Name: 모델 시아 노 박테리아 종의 표시 및 Markerless 돌연변이의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: 학습하세요 시아노박테리아 Synechocystis sp. PCC6803에서 마커 없는 돌연변이와 Synechococcus sp. PCC7002에서 표시된 돌연변이를 생성하는 방법을. 항생제 내성 유전자 삽입과 음성 선택 마커를 활용하여 반복적인 유전자 조작이 가능한 이 기술은 산업용 균주 개발에 활용됩니다.

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

표시되지 않은 돌연변이의 발생에 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 1)주의 플라스미드 디자인은 대상 지역이 변경 될 수 있도록; 2) 샘플 자당에, 특히 배양 무균 유지 보장; 3) 도금 처음에 24 시간 이상 한천 플러스 항생제 첨가하여 항생제, 부족 BG11 아가 플레이트 상에 표시 돌연변이 생성 세포를 형질 전환; 4) 배양은 BG11 플러스 자당 한천 플레이트에 도금하기 전에 4 완전 일 돌연변이 표시 : 5)로 표시 돌연변이가 완전히 분리 된 것을 보장하고 6) 완전히 돌연변이 균주의 유전자형을 확인. 이 마지막 단계에서, 삭제 된 영역의 일부를 증폭하기위한 프라이머의 추가는 그것을 제거되었음을 확인하기 위해 사용될 수있다. 서던 블롯은 힘든 상태도 사용될 수있다. 그러나, 우리의 경험은이 문서에서 설명하는 절차는 돌연변이의 적절한 검증을위한 충분한 것입니다. 이 절차는 또한 Synechococ의 현저한 돌연변이를 생성하기 위해 사용되어왔다기분이야 elongatus PCC7942. 그러나,이 cyan...

