 압력 좁은 채널 (1mm x 세로 200 μm의 높이)를 사용합니다. </li></ol></li><li> 얼음에서 장착 채널을 제거하고 층류 시간의 청소, 소독 표면에 배치짐 우드. </li><li> (그림 2B) 포트 A에 중화 콜라겐 150 μl를 - 빠르게 작업하고 (120)를 넣습니다. </li><li> 포트 C (도 2b)를 통해 진공 라인에 연결된 25 ㎖ 피펫을 배치하여 채널을 통해 콜라겐을 그린다. 하나의 균일 한 모션을 통해 콜라겐을 그립니다. 중요 : 랜덤 또는 정렬되지 않은 행렬를 들어, 채널을 통해 서서히 콜라겐을 그립니다 (약 0.5-1 초당 mm), 그것은 끝에 도달하면 중지합니다. 정렬 행렬를 들어, 더 빠르게에서 콜라겐을 그릴하지만 공기 방울을 피하기 위해주의하십시오. </li><li> 조심스럽게 P200의 pipetman 또는 흡입기와 포트 지역에서 초과 콜라겐을 제거합니다. </li><li> A와 C. 모든 포트가 지금 적용해야 두 포트를 통해 멸균 PDMS 패치를 놓습니다. </li><li> 이 후 - 3 분, 센터 PDMS 패치 (포트 B)를 제거하고 2 추가 - 중앙 포트 - (10,000 세포 5) 세포의 3 μl를. 15 분 - 부분적으로 또 다른 10 실온에서 (불투명 설정) 중합 할 수 있습니다. </li><li> 10 후- 15 분, 추가로 15 37 ˚C로 전송 - 중합을 완료하는 데 30 분. PDMS 커버를 제거하고 필요에 따라 완전히 채널 및 문화 세포를 충당하기 위해 미디어를 추가 할 수 있습니다. 세포는 이전 미디어 mL를 제거하고, 새로운 미디어 ㎖로 교체하여 공급 될 수있다. </li></ol>

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3D 콜라겐 젤은 세포가 해석하는 방법을 이해하고 지역의 미세 환경에 대응하는 우리의 도구 상자에 추가되었다. 이 원고는 3D 콜라겐 매트릭스 내에서 세포를 포함하기위한 아주 기본적인 프로토콜을 제공하고, 재현성 랜덤 또는 정렬 된 콜라겐 섬유와 매트릭스를 생성 할 수 있습니다. 두 프로토콜은 다른 콜라겐 이성체, 가교제, 기타 매트릭스 단백질 잠재적 중합시에 첨가 할 수 있으므로 적응력 플랫폼 작동한다. 또한, 유전자 발현 및 단백질 생산을위한 다른 시간대 및 엔드 포인트를 평가하기 위해 플랫폼을 쉽게 수정할 수있다. 이미지 평가, 단백질 및 RNA 수준, 판독 대사 프로파일은 모든 3D 기법 매우 호환 가능하다. 모든 기술에 중요하기 때문에, 이는 젤 분석의 품질을 평가하는 것이 중요하다. 좋은 품질의 콜라겐 젤의 기호는 수동 조작을 처리 할 수​​있는 것입니다. 예를 들어, 1 ml의 [1 ㎎ / ㎖여섯 웰 플레이트가 쉽게 집게로 집어 조작해야합니다으로] 콜라겐 겔을 쏟...

