Name: 갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 학습하세요 마이크로포레이션을 이용한 신선한 인간 융모 세포영양세포의 siRNA 형질도입 및 EMSA 분석 방법을. 이 기술은 태반 연구에서 유전자 발현 조절 메커니즘을 규명하는 데 효과적입니다.

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이 작품은 캐나다의 국립 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) (# 298527) (BB)에서 교부금에 의해 지원되었다. CT는 기관 FARE 장학금에 의해 지원되었다. AV는 NSERC 그레이엄 벨 박사에 의해 지원되었다 장학금. BB는 인간 Retrovirology에서 캐나다 연구 의장에게 (2 단계)을 개최했다. 텍스트를 수정에 도움을 베아트릭스 Beisner 감사합니다.

UQAM 윤리위원회는 센터 Hospitalier Universitaire 드 몬트리올의 세인트 루크 병원 (몬트리올, 캐나다)의 윤리위원회의 지침에 따라 이들 프로토콜을 승인했습니다. 참가자는 동의서에 서명했다. 1. 중간 준비 및 기본 산모 Cytotrophoblasts의 분리 <ol><li> 25 mM의 HEPES, 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM)을 보완하여 인간의 기본 융모 cytotrophoblasts에 대한 문화 매체를 준비합니다. A의 멸균 0.22 μm의 필터와 매장을 통해 준비된 매체 필터 -20 50 ㎖의 분취에서 C 냉동고 °. </li><li> 표준 프로토콜 3 다음 신선한 태반에서 차 융모 cytotrophoblasts을 분리합니다. <ol><li> 융모 조직을 제거하지 않도록주의하면서 플라이어를 사용하여, 그것을 떨어져 긁는 부드럽게하여 조직에서 태아 막을 제거합니다. 잘라메스와 가위를 사용하는 방법에 대한 3 × 3cm의 큐브에 태반 융모 남아. 철저하게 산모의 혈액을 제거하기 위해 0.9 % NaCl을 함유하는 물에 씻는다. <ol><li> 펜치와 각각의 큐브를 잡고 조심스럽게 남아있는 혈관과 섬유 조직하여 가위에서 융모 조직을 제거합니다. </li><li> 및 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 I (DNase를 I) (, 융모 조직이 15 내지 30 mg의 내용 (최종 농도 1.2 ㎎ / ㎖에서 9.6 × 105 내지 1.8 × 106 U) 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)를 함유하는 트립신 4 회 다이제스트 연속 진탕 수욕에서 37 ° C에서 30 분 동안 최종 농도 200 μg의 / ㎖). 두 번째 소화 100ml로하고 나머지 두 digestions 75 ml의 첫 번째 소화 150 ml의 전체 볼륨을 사용합니다. </li></ol></li><li> 브레이크없이 15 분 동안 1,250 XG에 분산 세포와 원심 분리기를 포함하는 상층 액을 수집합니다. 데워진 함유 DMEM 1 ㎖에 재현 탁 상등액과 세포를 분리1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유. </li><li> 브레이크 없음 507 XG에서 23 분 동안 70 %의 폴리 비닐 피 롤리 돈 코팅 된 실리카 경사 (구배 제조 표 1 참조) 및 원심 - 불연속 5 % 위에 분산 셀 층을 포함한다. 흡인 1.033로 1.017의 밀도 층을 제거하고 새 피펫으로 그라데이션 40 %와 50 % 사이의 계층을 수집합니다. 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함 데워진 DMEM 10 ml의 광범위 세포를 씻으십시오. 참고 : 수집 된 부분은 trophoblasts을 품고 1.048과 1.062 사이에 밀도에 해당한다. </li><li> 혈구 세포를 사용하여 계산. 간단히, 세포를 혼합하여 새로운 microcentrifuge 관에 10 μl를 추가합니다. 트리 판 블루의 10 μl를 추가하고 부드럽게 다시 섞는다. 세포 현탁액을 작성하고 혈구 챔버를 입력합니다. 10X 목표 아래에있는 세포를 계산합니다. </li><li> 1 × 106 4.5 × 10 섹션 1.3 및 2에서 사용하기 위해 별도의 튜브에 6 셀, 각각의 장소LY. 다른 실험 4 일 최대 CO 2, 37 ℃ / 웰 첨가 DMEM 배지 및 배양에 1.5 × 106 세포의 밀도로 잔존 세포를 시드 및 5 %. </li></ol></li><li> 고립 된 차 융모 cytotrophoblasts의 순도 평가 <ol><li> 스핀 300 X g에서의 microcentrifuge 튜브에서 갓 격리 cytotrophoblasts의 1 × 6. 뜨는을 취소하고 데워진 인산염 완충 식염수 (PBS) 1 ㎖를 추가합니다. 원심 분리기 세포 300 XG에 흡인에 의해 PBS를 제거합니다. </li><li> 세포에 차가운 메탄올 1 ML을 추가하고 20 분 동안 -20 ° C에서 품어. 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포와 열망에 의해 메탄올을 제거합니다. 주의 : 메탄올을 처리하는 동안 용기 마스크, 보안경과 고무 장갑을 사용합니다. </li><li> 300 XG에 세포를 원심 분리기를 재수 흡인에 의해 PBS를 제거하고 실온에서 1 ml의 PBS를 추가합니다. </li><li> FBS (1시 50분 [V / V] 희석)과 FcRγ 쇄를 포함하는 PBS에서 세포를 품어실온에서 45 분 동안 시약 (1:10) 차단하는 비특이적 결합을 제거한다. </li><li> 5 분 300 XG에 실온 PBS 500 μL, 원심 분리기 세포로 두 번 세척하고, 흡인에 의해 PBS를 제거합니다. 100 ㎕를 실온 PBS에 재현 탁 세포. </li><li> 또는 실온에서 45 분 동안 0.2 % BSA를 함유하는 PBS에서 제어 이소 타입 정합 비특이적 항체 : 마우스 단일 클론 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC)로 세포를 인큐베이션은 항 - 인간 사이토 케라틴 -7- 항체 클론 LP5K (200 1) π 공역 어두운. PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 유동 세포 계측법 (3)에 의해 세포를 분석한다. 