시아 노 박테리아는 지구상의 거의 모든 자연 환경에서 발견되는 박테리아의 진화 고대하고 다양한 문이다. 해양 생태계에서 그들은 특히 풍부 탄소 고정 (1)의 약 절반, 바다에서의 질소 고정 2와 탄화수소 생산 3 톤의 수억의 대부분이 매년 회계, 많은 영양주기에 중요한 역할을한다. 엽록체, 진핵 조류와 식물의 광합성을 담당하는 세포 기관은 숙주 생물체 (4)에 의해 침몰 된 cyanobacterium에서 진화 한 것으로 보인다. 시아 노 박테리아는 식물에 보존되어 많은의 광합성, 전자 수송층 (5) 및 생화학 적 경로의 연구에 유용한 모델 생물을 증명했다. 추가 시아 노 박테리아에서 점점 그들의 안녕에 전기 7 및 산업용 화합물을, 6 바이오 연료, 식량 생산을 위해 8을 사용하고 있습니다물과 CO 2의 ghly 효율적으로 변환 태양 에너지 (9)를 사용하여 바이오 매스합니다. 많은 종은 잠재적으로 농업 생산에 영향을주지 않고 큰 규모로 성장시킬 수있는 시아 노 박테리아를 제안, 최소한의 영양분과 해수와 비 경작지에 재배 할 수있다. 어떤 종은 항진균, 항균 및 항암 화합물 10, 11를 포함하는 천연 제품의 소스입니다. 돌연변이 체를 생성 할 수있는 능력은 산업 목적을 위해 균주의 개발을위한 시아 노 박테리아 광합성, 생화학 및 생리학을 이해하는 키 필수적이다. 발표 된 연구의 대부분은 유전 적 관심 부위에 항생 물질 내성 카세트의 삽입에 의해 변형 균주 생성한다. 이것은 몇 항생제 내성 카세트 박테리아에서 사용할 수있는 등의 균주에 도입 할 수있는 돌연변이의 수를 제한한다. 항생제 재를 부여하는 유전자를 포함하는 균주sistance 바이오 연료 및 다른 낮은 값 (12)의 제품을 생산하는 유일한 비용 효과적인 수단이 될 가능성이 개방 연못 산업 생산을 위해 사용될 수 없다. 도장이 돌연변이 체의 생성은 이러한 한계를 극복한다. 표시없는 돌연변이 의도적으로 포함하지 않는 한, 외래 DNA를 함유하지 않고, 여러 번 조작 할 수있다. 따라서, 원하는대로 변형에 많은 변화를 생성 할 수있다. 또한, 수정 위치의 하류 유전자에 극성 효과는 유기체 (13)의보다 정확한 수정 있도록 최소화 될 수있다. 삭제할 유전자 측부 시아 노 박테리아 염색체에 지역에 두 개의 DNA 단편 동일한 포함하는 돌연변이 균주, 자살 플라스미드를 생성하려면 먼저 구성된다 (5 &#39;및 3&#39;측면 영역을 지칭). 두 유전자는 이러한 측면 영역 사이에 삽입된다. 이들 중 하나는 항생제 내성 단백질을 코딩; 둘째가 sacB, 어떤 자극 인코딩levansucrase uces, 화합물은 자당에 대한 민감성을 부여. 공정의 제 1 단계에서 표시 돌연변이 일부 외래 DNA를 함유 한 균주가 생성된다. 플라스미드 구조체는 시아 노 박테리아 세포와 혼합하고, DNA를 유기체에 의해 자연적으로 수행된다. 형질 전환은 적절한 항생제와 PCR에 의해 확인 돌연변이 유전자형을 포함하는 한천 플레이트에 성장에 의해 선택된다. 자살 플라스미드 관심 균주 내에서 복제 할 수 없습니다. 따라서 어떤 항생제 내성 콜로니는 관심있는 유전자의 염색체에 삽입함으로써 재조합 사건에 기인 할 것이다. 도장이 돌연변이 체를 생성하기 위해, 돌연변이 표시된 후 바로 5 &#39;및 3&#39;플 랭킹 영역을 포함하는 제 자살 플라스미드와 혼합된다. 외래 DNA의 삽입이 필요할 경우, 이러한 DNA 단편 사이에 삽입 관심의 유전자를 포함하는 카세트 영역 측면 5 &#39;및 3&#39;이루어지는 플라스미드를 사용할 수있다. 실리ction은 자당을 포함하는 한천 플레이트에 성장을 통해입니다. 가 sacB 유전자 산물이 발현되는 경우 수크로오스가 세포에 치명적이기 때문에, 생존 세포 만이 크로스 민감성 유전자, 항생제 내성 유전자 이외에에서 재결합되어있다 두번째 재조합 이벤트가 발생하는 것과이있다 염색체와 플라스미드. 재조합 교환 결과적으로, 측면 영역들과 이들 사이의 DNA가 염색체에 삽입되어있다. 우리는 성공적으로 스티스 특검팀의 동일한 균주에 여러 염색체 돌연변이를 생성하기 위해 이러한 방법을 사용했다. (이하 스티스라고 함) PCC6803 13, 14는 관심 (13)의 유전자로 유전자 카세트의 발현에 대한 하나의 점 돌연변이를 소개합니다. 도장이 녹아웃의 생성 스티스 15,16 상세한 방법에서 우리의 작업에 앞서 입증되었지만, 힘 입어중요한 단계의 시각적 표현은 공개적으로 사용할 수 없습니다. 우리는 또한 다른 모델 cyanobacterium, 인 Synechococcus 특검팀에 표시된 녹아웃의 생성을 위해 동일한 방법을 적용했습니다. PCC7002 (이하 인 Synechococcus 함). 이 프로토콜은 돌연변이 검증 이들 균주를 저장하기위한 신속한 프로토콜을 생성하기위한 명확하고 간단한 방법을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>시그마</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Fisher</td><td>EDT002</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Sigma</td><td>339067</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Sigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td>시그마</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>시그마</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Co(NO3)2.6H2O</td><td>시그마</td><td>239267</td><td></td></tr><tr><td>구연산 철 암모늄</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>시그마</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Fisher</td><td>SODC001</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>시그마</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>SODH001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>시아노코발라민</td><td>시그마</td><td>47869</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3</td><td>Sigma</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 한천</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Fisher</td><td>SUC001</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 90mm 트리플 벤트</td><td>Greiner</td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro; m 필터</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>100 ml 원뿔형 플라스크</td><td>Pyrex</td><td>CON004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 100 mm x 38&nbsp; m</td><td>Bemis</td><td>FIL003</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 고충실도 DNA 중합효소&nbsp;</td><td>Phusion</td><td>F-530</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>DNA 정제 키트&nbsp;</td><td>MoBio</td><td>12100-300</td><td></td></tr><tr><td>제한 엔도뉴클레아제</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 리가제</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani 육수</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET 플라스미드 miniprep kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>14 ml round-bottom tube</td><td>BD falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polymerase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>425-600 &micro; m 유리 구슬</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>형광 전구</td><td>Gro-Lux</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>HT multitron photobioreactor</td><td>Infors</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