많은 세포 과정이 2차원에서 광범위하게 연구되어 기본 세포 신호 메커니즘에 대한 집단 지식을 형성했습니다. 그러나 이러한 연구는 국소 세포 미세환경 및 세포외 기질(ECM)의 구조적 및 기계적 특성에서 얻은 중요한 세포 신호를 무시합니다. 생리학적 맥락에서 세포가 어떻게 상호 작용하는지 더 잘 이해하려면 3차원(3D) 분석으로 세포를 연구하는 것이 중요합니다. 이러한 3D 분석을 위한 ECM은 세포 유래 또는 정제된 단백질에서 재구성할 수 있습니다. ECM의 출처에 관계없이 3D 매트릭스 분석은 세포가 생리학적 세계 내에서 어떻게 탐색하고 상호 작용하는지 이해하는 데 매우 중요한 것으로 입증되었습니다. 예를 들어, 3D 매트릭스에서 성장한 세포는 2D 실험4-6에서 관찰되지 않은 주변 ECM의 기계적 특성에 따라 달라지는 뚜렷한 운동 모드를 나타냅니다. 더욱이, 3D로 배양된 세포는 유리나 플라스틱과 같은 단단한 표면에서 성장한 세포보다 응력 섬유와 초점 접착력이 점점 더 적어진다7. 
그러나 상황별 3D 분석의 중요성은 세포 이동에만 국한되지 않습니다. 일부 다른 세포 신호 전달 이벤트는 3D 분석을 통해서만 조사할 수 있습니다. 조직과 세포가 분화되는 동안 세포 외 환경과 ECM의 강성은 형태 형성 사건에 영향을 줄 수 있는 신호를 제공합니다. 예를 들어, 유방 상피 세뇨관 형성은 강성이 낮은 3D 매트릭스에서만 발생하지만 강성이 높은 매트릭스나 2D 기층8,9에서는 발생하지 않습니다. 뻣뻣한 3D 매트릭스 내에서 배양될 때, 이러한 동일한 상피 세포는 변경된 FAK 및 ERK 신호 전달을 통해 증식 및 세포막 돌출부가 증가한 비정상적인 표현형을 취합니다10. 다른 많은 신호 전달 경로 및 세포 과정은 국소 세포 환경의 강성에 의해 유사하게 영향을 받는 것으로 알려져 있으며, 이러한 신호 전달 캐스케이드는 3D ECM의 적절한 국소 기계적 특성의 맥락에서 신호 전달 이벤트 및 세포 표현형을 조사하는 것의 중요성을 강조합니다. 
Collagen I은 ECM의 가장 풍부한 구성 요소이며 세포 미세환경의 많은 기계적 특성을 담당하기 때문에 체외 연구에 사용하기에 특히 적합한 단백질입니다. 원래는 단순한 구조 단백질로 생각되었지만, 이제는 그 역할이 훨씬 더 복잡한 것으로 알려져 있습니다. 콜라겐 섬유의 구성, 구조, 방향, 밀도 및 강성은 모두 집중된 신호 정보환경을 제공합니다 5. 만성 염증 및 종양 형성과 같은 특정 질병이 진행되는 동안 콜라겐 네트워크는 극적으로 리모델링됩니다2,11. 보다 구체적으로 유방암의 경우, 콜라겐 침착 증가와 조직 경직이 동반되며 종양 진행에 기여할 가능성이 있습니다. 이러한 초기 종양에서는 굳어진 콜라겐 네트워크가 긴장되고 정렬된 것처럼 보이기 때문에 대부분의 섬유가 성장하는 종양을 캡슐화합니다2. 종양이 진행됨에 따라 콜라겐은 계속 재조직되고 섬유소 네트워크의 영역은 종양 경계에 수직으로 배향됩니다2,12. 수직 정렬은 이러한 환자가 질병 없는 진행과 전체 생존율이 더 낮은 예후 바이오마커 역할을 합니다1. 이러한 상관관계에 대한 한 가지 설명은 좋지 않은 결과가 정렬된 콜라겐 네트워크에서 지속적인 세포 이동을 통해 종양 세포의 전파가 증가한 결과라는 것입니다3. 
종양 진행에서 관찰되는 정렬 및 조직에 세포가 구체적으로 어떻게 반응하는지 이해하려면 실험을 위해 무작위 및 정렬된 3D 콜라겐 매트릭스를 모두 생성해야 합니다. 섬유소 네트워크 내에서 정렬을 유도하는 세 가지 기본 방법론이 있습니다. 첫 번째 기법은 두 지점 사이의 콜라겐을 수축하거나 늘려 정렬을 생성하는 변형 유도 장치를 사용합니다. 힘의 축에 평행한 섬유는 팽팽하게 당겨지고 축에 수직인 섬유는 압축되고 좌굴됩니다. 스트레인 유도 기법은 일반적으로 뛰어난 정렬을 제공하지만, 이 접근 방식은 많은 플랫폼에 쉽게 적용할 수 없는 부피가 큰 장비를 필요로 합니다3,13. 대안적으로, 세포 유도 균주는 콜라겐13을 수축하고 정렬하는 세포의 국부적인 플러그를 배치하여 생성할 수 있습니다. 이 방법은 많은 매개 변수가 변경 될 수 있으므로 가변적이라는 문제가 있습니다. 두 번째 방법은 콜라겐 정렬을 유도하기 위해 중합 중에 자기 비드와 자기장을 사용합니다13,14. 정교하지 않은 장비로이 방법으로 좋은 결과를 얻을 수 있지만 폴리머를 자화하기 위해 항체 또는 다른 방법을 사용해야합니다. 따라서 사용하는 데 다소 비용이 많이 들 수 있으며 콜라겐 젤의 강성은 네트워크의 연결 증가에 의해 잠재적으로 수정될 수 있습니다. 또한 이 과정에 사용되는 자기 비드는 종종 자가형광성으로 이미징 실험에 문제가 됩니다. 마지막으로, 정렬은 PDMS 미세유체 채널3,15,16에 의해 생성될 수 있습니다. 이 방법에서, 콜라겐 정렬은 작은 미세유체 채널을 통해 콜라겐을 중합시킴으로써 달성됩니다. 이러한 미세유체 채널은 다양한 설계로 만들 수 있으며 많은 플랫폼에 쉽게 적용할 수 있습니다. 더욱, 그들은 아주 소량의 교원질 및 다른 시약이 그들의 작은 크기 때문에 이용되기 때문에 아주 경제적입니다.
