모델 시아 노 박테리아 종의 표시 및 Markerless 돌연변이의 생성

이 절차의 전반적인 목표는 시아노박테리아 Synechocystis 종 PCC6803에서 표시되지 않은 돌연변이와 Synechococcus 종 PCC7002에서 표시된 돌연변이를 생성하는 시스템을 입증하는 것입니다. 이 방법은 시아노박테리아 유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 균주에 염색체 변화를 도입하는 방법.

항생제 내성 유전자를 삽입한 후 음성 선택 가능한 마커를 사용하여 이 카세트를 제거합니다. 이 기술의 주요 장점은 균주를 반복적으로 유전적으로 조작할 수 있다는 것입니다. 원하는 만큼 스트레인에 교대를 도입할 수 있습니다.

배지를 준비한 후, 시아노박테리아 균주 및 플라스미드, 텍스트 프로토콜에 따라. 시아노박테리아 세포로 가득 찬 루프를 30-50밀리리터의 BG11 배지에 접종하여 신선한 배양을 설정합니다. 섭씨 30도의 빛에서 2-3일 동안 배양물을 0.2에서 0.6과 같은 OD7500으로 성장시킵니다.

배양 후 배양 1-2밀리리터를 2, 300g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 버린 후 BG11 배지를 사용하여 펠릿을 한 번 세척하고 부드럽게 피펫팅하여 세포를 다시 현탁시킵니다. 소용돌이는 DNA 흡수에 필수적인 필리(pili)의 손실을 초래할 수 있습니다.

세포를 다시 펠릿화하고 상등액을 제거한 후 BG11 배지를 100 마이크로 리터의 최종 부피에 첨가하고 세포를 14 밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 이전에 준비된 플라스미드 A 1마이크로그램을 세포에 첨가합니다. 그리고 부드럽게 탭하여 섞습니다.

그런 다음 튜브를 섭씨 30도의 인큐베이터에 수평으로 놓고 4-6시간 동안 배양합니다. 배양 후, 항생제 없이 BG11 한천 플레이트에 세포 배양 플라스미드 DNA 혼합물의 부분 표본을 퍼뜨립니다. 그리고 섭씨 30도에서 배양합니다.

약 24 시간 후, 카나마이신이 함유 된 물에 0.6 % 한천 용액을 준비합니다. 그리고 섭씨 42도까지 식히십시오. 그런 다음 배양 플레이트의 가장자리에 2.5-3 밀리리터를 추가하고 플레이트를 기울여 용액이 표면에 균일한 상단 한천 층을 형성하도록 합니다.

군체가 보일 때까지 약 7일 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 새로운 BG11 한천과 카나마이신 플레이트를 6 개의 섹터로 나눕니다. 그리고 뭉툭한 끝 이쑤시개를 사용하여 개별 군체를 줄무늬를 만듭니다.

PCR을 수행하기 위해 표시된 녹아웃을 확인하기 위해 소량의 세포를 50 마이크로 리터의 물과 약 20 425-600 마이크로 미터의 유리 구슬이 들어있는 튜브로 옮깁니다. 15, 700 g에서 5 분 동안 회전하기 전에 5 분 동안 약 2, 000 rpm으로 세포와 비드를 흔듭니다. 그런 다음 5마이크로리터의 상등액을 사용하여 택 DNA 예비 물질로 50마이크로리터 PCR 반응을 준비합니다.

돌연변이를 검증하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 primer를 설계한 후 다음 프로그램을 사용하여 product를 증폭하고 wild-type control을 포함했습니다. gelelektroforeses를 통해 knockout 형질전환체의 유전자형을 검증합니다. 약 4 킬로 베이스 쌍의 띠를 보여주고 야생형 띠가 없습니다.

자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 야생형 밴드가 여전히 존재하는 경우 새 플레이트에 변형을 다시 줄무늬를 만들고 PCR을 반복합니다. 돌연변이가 분리되고 PCR 반응에서 야생형 띠가 관찰되지 않을 때까지 검증 프로세스를 반복합니다.

표시된 돌연변이 프로파일을 보여주는 균주의 경우, 표시되지 않은 녹아웃을 생성하는 데 사용하기 위해 새 플레이트에 줄무늬를 다시 만듭니다. 표시되지 않은 Synechocystis 돌연변이를 생성하려면 세포로 가득 찬 루프를 30-50ml의 BG11 배지에 접종하여 표시된 녹아웃의 신선한 배양을 설정합니다. 2-3일 동안 배양을 0.2에서 0.6과 같은 OD750으로 성장시킵니다.

2, 300g에서 배양 10 밀리리터를 5 분 동안 원심 분리하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 BG11 배지를 사용하여 세포를 부드럽게 씻습니다. 200 μl의 최종 부피에 BG11을 첨가하고 세포를 14 ml의 둥근 바닥 튜브로 옮긴 후 1 μm의 플라스미드 B DNA를 세포에 첨가하고 부드럽게 두드려 혼합합니다.