상기 실험 유동 세포 계측법에 의해 96 % CK-7 양성 세포 최소 보여 세포 제제를 사용한다. </li></ol></li></ol> 인간의 기본 산모 Cytotrophoblasts 2. siRNA를 형질 <ol><li> microporation 장치를 사용하여 인간의 기본 융모 cytotrophoblasts의 형질 <ol><li> 포함 된 6 웰 플레이트를 준비microporated 세포 배양을위한 보충 DMEM 배지 2 ㎖. </li><li> 주 cytotrophoblasts (1.2 절 참조)의 분리 후 정지 세포의 나누어지는을 가지고 혈구를 사용하여 세포 수를 결정합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 microcentrifuge 관과 펠렛 세포를 1.5 × 106 세포를 옮긴다. 1 ml의 둘 베코 PBS (DPBS) (의 Mg 2 +, 칼슘 -free)으로 세포를 세척하고, 실온에서 5 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 세포를 펠렛. </li><li> 상층 액을 제거하고 재 부유 버퍼 100 ㎕에 부드럽게 세포를 재현 탁. 실온에서 이상 15-30 분 동안 세포 현탁액을 유지하는 피 세포 생존하고 형질 전환 효율을 극대화 참고. </li><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 Syncytin-2의 siRNA (또는 제어 스크램블 된 siRNA)의 300 NG를 추가하고 100 ㎕를 형질 전환 피펫을 사용하여 세포의 siRNA 혼합물을 대기음. 끼워 넣다역에 피펫 (재료의 목록 참조) 30 밀리의 1300 V 단일 펄스로 세포를 대상으로 할 수 없다. </li><li> 즉시 세포의 손상을 방지하기 위해 37 ℃의 예열 된 배지를 포함한다 (단계 2.1.1에서 제조 됨)을 6- 웰 플레이트에 세포를 옮긴다. </li><li> 반복 나머지 샘플 2.1.5와 2.1.6 단계를 반복합니다. </li><li> 조심스럽게 세포의 고른 분포를 보장하기 위해 30 초 동안 판 바위. 24 ~ 48 시간 동안 가습 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 접시를 품어. 배지를 형질 전환 후 24 시간을 새로 고칩니다. </li><li> 웨스턴 블롯 분석에 의한 형질 전환 효율을 평가한다 (단계 3~6 참조). </li></ol></li><li> 인간의 기본 cytotrophoblasts에서의 siRNA의 리포 펙 <ol><li> 융모 cytotrophoblasts 단리 후, 배지 2 ml를 6- 웰 플레이트에서 웰 당 1.5 × 106 세포의 밀도로 세포를 시드 및 18 시간 동안 배양한다. </li><li> Syncytin-2 특이 적 siRNA를 300 ng의 희석 (또는 제어-스크램블siRNA의) 및 antibiotic- 및 무 혈청 배지 10 ㎕의 총 부피 1.5 ㎖의 별도의 튜브 지질 계 형질 감염 시약을 5 μL. 5 분 동안 품어. </li><li> 희석 시약을 혼합하고 형질 감염 복합체를 형성하고, 실온에서 추가로 20 분 동안 배양한다. 100 μL의 최종 볼륨 믹스에 antibiotic- 및 무 혈청 배지 90 μl를 추가합니다. </li><li> 6 웰 플레이트 (단계 2.2.1)에서 배지를 제거합니다. 이 새로운 배지 ㎖의 각 웰에 100 ㎕를 형질 믹스를 추가합니다. 24 ~ 48 시간에 대한 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어. 배지를 형질 전환 후 24 시간을 새로 고칩니다. </li><li> 웨스턴 블롯 분석에 의한 형질 전환 효율을 평가한다 (단계 3~6 참조). </li></ol></li></ol> 전체 세포 배양에서 해물 3. 준비 <ol><li> 용지를 제거하고 미리 예열 DPBS를 사용하여 (단계 2.1.8과 2.2.4에서) 각 웰 린스 (2 + 마그네슘 칼슘 무료). DPBS를 대기음 0.25 % 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)의 500 μl를 추가합니다. 공동 인큐베이터에서 37 ℃에서 1-3 분 동안 인큐베이션. 혈청을 함유하는 성장 배지 500 μl를 첨가함으로써 트립신 처리를 중지. 참고 : 사용 적절한 미디어 볼륨 플라스크 / 요리의 종류에 따라 : 10 7 세포 / 100mm 요리 / 150cm 2 플라스크 당 1 ml의; 5 × 10 6 세포 / 60mm 접시 당 0.5 ㎖ / 75cm 2 플라스크. </li><li> 실온에서 2 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 전송 세포 펠렛 세포. 실온에서 2 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 DPBS로 마그네슘 (Mg 2 +, 칼슘 -free)과 펠렛 세포를 세포를 세척 하였다. </li><li> 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. 얼음에 튜브를 놓습니다. 50 ~ 200 ㎕의 얼음처럼 차가운 라디오 - 면역 침전 분석 (RIPA) 버퍼 (완충 성분 표 2 참조) 갓 추가 함유하는 펠렛을 재현 탁배속 최종 농도에서 에드 프로테아제 및 포스 파타 아제 억제제. 간략하게, 튜브를 와동 30 분 동안 얼음에두고. </li><li> 4 ° C에서 20 분 동안 16,000 XG에 스핀. 조심스럽게 얼음에 튜브를 배치합니다. 피펫을 사용하여 얼음에 보관 신선한 사전 냉각 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. 펠렛을 폐기하십시오. </li></ol> 배양 된 세포에서 핵 추출물 4. ​​준비 <ol><li> 각 웰 (단계 1.2.5)의 경우, 미리 예열 DPBS 마그네슘 (Mg 2+, 칼슘 무료) 1 ㎖로 두 번 배양 cytotrophoblasts을 씻는다. 기음 DPBS와 0.25 % 트립신 / EDTA 500 μl를 추가합니다. 공동 인큐베이터에서 37 ℃에서 1-3 분 동안 인큐베이션하고, 혈청 함유하는 성장 배지 500 μl를 첨가함으로써 트립신 처리를 멈춘다. </li><li> 실온에서 2 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 전송 세포 펠렛 세포. 원심 분리하여 DPBS 마그네슘 (Mg 2+, 칼슘 - 무료) 및 펠릿 세포와 세포를 씻으실온에서 2 분 동안 300 XG에. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 모든 상층 액을 제거하고 얼음에 튜브를 배치합니다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 핵 단백질을 추출합니다. 단백질 정량 분석​​ (브래드 포드 또는 bicinchoninic 산 분석 (BCA))를 사용하여 각 샘플의 단백질 농도를 결정한다. </li></ol> 5. 샘플 준비 및 전기 영동 <ol><li> 단백질 정량 분석하여 각 세포 추출물, 단백질 농도를 결정한다 (예를 들어, 브래드 포드 8 BCA 9). </li><li> (항체 감소 및 변성 조건에서 사용할 수있는 경우) 제조업체의 지침에 따라, 총 단백질의 20 ~ 30 μg의에 배 램 믈리 샘플 버퍼 (표 2)의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 5 분 동안 100 ° C에서 삶아의 세포 용 해물. 