여기에 제공된 것은 3차원 섬유소 콜라겐 하이드로겔 내에 세포를 내장하기 위한 간단한 프로토콜입니다. 또한, PDMS 미세유체 채널이 콜라겐 매트릭스의 조직 및 정렬을 제어하는 데 사용되는 보다 진보된 기술도 제공됩니다. 이 프로토콜은 많은 플랫폼에 쉽게 적용할 수 있으며, 3차원의 생리학적 미세환경에서 세포 이동, 세포 분열 및 기타 세포 과정을 조사하기 위해 정렬된 콜라겐 매트릭스와 무작위 콜라겐 매트릭스를 모두 재현 가능하게 생성할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>고농도 랫 테일 콜라겐</td><td>코닝</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>SylGard184 엘라스토머 키트</td><td>Corning</td><td>NC9285739</td><td>엘라스토머 PDMS 채널용</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310</td><td>HEPES 중화 버퍼</td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP366</td><td>HEPES 중화 버퍼</td></tr><tr><td>KH 2 PO4 </td> <td>Fisher</td><td>BP362</td><td>HEPES 중화 버퍼</td></tr><tr><td>Na2 HPO4</td><td>Fisher</td><td>S374</td><td>HEPES 중화 버퍼</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>HEPES 중화 버퍼</td></tr><tr><td>부과금 개선된 Neubauer Hemacytometer</td><td>Fisher</td><td>15170-208</td><td>세포 계수</td></tr><tr><td>6-웰 비조직 배양 플레이트&nbsp;</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>50 mm 유리 바닥 접시</td><td>MatTek</td><td>P50g-1.5-30-f</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art 플라스틱 진공 탈착기</td><td>Bel-Art</td><td>F4200-2021</td><td>PDMS 투명 필름용 탈기 챔버</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>3M</td><td>pp2950</td><td>pdms 채널 주입용 플라스틱 필름</td></tr><tr><td>ThermoScientific CimaRec</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>HP141925</td><td>PDMS 마이크로 채널 경화용 핫 플레이트</td></tr><tr><td>진공 레귤레이터</td><td>정밀 의료</td><td>PM3100</td><td>콜라겐 마이크로 채널 용 진공 레귤레이터</td></tr><tr><td>8 "x 8"고무 시트</td><td>아마존 - 고무 칼</td> 실리콘 - <td>PDMS 마이크로 채널 주입 용</td><td>60A</td> 고무 시트</tr><tr><td>8 "x 8"x 0.125 "아크릴 시트</td> PDMS 마이크로 채널 주입 용 <td>아마존</td><td>플렉시 글라스 시트</td><td></td></tr><tr><td>10 lb 무게</td><td>Amazon</td><td>CAP Barbell</td><td>PDMS 마이크로채널</td></tr><tr><td>주입용 15 ml 원뿔형 튜브</td><td>Fisher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원뿔형 튜브</td><td>Fisher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 피펫</td><td>Dot Scientific</td><td>229202B, 229206B, 그리고 667225B</td><td>2&nbsp; ml, 5&nbsp; ml 및 25&nbsp; ml</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>피셔</td><td>NC9663244</td><td></td></tr></tbody></table>