그런 다음 튜브를 인큐베이터에 수평으로 놓고 4-6시간 동안 배양합니다. 배양 후 1.8ml의 BG11 배지를 첨가하고 진탕하면서 총 4일 동안 샘플을 배양합니다. 이것은 여러 염색체 사본에서 재조합이 일어날 수 있는 충분한 시간입니다.

변형된 배양액의 플레이트 50, 10 및 1마이크로리터 분취액을 BG11과 5% 자당 한천 플레이트에 넣고 약 7일 동안 배양하여 단일 콜로니를 생성합니다. 다음으로, 뭉툭한 끝 이쑤시개를 사용하여 BG11과 카나마이신 플레이트에 30-50개의 개별 콜로니를 부화시킵니다. 그런 다음 BG11과 5% 자당에 패치를 붙입니다.

BG11과 자당에서 자라지만 카나마이신이 있는 플레이트에서는 자라지 않는 콜로니는 표시되지 않은 녹아웃일 가능성이 있습니다. 두 판에서 자라는 군체는 sacB 유전자의 돌연변이로 인해 자당 내성을 가질 가능성이 높습니다. 이 비디오의 앞부분에서 시연된 PCR 방법에 따라 표시되지 않은 녹아웃을 확인하면 야생형 크기에서 삭제된 영역을 뺀 값에 해당하는 겔 밴드가 생성됩니다.

균주가 표시되지 않은 돌연변이 프로파일을 보이면 항생제 없이 새로운 BG11 한천에 다시 줄무늬를 만듭니다. 균주를 장기간 보관하려면 세포로 가득 찬 루프를 30-50 밀리리터의 BG11 배지에 접종하여 균주의 신선한 배양을 설정하십시오. 3-4일 동안 배양물을 성장시키고 OD750을 0.4에서 0.7로 성장시킵니다.

BG11을 사용하여 세포를 한 번 세척한 후 펠릿을 약 2ml의 BG11에 재현탁합니다. 농축된 세포 0.8ml를 하나의 튜브에 추가합니다. 그런 다음 0.2ml의 80% 필터 멸균 글리세롤을 추가합니다.

다른 튜브에 0.93ml의 농축 세포와 0.07ml의 DMSO를 추가합니다. 두 튜브 모두 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 균주를 되살리려면 튜브를 제거하고 뭉툭한 끝 이쑤시개를 사용하여 항생제 없이 한천 플레이트의 일부 세포를 긁어냅니다.

그런 다음 멸균 루프를 사용하여 평소와 같이 줄무늬를 만듭니다. 이 그림은 결실 돌연변이체를 생성하는 데 사용되는 플라스미드 A와 B의 예를 보여줍니다. 각각의 경우에, 5개의 프라임 및 3개의 프라임 판자 영역은 약 900 대 1, 000 염기쌍입니다.

플라스미드 B는 또한 5개의 프라임과 3개의 프라임 사이에 약 1킬로베이스 쌍의 측면 부위 유전자 카세트를 포함할 수 있습니다. 또는 네이티브 유전자 염기서열의 변형된 버전일 수도 있습니다. 플라스미드 A로 형질전환하면 7일에서 10일 후에 수백 개의 콜로니가 플레이트에 나타납니다.

유전자가 필수적이지 않고 돌연변이가 야생형 균주와 유사한 성장을 보이는 경우, 모든 염색체는 PCR을 통해 결정된 바와 같이 사본 npt1/sacB 삽입 서열을 포함해야 합니다. 유전자가 필수적이지 않고 돌연변이가 느리게 성장하는 경우, 카나마이신의 농도가 증가함에 따라 여러 차례의 재 연무 복제가 분리되어 표시된 돌연변이를 얻는 데 필요합니다. 재줄무늬 생성시 표시된 돌연변이가 얻어지지 않으면 해당 유전자는 생존에 필수적일 가능성이 높습니다.

플라스미드 B를 사용한 형질전환에서 얻은 개별 콜로니의 대부분은 카나마이신에 민감하고 자당에 내성이 있습니다. 여기에서 입증된 바와 같이, 이 식민지에 있는 표적 지구의 PCR 확대는, 표식이 없는 돌연변이 단면도의 거의 100%를 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 6주 동안 몇 시간 만에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 멸균 기술을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 산소 생산 측정 또는 가스 크로마토그래피 질량 분석법과 같은 다른 방법을 수행하여 광합성 속도 또는 대사 산물 생성 측정과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후,이 기술은 시아 노 박테리아 유전학 분야의 연구자들을위한 길을 열었습니다.

이 문에서 주요 생화학 및 생리학적 과정과 산업 목적을 위한 발달 균주를 탐구합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 Synechococcus 종 PCC6803에서 표시되지 않은 녹아웃을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.