모델 시아 노 박테리아 종의 표시 및 markerless 돌연변이의 생성

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

시아노박테리아는 생태학적으로 중요한 유기체이며 바이오 연료 및 유용한 산업 제품 생산을 위한 잠재적인 플랫폼입니다. 시아노박테리아, 특히 Synechocystis sp. PCC6803 및 Synechococcus sp. PCC7002와 같은 모델 유기체의 유전자 조작은 기초 및 응용 연구 모두를 위한 핵심 도구입니다. 항생제 내성 카세트(하나 이상의 유전자를 포함하는 조작 가능한 DNA 단편)를 삽입하여 염색체 변형을 균주에 도입한 다음 음성 선택 가능한 마커를 사용하여 이 카세트를 제거하는 것은 특히 강력한 기술입니다. 표시되지 않은 돌연변이는 반복적으로 유전적으로 조작될 수 있으며, 원하는 만큼 균주에 많은 변형이 도입될 수 있습니다. 또한, 돌연변이된 균주에서 항생제 내성 단백질을 암호화하는 유전자가 없다는 것은 항생제 내성 유기체가 환경으로 '탈출'할 가능성을 피하기 때문에 바람직합니다. 그러나 시아노박테리아의 반복적인 유전자 조작에 대한 자세한 방법은 과학 문헌에 잘 설명되어 있지 않습니다. 여기에서 우리는 이 기술에 대한 포괄적인 설명을 제공하며, 이 기술에 대한 포괄적인 설명을 제공하여 다중 결실, 관심 유전자 내 단일 지점 돌연변이 및 새로운 유전자 카세트를 삽입하는 돌연변이를 생성하는 데 성공적으로 사용했습니다.

플라스미드 설계는 모두 표시되고 표시되지 않은 돌연변이 체의 생성에 성공에 중요하다.도 1 플라스미드 (A)의 일례를 제공하고 B는 스티스 유전자 cpcC1 및 cpcC2 13 결실 돌연변이 체의 생성에 사용. 각 경우에 5 &#39;및 3&#39;플 랭킹 영역은 약 900-1,000 염기쌍이다. 우리가 성공적으로 상용화에 박차를 가하고있는 최소 약 500 bp의 하였지만 감소 측면 영역을 사용할 수있다. B 플라스미드는 5 &#39;및 3&#39;~ 1킬로바이트 측면 영역 또는 천연 유전자 서열의 변형 된 버전 사이의 유전자 카세트를 포함 할 수있다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54001/54001fig2highres.j...

시아노박테리아에 여러 게놈 변형을 도입하는 것은 산업 및 기초 연구 목적을 위한 균주 개발에 필수적인 도구입니다. 우리는 모델 시아노박테리아 종 Synechocystis sp. PCC6803에서 표시되지 않은 돌연변이와 Synechococcus sp. PCC7002에서 표시된 돌연변이를 생성하는 시스템을 설명합니다.