3d 상호 작용의 연구에 대한 3d 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

역사적으로 대부분의 세포 과정은 2차원에서만 연구되었습니다. 이러한 연구는 일반적인 세포 신호 전달 메커니즘에 대해 유익한 정보를 제공했지만, 국소 미세환경 및 세포외 기질(ECM)의 구조적, 기계적 특성에서 얻은 중요한 세포 신호를 무시했습니다. 생리학적 ECM 내에서 세포가 어떻게 상호 작용하는지 이해하려면 3차원 분석의 맥락에서 세포를 연구하는 것이 중요합니다. 세포 이동, 세포 분화 및 세포 증식은 3차원 ECM의 기계적 특성의 국부적 변화에 의해 영향을 받는 것으로 밝혀진 몇 가지 과정에 불과합니다. ECM의 핵심 섬유소 구성 요소인 콜라겐 I은 조직의 단순한 구조 요소 그 이상입니다. 정상적인 조건에서는 콜라겐 네트워크의 기계적 신호가 형태 형성을 지시하고 세포 구조를 유지합니다. 종양 미세환경과 같은 병든 미세환경에서는 콜라겐 네트워크가 극적으로 리모델링되어 조성 변경, 침착 강화 및 섬유 조직 변경이 나타납니다. 유방암에서는 종양 경계에 수직으로 정렬된 섬유의 증가가 환자의 예후 저하와 상관관계가 있기 때문에 섬유 정렬의 정도가 중요하다1. 정렬된 콜라겐 매트릭스는 지속적인 이동을 통해 종양 세포의 전파를 증가시킵니다2,3. 다음은 3차원 섬유소 콜라겐 하이드로겔 내에 세포를 내장하기 위한 간단한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 많은 플랫폼에 쉽게 적용할 수 있으며, 조정 가능한 3차원 생리학적 미세환경에서 세포 이동, 세포 분열 및 기타 세포 과정을 조사하기 위해 정렬된 콜라겐 매트릭스와 무작위 콜라겐 매트릭스를 모두 재현 가능하게 생성할 수 있습니다.

3D 분석법 콜라겐 겔 강성 동일한 범위 내에서 실시 할 수 있지만, 겔 강도를 변화하는 세포들은 세포 미세 환경에서의 기계적 변화에 응답하는 방법을 결정하는데 사용될 수있다. 뻣 뻣 한 콜라겐 하이드로 겔이 포함 된 세포가 로컬 주변의 콜라겐을 수축에없는 젤로 정의된다. 상이한 세포 유형의 고유 수축 독특하고, 따라서 그것은 호환 단단한로 감지 될 콜라겐 농도를 설정하는 간단한 수축 곡선 시작할 최상이다. 셀 번호를 일정하게 유지하고 콜라겐 젤의 농도를 증가시킴으로써 시작합니다. 이전 10,20 바와 같이 겔 강도는 농도가 기하 급수적으로 확장 할 것이다. 수축성 분석의 대표적인 예는도 1에 도시된다. 여기서, 50,000 4T1 세포에 포함 된 eithe라 2 ㎎ / ㎖ 또는 5 일 동안 3.5 ㎎ / ㎖ ...

콜라겐은 ECM의 핵심 구성 요소이며, 이전의 분화와 증식에 이르기까지 여러 세포 과정에 대한 중요한 단서를 제공한다. 3D 콜라겐 히드로 겔 내에 세포를 포함하는 프로토콜 및 PDMS 마이크로 채널을 사용하여 무작위 또는 정렬 된 콜라겐 매트릭스를 생성하는 더 진보 된 기술이 여기에 제공된다.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