반복 된 동결 / 해동 사이클을 피하고 나중에 사용하기 위해 -20 ℃에서 나머지 튜브를 저장할 해물 나누어 50-100 μL. </리&gt; <li> 샘플이 가열되는 동안, 버퍼 (표 2)를 실행 1 배 1 L를 준비합니다. </li><li> 몇 초 동안 16,000 XG에서 샘플을 스핀과 얼음에 배치합니다. </li><li> 분자량 마커와 함께 12 % SDS-PAGE 겔 (겔 조성은 표 2 참조)의 각 웰에 동일한 양의 단백질을로드. 100 V.에서 2 시간에 1 젤을 실행 </li></ol> 6. 막 겔로부터 단백질 전송 <ol><li> 1 분 동안 메탄올로 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인을 활성화하고 1X 전송 버퍼 / 10 % 메탄올 수용액으로 씻어. 제조업체의 지시에 따라, 단백질을 크기에 따라 1 시간 30 분 동안 옮긴다. 주 : 전사 효율이 차단 공정 전에 개양귀비 빛 레드 염색을 이용하여 평가 될 수있다. </li></ol> 7. 항체 염색 <ol><li> (1) 상온에서 시간 또는 밤새 4 ℃에서 5 %의 블로킹 용액을 이용해 박막을 차단. </li><li> 6 안티 - 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH; 0.4 μg의 / ㎖; 1 : 500)으로 5 %의 차단 용액 중에서 밤새 :; 항 Syncytin-2 항체 (5000 1-4 μg의 / ㎖)과 함께 막을 인큐베이션 39 ° C (항 Syncytin-2) 상온에서 45 분 동안. TBS 버퍼 트윈에 멤브레인을 세 번 세척 (TBST, 버퍼 컴포지션 표 2 참조) 5 분. </li><li> 적절한 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)와 함께 막을 인큐베이션 공역 계 항 - 토끼 또는 항 - 마우스 항체 (1 : 10,000) 5 % 실온에서 1 시간 동안 TBST 버퍼에서 차단된다. 5 분 동안 멤브레인을 TBST에 세 번 세척 한 후 TBS에 헹군다. 화학 발광 계 블롯 기판을 이용하여 신호를 검출한다. </li></ol> 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드 8. 방사성 표지 <ol><li> 인산화 반응 <ol><li> 미세 원심 분리 관에, 1 배속 U T4 폴리 뉴클레오타이드 키나제 완충액 순방향 올리고 뉴클레오티드 (50)를 따라 추가 NGT4 폴리 뉴클레오티드 키나제 20 μCi를 (γ- 32 P) ATP와 클레아없는 물 20 μL의 반응 볼륨을 구성합니다. </li><li> 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 0.5 M EDTA의 5 μl를 추가하여 반응을 중지합니다. 클레아없는 물 50 μL에 볼륨을 확인합니다. </li></ol></li><li> 올리고 뉴클레오티드에서 비법 인 뉴클레오티드의 제거 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 TE 버퍼 (표 2)으로 평형화 G-25 컬럼을 준비합니다. 신선한 DNase의 프리 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 열을 놓습니다. </li><li> 천천히 지층을 방해하지 않도록주의, 수지를 통해 (단계 8.1.2에서) 프로브의 50 μl를 추가합니다. 350 XG에 2 분 동안 스핀은 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 정제 된 샘플을 수집합니다. microcentrifuge 관에를 수집하기 위해 350 XG에 2 분 동안 뉴 클레아없는 물과 스핀의 36 μL와 G-25 컬럼을 씻으십시오. </li></ol></li><li> 상보 가닥 올와 하이브리드igonucleotide <ol><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 방사성 표지 된 프로브 (86 μL)를 전송하고 (200) 역 올리고 뉴클레오티드의 NG 및 어닐링 버퍼의 1 배 (표 2)를 추가합니다. 열 95 ° C에서 5 분, 냉각, 실온에서 밤새두고. </li><li> 앞으로 레이블이없는 50 NG를 추가하여 비 방사성 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드를 준비하고 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 올리고 뉴클레오티드 및 어닐링 버퍼의 1 배 역. 클레아없는 물 100 μL에 볼륨을 확인합니다. 열 단계 8.3.1에 ​​기술 된 바와 같이 실온에서 보관하십시오. </li></ol></li></ol> EMSA에 대한 비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 9. 준비 <ol><li> 1.5 mm의 공간 빗 (겔 조성물 표 2 참조) 4 % 기본 겔 (10 × 12cm)를 준비합니다. 증류수를 사용하는 모든 유리 접시를 청소합니다. 참고 :이 판 SDS와 같은, 이온 성 세제를 완전히 무료 것이 중요합니다. </li><li> 즉시 페이지와 플레이트 사이에 우리의 아크릴 아미드 용액 중합 (약 30 분)를 진행 할 수 있습니다. </li><li> 전기 영동 장치를 조립하고 0.5 배의 TBE와 탱크를 채우십시오. 샘플 로딩하기 전에 150 V에서 1 시간 30 분 동안 젤을 사전 실행합니다. </li></ol> 10. DNA 결합 반응 <ol><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 1 배 젤 시프트 바인딩 버퍼 (표 2) 핵 추출물 (단계 4.3)의 10 μg의 추가 및 뉴 클레아없는 물 10 μL에 최종 볼륨을 구성합니다. 대조군으로, 아니 핵 추출물 튜브를 준비합니다. 경쟁 반응에, 차가운 비 특정 또는 특정 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드 (단계 8.3.2) 1 μl를 추가합니다. </li><li> 각 반응 단계 8.3.1에서 방사성 프로브의 1 μl를 추가합니다. 20 분 동안 실온에서 반응을 부화. 반응 당 10 배 겔 로딩 버퍼 1 μl를 추가하고 섹션 9에서 제조 된 겔의 각 샘플을로드합니다. </li><li> 15에서 2 시간에 1 1/2의 젤을 실행마이그레이션 후 0 V.은 형광면 아래 노광 카세트 플라스틱 랩 위치 겔 유리 랩. 24 시간 동안 4 ° C에서 카세트를 남겨주세요. </li><li> 노광 카세트 화면을 제거하고 스캐닝 형광 촬상 장치에 삽입한다. </li></ol>