모델 시아 노 박테리아 종의 표시 및 Markerless 돌연변이의 생성

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

이 절차의 전반적인 목표는 시아노박테리아 Synechocystis 종 PCC6803에서 표시되지 않은 돌연변이와 Synechococcus 종 PCC7002에서 표시된 돌연변이를 생성하는 시스템을 입증하는 것입니다. 이 방법은 시아노박테리아 유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 균주에 염색체 변화를 도입하는 방법.항생제 내성 유전자를 삽입한 후 음성 선택 가능한 마커를 사용하여 이 카세트를 제거합니다. 이 기술의 주요 장점은 균주를 반복적으로 유전적으로 조작할 수 있다는 것입니다. 원하는 만큼 스트레인에 교대를 도입할 수 있습니다.배지를 준비한 후, 시아노박테리아 균주 및 플라스미드, 텍스트 프로토콜에 따라. 시아노박테리아 세포로 가득 찬 루프를 30-50밀리리터의 BG11 배지에 접종하여 신선한 배양을 설정합니다. 섭씨 30도의 빛에서 2-3일 동안 배양물을 0.2에서 0.6과 같은 OD7500으로 성장시킵니다.배양 후 배양 1-2밀리리터를 2, 300g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 버린 후 BG11 배지를 사용하여 펠릿을 한 번 세척하고 부드럽게 피펫팅하여 세포를 다시 현탁시킵니다. 소용돌이는 DNA 흡수에 필수적인 필리(pili)의 손실을 초래할 수 있습니다.세포를 다시 펠릿화하고 상등액을 제거한 후 BG11 배지를 100 마이크로 리터의 최종 부피에 첨가하고 세포를 14 밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 이전에 준비된 플라스미드 A 1마이크로그램을 세포에 첨가합니다. 그리고 부드럽게 탭하여 섞습니다.그런 다음 튜브를 섭씨 30도의 인큐베이터에 수평으로 놓고 4-6시간 동안 배양합니다. 배양 후, 항생제 없이 BG11 한천 플레이트에 세포 배양 플라스미드 DNA 혼합물의 부분 표본을 퍼뜨립니다. 그리고 섭씨 30도에서 배양합니다.약 24 시간 후, 카나마이신이 함유 된 물에 0.6 % 한천 용액을 준비합니다. 그리고 섭씨 42도까지 식히십시오. 그런 다음 배양 플레이트의 가장자리에 2.5-3 밀리리터를 추가하고 플레이트를 기울여 용액이 표면에 균일한 상단 한천 층을 형성하도록 합니다.군체가 보일 때까지 약 7일 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 새로운 BG11 한천과 카나마이신 플레이트를 6 개의 섹터로 나눕니다. 그리고 뭉툭한 끝 이쑤시개를 사용하여 개별 군체를 줄무늬를 만듭니다.PCR을 수행하기 위해 표시된 녹아웃을 확인하기

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Weber, N., et al., 필라멘트 시아노박테리움 포르미디움 라쿠나의 자연 변형, 단백질 발현 및 냉동 보존. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 상동 재조합을 통해 안정적인 GFP 발현 및 항생제 내성을 달성하기 위해 플라스미드 DNA를 사용하여 사상형 시아노박테리아에서 자연 형질전환을 수행하는 절차를 설명합니다.

필라멘트 시아노박테리움 Phormidium lacuna의 자연 변형 및 GFP 발현

출처: Lea-Smith, DJ, et al. 모델 시아노박테리아 종에서 마크 및 마커가 없는 돌연변이체의 생성. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 시아노박테리아에서 항생제 표시 돌연변이를 생성하는 방법을 보여줍니다. 프로토콜은 시아노박테리아 배양으로 시작하여 표면 필리를 보존하는 원심분리 및 세척 단계가 이어집니다. 그런 다음 상동 서열 옆에 있는 항생제 내성 유전자를 운반하는 플라스미드를 도입합니다. 배양하는 동안 플라스미드는 필리를 통해 내재화되고 상동 재조합을 통해 표적 유전자를 대체합니다. 항생제 선택 및 재추출은 돌연변이 균주를 분리하고 정제하는 데 사용됩니다.