본 실험 절차의 전체적인 목표는 3D 환경 내에서 세포 이동 또는 기타 세포 프로세스를 관찰하기 위해 정렬된 및 무작위 3D 콜라겐 매트릭스를 생성하는 것입니다. 이 방법은 실제 조직에서 발견되는 콜라겐 특성을 구현하도록 설계되었으며, 이는 세포가 정렬된 또는 무작위 extracellular matrix를 인식하는 데 사용하는 메커니즘과 같은 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 3D 환경의 조직을 조절하고 그 내부의 세포를 이미징할 수 있으며, 이를 일반적으로 사용 가능한 장비를 통해 비용 효율적으로 수행할 수 있다는 점입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 콜라겐 용액과 중화 완충액을 충분히 섞지 않거나, 채널을 통해 콜라겐을 일관성 없게 흡입하여 어려움을 겪습니다. 이 과정은 제 실험실의 선임 연구원인 Brian Burkel이 시연할 것입니다. 우선, 콜라겐의 적절한 중화를 위해 세포와 배지를 추가하기 전 콜라겐과 HEPES 완충액을 충분히 혼합하십시오.그 다음, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 중화된 콜라겐 혼합물에 세포와 배지를 추가하고 얼음에 둡니다. 콜라겐 겔 외부에서 세포가 부착 및 성장하는 것을 최소화하기 위해, 얼음처럼 차가운 혼합물을 멸균된 비조직 배양 처리 표면에 피펫으로 분주합니다. 피펫을 사용하여 용액을 고르게 펴줍니다.젤을 실온에서 약 10분에서 15분 동안 중합시킵니다. 그다음, 젤을 덮고 37 °C 인큐베이터로 옮겨 45분에서 60분 동안 추가로 중합을 완료합니다. 중합이 완료되면 젤은 불투명하게 변합니다.중합이 완료되면 배지 2~3 mL를 첨가합니다. 그 다음, 200 µL 피펫으로 웰의 둘레를 따라 돌려 웰 측면에서 젤을 분리합니다. 디쉬를 부드럽게 흔들어 바닥 표면에서 젤을 분리합니다.콜라겐 매트릭스를 정렬하기 위한 PDMS 마이크로채널을 제작합니다. 먼저, 다른 문헌에 기술된 표준 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 SuA 실리콘 마스터를 준비합니다. 그다음, 일회용 컵에 엘라스토머 베이스 20 grams와 경화제 2 grams를 넣고 공예용 스틱을 사용하여 충분히 혼합합니다.잘 섞였다면, 일회용 컵을 550 millimeters of mercury의 진공 압력이 가해지는 진공 챔버에 넣어 PDMS 혼합물의 기포를 제거합니다. 혼합물의 기포를 약 1시간에서 1시간 30분 동안 제거합니다. PDMS의 기포를 제거하는 동

preparation-3d-collagen-gels-microchannels-for-study-3d-interactions

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

임베디드 세포와 어떤 표면을 포함하는 모듈 불리는 원통형 콜라겐 젤을 사용하여 마이크로 조직의 생성은 내피 세포로 코팅됩니다.

콜라겐의 모듈을 사용하여 미세 조직의 제조가 포함 세포를 젤

이 문서는 찬란 추가 수정 및 3D 세포 배양의 라이브 영상 모두에 사용할 수 있습니다 콜라겐 레이블을하는 방법을 제시한다. 우리는 또한 3D 환경에서 배양 세포의 내생 세포 골격 단백질을 시각화하기 위해 최적화 된 프로토콜을 제공합니다.

3D로 침윤성 암 세포의 세포 골격 조직을 공개

기계적 특성 및 세포 외 매트릭스의 미세 강하게 세포의 3 차원 이동에 영향을 미칩니다. 시험 관내 방법은 개별 세포 집단 수준에서 모두 biophysically 변수 환경에서 시공간 세포 이동 동작을 연구하기 위해, 설명한다.

동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

이 연구에서는 콜라겐, 평활근 세포 및 내피 세포를 직접 배양하여 살아있는 혈관 조직을 신속하게 만드는 기술을 제시합니다. 또한 엔지니어링된 혈관 조직의 기계적 특성화를 위한 새로운 프로토콜이 설명됩니다.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

세포 이동은 인간의 발달과 생활에서 중요한 부분을 차지합니다. 세포 이동을 변경할 수 있는 메커니즘을 이해하기 위해 3D 콜라겐 매트릭스에서 화학주성을 조사할 수 있는 평면 구배 확산 시스템을 제시하여 기존 분석법의 최신 확산 챔버 한계를 극복할 수 있습니다.

평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

이 원고는 3 차원 (3D)의 균일 한 배열 세포 외 기질에 둘러싸여 정의 형상의 상피 조직을 설계 할 수있는 소프트 리소그래피 기반 기술을 설명합니다. 이 방법은 세포 형태 및 실험 문맥 다양한 의무가 있고 동일한 복제의 높은 처리량의 선별을 허용한다.

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

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미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

여기, 선물이 빛 시트 현미경을 사용 하 여 3 차원 (3D) 콜라겐 매트릭스에 포함 된 면역 세포를 시각화 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 또한 3d에서 셀 이동 추적 하는 방법 elaborates. 다른 유형의 3D 매트릭스에 현 탁 액 셀이이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

인간의 면역 세포의 3 차원 시각화를 위한 빛 시트 현미경

여기서는 3D 매트릭스에서 축산이 자라는 동작을 분석하여 자연 발달을 모방하는 방법을 제공합니다.

신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성

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Microengineering 3D 콜라겐 하이드로겔(장거리 섬유 정렬 포함)

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IDG-SW3 3차원 세포외 기질에서의 세포 배양

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3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비

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