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<li>Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoplex+morphologies+and+their+influences+on+transfection+efficiency+in+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery.</a> J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).</li>
<li>Freeley, M., Long, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+siRNA+delivery+to+T-cells%3A+potential+clinical+applications+for+inflammatory+disease%2C+cancer+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection.</a> Biochem. J. 455, 133-147 (2013).</li>
</ol>

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인간의 태반 기능과 개발에 관한 연구는 매우 다양한 태반 세포 집단의 분리를 최적화하기위한 프로토콜이 향상되었습니다. 최고의 연구 된 태반 세포 집단 중 하나는 매우 효율적이고 신뢰할 수있는 격리를 허용 최적화 된 프로토콜에서 도움이되고 연구되는의 융모 cytotrophoblasts을, 남아있다. 이것은 또한 이러한 형질 전환 및 프로모터 연구 등의 실험의 수를 허용했다. 이전에 설명 된 프로토콜을 사용하여 3 차 융모 cytotrophoblasts 순수 집단을 얻을 수있다. CK-7 cytotrophoblasts 표현되는 중간 필라멘트 단백질이다. 이 단백질에 대한 단일 클론 항체는 태반 (10)에서 자신의 분리 후이 영양막 세포 인구의 순도를 결정하는 데 사용됩니다. 준비는 세포의 96 %는 CK-7에 대한 긍정적 때 순수로 정의된다. 이어서 세포를 형질 감염을 위해 직접적으로 사용될 수있다. 형질 프로토콜지질 - 기반 접근법을 포함하는 광범위 기본 셀 (...