상동 재조합을 통한 시아노박테리아에서 항생제 표시 돌연변이체의 생성

온도에 민감한(ts) 치명적인 돌연변이는 필수 기능을 식별하고 분석하는 데 유용한 도구입니다. 여기에서는 높은 처리량으로 ts의 치명적인 돌연변이를 생성하고 분류하는 방법을 설명합니다.

온도에 민감한 치명적인 돌연변이의 높은 처리량 로봇 보조 절연에<em&gt; 클라 미도 모나스의 reinhardtii에서</em

여기 우리는 초보자에 대 한 프로토콜 Streptomyces약리학 중요 한 세균 속에 대 한 형질을 시작 하는 연구원을 제시.

Streptomyces 발달 돌연변이의 영상 및 현미경 평가

여기서, 우리는 i) CyanoGate 모듈식 클로닝 툴킷을 사용하여 자가 복제 벡터를 조립하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시하고, ii) 컨쥬게이션에 의해 시아노박테리아 숙주에 벡터를 도입하고, iii) 형질전환 시아노박테리아 균주를 특성화한다. 플레이트 리더 또는 유세포 분석.

시안게이트 모듈형 복제 툴킷을 사용하여 컨쥬게이션에 의한 시아노박테리아의 유전자 변형

이 프로토콜은 클라미디아 트라코마티스의발달 돌연변이를 식별하고 격리하기 위해 방향유전 적 접근법에서 형광 프로모터 기자, 살아있는 세포 현미경 검사법 및 개별 포괄 추출을 활용합니다.

클라미디아 트라코마티스에서 발달 돌연변이를 식별하고 격리하는 살아있는 세포 앞으로 유전 적 접근

여기에서, 우리는 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 특정 글리코실트랜스퍼라제 또는 영역에서 에어로모나 스의 널 돌연변이체의 구축, 글리칸의 생합성에서 그들의 암호화된 효소의 관여 및 기능을 확립하기 위해 수행된 운동성 분석, 및 편모 정제, 뿐만 아니라 박테리아 병인에서 이러한 글리칸의 역할을 기술한다.

박테리아 운동성에서 박테리아 글리코실트랜스퍼라제의 역할을 밝히기 위한 Null 돌연변이체의 생성

Phormidium lacuna 는 해양 암석에서 분리 된 필라멘트 성 시아 노 박테리움입니다. 이 기사에서는 천연 공급원으로부터의 필라멘트의 분리, DNA 추출, 게놈 시퀀싱, 자연 변형, sfGFP의 발현, 냉동 보존 및 운동성 방법에 대해 설명합니다.

자연 형질전환, 단백질 발현 및 필라멘트성 시아노박테리움 포미듐 라쿠나의 동결보존(Cryoconservation of Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna)

이 프로토콜은 광독립영양 설탕 분비 시아노박테리아 및 종속영양 효모를 포함한 공동 배양의 설정 및 정량적 모니터링을 위한 포괄적인 지침을 제공합니다.

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria(종속영양 효모와 광영양성 설탕 분비 시아노박테리아를 결합한 공동 배양의 조립 및 정량화)

고주파 전기 자극 압수와 같은 활동을 사용하는 것은에서 유도된 수...

의 간질 발작의 돌연변이에 대한 Neurocircuit의 Assays Drosophila</em

학습하세요 시아노박테리아 Synechocystis sp. PCC6803에서 마커 없는 돌연변이와 Synechococcus sp. PCC7002에서 표시된 돌연변이를 생성하는 방법을. 항생제 내성 유전자 삽입과 음성 선택 마커를 활용하여 반복적인 유전자 조작이 가능한 이 기술은 산업용 균주 개발에 활용됩니다.

모델 시아 노 박테리아 종의 표시 및 Markerless 돌연변이의 생성

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