인간의 태반 기능 장애는 자간전증 및 자궁 내 성장 제한과 같은 여러 임신 관련 질병의 발병과 관련이 있습니다 1. 태반의 중요한 세포 구성 요소는 영양막아세포(trophoblast)이며, 이는 외융모세포(extravillous 또는 villous cytotrophoblasts)로 분류될 수 있습니다. 융합 시, 융모 세포영양아세포(villous cytotropphoblast)는 태아-모계 교환 및 호르몬 생산에 중요한 역할을 하는 다핵 세포 구조인 세포영양아세포층(syncytiotrophoblast)층으로 더욱 분화합니다 2. 인간 1차 융모세포세포(primary villous cytotrophoblast)와 이들의 분화된 대응물은 중요한 생물학적 시료를 나타내며 연구자들은 이를 통해 배양에서 세포 융합과 같은 여러 태반 관련 과정을 연구할 수 있습니다. 또한, 임신 관련 질병에 특이적인 예방 요법을 개선하고 적절한 관리를 촉진할 수 있는 지표를 식별하기 위한 실질적인 노력이 진행 중입니다. 실험실에서는 융모 태반의 트립신 소화에 기초한 표준 분리 절차를 사용하여 신선한 태반에서 일차 인간 융모 세포영양아세포를 일상적으로 분리합니다 3. 배양된 세포영양아세포(cytotrophoblast)가 배양 4 시 세포영양세포와 같은 층에서 증식하고 빠르게 분화할 수 있는 능력을 잃게 됨에 따라 매우 효율적인 transfection 방법과 최적화된 분석 접근법이 필요합니다. 이전 연구에서는 이러한 1차 세포영양아세포(primary cytotrophoblast)의 최적 형질주입 조건을 결정했다 5. 본 명세서에서는 이 세포 유형 6에서 이전에 시험된 다른 siRNA 형질주입 방법이 제시된다. 리포펙션(lipofection) 기반 접근법과 비교하여, 이 미세천공법(microporation method)은 특정 유전자의 침묵(silencing) 정도에 따라 평가되는 transfection을 개선합니다.
프로모터 및 유전자 발현 연구는 또한 태반 기능에 대한 더 나은 이해를 제공합니다. 1차 융모 세포영양아세포를 배양할 수 있는 기간이 짧기 때문에 사용하기가 더 어렵지만, 그럼에도 불구하고 이전에 발표된 바와 같이 표준 프로토콜을 사용한 프로모터 분석을 해결할 수 있습니다 7. EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay)는 일반적으로 사용되는 체외 방법 중 하나로, DNA-단백질 상호 작용을 빠르고 쉽게 모니터링할 수 있습니다. 이러한 1차 영양막아세포(trophoblast)의 핵 추출물을 사용하여 Syncytin-2 promoter의 영역에서 특정 상호 작용을 테스트했습니다. 그 결과 결합 인자는 배양의 다른 시점과 특이적이고 재현 가능한 방식으로 검출될 수 있는 것으로 나타났습니다.
이 프로토콜에 제시된 데이터는 당사의 transfection 접근법과 EMSA 프로토콜이 분리된 1차 융모 세포영양아세포에 사용될 수 있으며 정상 또는 병리학적 조건에서 융모 세포영양아세포의 다양한 기능을 연구하는 데 매우 유용할 것임을 확인합니다.

<table><tbody><tr><td>HBSS 없이&nbsp; Ca2+, Mg2+&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#H2387</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x)</td><td>Sigma</td><td>#14060-057</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고혈당 없이</td><td>Gibco</td><td>#12100-061</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1 M)</td><td>Gibco</td><td>#15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x)</td><td>Gibco</td><td>#15640-055</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B&nbsp;</td><td>시그마</td><td>#A2411</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>#C4901</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>#16170-078&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>퍼콜&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#P-1644</td><td>밀도 구배</td></tr><tr><td>Syncytin-2 siRNA</td><td>Ambion Life 기술</td><td>#AM16708</td><td></td></tr><tr><td>스크램블 siRNA</td><td>Qiagen</td><td># SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D5025</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, type I&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#T8003</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT Lipotransfection&nbsp; 시약&nbsp;</td><td>GEhealthcare</td><td># T-2001-01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Life technologies</td><td>#25300-062</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche 진단</td><td>#11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23225</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>#P9416&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>항토끼 IgG, HRP 결합 항체&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>#7074</td><td></td></tr><tr><td>BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD)</td><td>Roche Diagnostic</td><td>#11500708001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>#14287-080</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제</td><td>NEB</td><td>#M0201S</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]</td><td>Perkin Elmer</td><td>#BLU002A100UC</td><td></td></tr><tr><td>아크릴미드</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>#A9099</tr><tr><td>TEMED</td><td>Life technologies</td><td>#17919</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>#A3678</tr><tr><td>항인간 사이토케라틴-7 항체 클론 LP5K, FITC 결합</td><td>Millipore</td><td>CBL194F</td><td>희석 1:200</td></tr><tr><td>FcR 차단 시약&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130- 059-901</td><td>희석 1:10</td></tr><tr><td>플로우 사이토미터 BD Acuri 시스템</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microporator MP-100 장치&nbsp;</td><td>디지털 바이오</td><td></td><td></td></tr><tr><td>재현탁액 R (네온 트랜스펙션 시스템 100&nbsp; &마이크로; l Kit)</td><td>Life Technologies</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인&nbsp;</td><td>밀리포어</td><td>IPVH00010&nbsp;</td><td>메탄올로 활성화</td></tr><tr><td>Anti-human GAPDH 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-137179</td><td>1:500</td></tr><tr><td>HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody</td><td>Cell Signalling</td><td>#7074</td><td>1:10,000</td></tr><tr><td>HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody</td><td>Cell Signalling</td><td>#7076&nbsp;</td><td>1:10,000</td></tr><tr><td>NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약</td><td>Thermo Scientific</td><td>#78833</td><td></td></tr><tr><td>G-25 열&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>#27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>화학발광 및 형광 이미징 장치</td><td>Montr&eacute; al Biotech</td><td>Fusion FX5</td><td></td></tr><tr><td>4% 천연 젤</td><td>집에서 만든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>집에서 만든</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>개인 분자 이미저(PMI) 시스템</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

갓 고립 된 인간의 산모 cytotrophoblasts에 sirna를 형질 및 emsa 분석

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

인간 1차 융모 세포영양아세포(primary villous cytotrophoblast)는 태반 기능과 조절 메커니즘을 연구하고 임신과 관련된 질병을 이해하는 데 매우 유용한 원발세포입니다. 이 프로토콜에서는 표준 DNase/트립신 프로토콜을 통해 태반에서 갓 분리된 인간 1차 융모 세포영양아세포(human primary villous cytotrophoblast)가 작은 간섭 RNA(siRNA)로 미세포레이트됩니다. 이 접근법은 리포펙션(lipofection) 기반 방법과 비교했을 때 siRNA transfection에 더 큰 효율성을 제공했습니다. transfection된 세포는 transfection 후 3-4일의 기간 내에 표준 웨스턴 블롯으로 분석할 수 있습니다. 또한 배양된 1차 융모 세포영양아세포를 사용하여 EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay) 분석을 최적화하고 1일차부터 4일차까지 추출물에 대해 수행했습니다. 이러한 배양된 일차 세포와 설명된 프로토콜의 사용은 융모 세포영양세포가 syncytiotrophoblast-like cell layer로 분화하는 과정에서 특정 유전자 및 전사 인자의 의미를 평가할 수 있습니다. 그러나 배양에서 허용되는 제한된 시간 범위로 인해 안정적인 세포 집단 생성과 같이 더 많은 시간이 필요한 방법을 사용할 수 없습니다. 따라서 이 세포 집단을 테스트하려면 고도로 최적화된 유전자 전달 프로토콜이 필요합니다.

임신 기간에서 신선한 태반은 프로토콜 부분에 제시된 실험 세트를 수행하기 위해, 인간 융모 cytotrophoblasts 주를 분리 하였다. 이들 분리 후, 우리는 먼저 사이토 케라틴 -7- 마커 (도 1)의 사용을 통해 cytotrophoblasts의 순도를 분석 하였다. 세포 제제는 따라서 단일 클론 항 - 사이토 케라틴 -7- 항체를 이용하여 염색 하였다. 1 유동 세포 계측법 표준 분석 기본 융모 cytotrophoblasts 정제 다음 대표적인 실험 결과를 나타내는 도표. 밀도 구배 단계 후에, (이 경우에는 99 %)&gt; 97 %의 세포를 적극적하여 이러한 세포 유형의 정제 효율이 매우 높은 수준을 보여주는 표준 실험 사이토 케라틴-7 염색. 그들의 분리 ...

이 프로토콜은 효과적으로 격리 갓 인간 융모 cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 감염 microporation을 사용하여 이들 세포의 DNA 단백질 복합체를 식별하는 방법을 설명한다. 형질 감염된 세포는 웨스턴 블롯에 의해 모니터링 될 수 있고, EMSA는 4 일간의 배양 기간 동안 분석한다.

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 갓 분리한 일차 융모 세포영양막세포의 형질전환을 위한 최적 조건을 입증하고, 프로모터 부위에서의 DNA-단백질 상호작용을 식별하는 방법을 제시하는 것입니다. 이 방법은 세포영양막세포 분화에 관여하는 유전자 및 그 발현에 관여하는 조절 기전과 관련된 문제 등 태반 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수행하기 쉽고 매우 효율적이라는 점입니다.또한, 이 실험을 수행하는 데 필요한 시간은 짧으며 많은 다양한 샘플을 포함할 수 있습니다. 이러한 절차의 시연은 제 실험실의 이전 박사 과정 학생이었던 Chirine Toufaily와 연구원 Yong Xiao가 담당할 것입니다. 여기서는 표준 프로토콜에 따라 신선한 태반에서 일차 융모 세포영양막세포를 분리합니다.이 프로토콜의 첫 번째 단계는 FACS 분석을 통해 준비물의 순도를 분석하는 것입니다. 먼저, 갓 분리한 cytotrophoblasts 1×10⁶개를 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 제거합니다.미리 데워둔 PBS 1 mL를 첨가하고 원심분리를 반복합니다. 흡입법으로 PBS를 제거한 후, 세포에 차가운 메탄올 1 mL를 첨가하고 -20 °C에서 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 원심분리를 통해 세포를 펠렛화한 후, 흡입법으로 메탄올을 제거합니다.그런 다음 세포를 재수화하기 위해 펠렛에 실온의 PBS 1 mL를 첨가합니다. 세포를 원심 분리하고 PBS를 제거한 후, FC 수용체 차단 시약이 포함된 FBS 함유 PBS를 첨가하고 비특이적 결합을 제거하기 위해 실온에서 45분 동안 배양합니다. 배양 시간이 지나면 실온의 PBS 500 µL로 세포를 두 번 세척하며, 이때 매회 300 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다.마지막 PBS 세척액을 제거한 후, 상온의 PBS 100 microliters에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 마우스 단일클론 FITC 접합 항-인간 사이토케라틴 7 항체 클론 LP5K 또는 대조군으로 사용되는 동형 상응 비특이적 항체와 함께 상온의 암소에서 4분 동안 세포를 배양합니다. PBS로 세포를 세척한 후, 유세포 분석법을 통해 형광을 분석합니다.유세포 분석으로 CK7 양성 세포가 최소 96% 이상임이 확인된 세포 준비물을 후속 실험에 사용하십시오. 마이크로포레이션 장치를 사용하여 인간 일차 융모 세포영양막세

sirna-transfection-emsa-analyses-on-freshly-isolated-human-villous

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 프로토콜에서는, 우리는 Percoll 기울기를 사용하여 trophoblast 세포의 분리에 이어 임신 d10.5에 마우스에서 placentae의 절개를 설명합니다. 우리는 matrigel의 침공 분석에서 분리 된 세포의 사용을 보여줍니다.

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

이 원고는 저산소증/재산소화 하에서 배양된 면역정제된 인간 융모 세포영양아세포 세포의 독특한 체외 모델을 제시합니다. 이 모델은 멜라토닌과 같은 유망한 치료법이 산화 스트레스 증가 및 태반 기능 변화와 관련된 임신 합병증에 대한 보호 효과를 연구하는 데 적합합니다.

인간의 기본 영양막 세포 멜라토닌에 대해 저산소증의 보호 효과를 연구하기 위해 세포 배양 모델 / 재산 소화에 의한 혼란

영양막 거대 세포(TGC)는 태반에서 건강한 임신을 보장하는 데 중요한 역할을 합니다. 우리는 착상 후 배아의 저온 유지 절편에서 초기 형광 제자리 교잡 또는 배아 7일차 외부 태반 원뿔의 단기 배양에 의해 TGC에서 유전자의 전사 상태를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

의 초기 RNA 물고기에 의해 전사 분석<em&gt; 생체</em&gt; 영양막 세포 거대 세포 또는<em&gt; 체외</em&gt; Ectoplacental 콘의 Explants의 단기 문화

여기서, 우리는 인간 탯줄 (UC)와 코드에 태아 태반 샘플 분리 용 (CL), 왓슨의 젤리 (WJ), 코드 - 태반 접합부 (CPJ) 태아 태반 (FP) 라이닝 박리를위한 프로토콜을 제시 상기 이식편 배양 기술을 이용하여 중간 엽 간질 세포 (MSC들)의 특성화.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

여기에서는 뼈 형태 생성 단백질 4 및 Activin/Nodal 경로의 억제제를 사용하여 인간 만능 줄기 세포에서 인간 융막 세포를 효율적으로 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 인간 만능 줄기 세포의 효율적인 분화에 적합하며 유전자 조작을 위해 많은 양의 세포를 생성할 수 있습니다.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

여기에 제시 된 인간 placental villous 조직의 기본 세포 배양에 대 한 cytotrophoblasts의 격리 다음 샘플링에 대 한 프로토콜이입니다. TNFα와 trophoblasts의 치료 비만 자궁내 환경에 염증이 분자 대상 산 모 비만과 염증 반응과에 의해 규제의 발견을 촉진 한다.

태에서 Autophagy의 규제에 모성 비만과 관련 된 염증의 효과 연구 하는 기본 인간 Trophoblast 모델

이 연구는 가역 조직 삭제, immunostaining, 3D 렌더링 및 인간 태 반 villi 샘플 1-2 m m3의 순서에 혈관 네트워크의 분석에 대 한 프로토콜을 선물 한다.

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

이 프로토콜은 응용 프로그램 (예: immunocytochemistry, cytometry, 등)의 다양 한 사용 될 수 있는 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집한 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 메서드를 보여 줍니다 목표로 임신 합병증에 다른 세포 인구의 역할...

기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립

여기, 우리는 3 개의 생체 외 분석 실험을 사용 하 여 인간의 trophoblast 셀에 셀 운동 평가 위한 매우 액세스할 수 있는 프로토콜 제시: 스크래치 분석 결과, transwell 침략 분석 결과 및 세포 확산 분석 실험.

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

현재 프로토콜은 영양막 세포와 같은 세포가 세포외 기저막 매트릭스 층에 걸쳐 모세관 같은 구조로 조직되는 고전적인 체외 혈관 형성 분석에서 형성된 튜브와 같은 구조를 복구할 수 있도록 합니다. 회수된 구조는 다양한 생화학 분석을 위한 RNA 및 단백질 분리에 사용됩니다.

분화 마커 발현 분석을 위한 Angiogenesis-Tube Formation Assay에서 영양막 세포 회수

이 프로토콜은 인간 기저 배반의 소추모 및 융모막에서 1차 HLA-G+ 외 영양층(EVT)의 정제, 특성 분석 및 배양을 가능하게 합니다. 1차 EVT 배양은 96시간 동안 생존 가능성을 유지하여, 샘플이 일치한 모체 면역세포와의 공동 배양과 이들의 상호작용에 대한 유동 세포 및 분자 분석을 가능하게 합니다.

표현형 및 기능 분석을 위한 HLA-G+ 외 영양층 정제 인간 임기 태반 조직에서

학습하세요 마이크로포레이션을 이용한 신선한 인간 융모 세포영양세포의 siRNA 형질도입 및 EMSA 분석 방법을. 이 기술은 태반 연구에서 유전자 발현 조절 메커니즘을 규명하는 데 효과적입니다.

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

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