Name: Zebrafish의에서 에탄올에 의한 섬유 성 간 모델의 개발은 전구 세포 매개 간세포의 재생을 연구하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 학습하세요 제브라피시에서 에탄올 유도 섬유성 간 모델을 이용한 간세포 재생 메커니즘 연구 방법을. 이 비용 효율적인 화학 스크리닝 기법은 단일 세포 가시화를 통해 상세한 시간 경과 분석을 가능하게 합니다.

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이 작품은 우리는 원고의 중요한 읽기 알렘 Giorgis 감사 CHS에 GTEC (2731336 및 1411318)는 NIH (K01DK081351)와 NSF (1354837)에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다.

Zebrafish의 제기 및 기술 기관 동물 관리 및 사용위원회의 조지아 연구소의 승인을 국민 건강의 연구소와의 기준을 충족하는 표준 프로토콜을 사용하여 사육 하였다. 솔루션 1. 준비 <ol><li> 배아 / 애벌레 제브라 피쉬를 유지하기 위해 (상호 교환 &#39;배아 매체&#39;와 함께 사용) 20 L 계란 물을 준비합니다. 증류수 250 ml의 1.5 g CASO 4, 6 g 즉시 바다 바다 소금을 녹여. 20 L 증류수와 선동으로 가득 찬 상자 속에 든 대형 유리 병에 붓는다. </li><li> 1 L 준비 1- 페닐 -2- 티오 우레아 (PTU) 스톡 용액 (20 배). 1 L 증류수에 0.6 g의 PTU 분말을 녹여. 작업 용액 0.003 %의 최종 농도로 20 ml의 배아 매체 당 스톡 용액 1 ㎖를 추가한다. 주의 : PTU는 흡입 또는 피부 노출 다음 전신 독성을 일으킬 수 있습니다. 준비하고 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다. </li><li> 1 L의 에틸 3- aminobe 준비nzoate 메탄 (Tricaine) 원액 (20 배). 증류수에 4g의 Tricaine 분말을 녹여. 1 M 트리스 완충액 (pH 9)을 첨가하여 pH를 7로 조정하고, 증류수 1 L에 최종 부피를 가져온다. -20 ℃에서 50 ㎖로 나누어 저장. 사용하기 전에 해동. 주의 : Tricaine는 감각의 손실을 유도 할 수있다. 준비하고 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다. </li><li> 100 ml의 애벌레 메트로니다졸 (MTZ) 작업 솔루션을 준비합니다. 100 ㎖의 배지에서 배아 0.1 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 0.25 g의 MTZ 분말을 용해시켜 신선한 MTZ 15mM의 용액을 만든다. 격렬한 흔들림에 의해 완전히 MTZ 분말을 녹여. 신선한 MTZ 용액을 만들고 MTZ의 광촉매 열화를 방지하기 위해 알루미늄 박을 사용한다. 주의 : MTZ는 자극의 원인이 될 수 있습니다. 준비하고 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다. </li><li> 100 ml의 유충 에탄올 / 메트로니다졸 (EtOH로 / MTZ) 작업 솔루션을 준비합니다. 신선한 MTZ 용액을 광촉매 드 않도록 알루미늄 호일을 사용MTZ의 그라데이션. 사용 직전 1.5 %의 최종 농도로 100 ml의 MTZ 용액에 1.5 ml의 100 % 에탄올을 추가한다. </li><li> 500 ml의 성인 MTZ 작업 솔루션을 준비합니다. 500 ml의 시스템을 물에 0.1 % DMSO에 0.83 g의 MTZ 분말을 용해하여 신선한 10 mM의 MTZ 솔루션을합니다. 격렬한 흔들림에 의해 완전히 MTZ 분말을 녹여. 신선한 MTZ 용액을 만들고 MTZ의 광촉매 열화를 방지하기 위해 알루미늄 박을 사용한다. </li><li> 1 L PEM 버퍼를 준비합니다. 30.2 g 파이프, 0.74 g의 EGTA, 0.12 g의 증류수에 황산을 녹인다. NaOH를 사용하여 pH 7을 조정합니다. 증류수 1 L에 최종 볼륨을 가져와. </li></ol> 애벌레 Zebrafish의 2. 준비 <ol><li> [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR)의 설정 결합 GT1; TG (TP1 : mCherry) jh11] TG (hand2 : EGFP)와 15,17 성인 제브라 피쉬는 짝짓기 탱크 (13) 성인 제브라 피쉬를 PD24. 시간 제한 짝짓기를 수행하는 디바이더를 사용합니다. </li><li> 는 D를 제거다음 아침 ivider 것은 물고기가 중단없이 짝짓기를 할 수 있습니다. 2 시간 후 시스템 물 긴장과 배아 매체와 100mm 배양 접시에 배아를 전송하여 수확 배아. </li><li> 페트리 접시 당에는 100 개 이상의 배아를 보관하십시오. 실체 현미경에서 유리 피펫을 사용하여 미 수정 난자를 제거합니다. 28 ° C에서 배아 성장 및 안료 개발을 억제 10 시간-후 수정 (HPF) 후 0.003 %의 최종 농도 페닐 티오 요소 (Phenylthiourea) (PTU)를 추가합니다. </li></ol> 애벌레 Zebrafish의 3. 에탄올, 메트로니다졸 치료 및 간 재생 <ol><li> 1.5 %의 최종 농도로 배아 매체에 에탄올을 첨가하여 신선한의 EtOH 용액을 제조 하였다. PTU를 추가하지 마십시오. </li><li> 56 80 HPF에 페트리 접시 당 20 ml의 에탄올 용액으로 배아를 취급합니다. 에탄올의 증발을 방지하기 위해 플라스틱 포장으로 배양 접시를 커버. </li><li> 정렬 아웃 [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR) GT1; TG (TP1 : mCherry) jh11 </SUP&gt;; TG (hand2 : EGFP) 80 HPF에서, CFP의 식에 의해 결정되는 비슷한 간 크기 PD24] 애벌레. EtOH로 처리 된 애벌레를 정렬 할 때이 이후의 EtOH / MTZ 처리와 높은 사망률의 원인이되므로 Tricaine을 사용하지 마십시오. 페트리 접시 당 30 배아의 밀도로 정렬 된 유충을 유지합니다. </li><li> 0.1 % DMSO에 배아 매체에 신선한 15 mM의 MTZ를 준비합니다. 1.5 %의 최종 농도를 만들어 MTZ 용액에 적당량의 EtOH를 추가한다. 28 ° C에서 24 시간 동안 배양 접시 당 20 ㎖의 EtOH / MTZ 솔루션의 애벌레를 품어. 빛으로부터 보호하기 위해 EtOH로 농도와 알루미늄 호일로를 유지하기 위해 플라스틱 포장으로 배양 접시를 커버. </li><li> 처리의 끝에서, 신선한 배아 매체 새로운 배양 접시에 애벌레를 전송하여를 EtOH / MTZ 용액을 제거한다. 배아 매체와 유충을 3 회 세척하고 PTU없이 20 ㎖ 배아 매체에 보관하십시오. </li><li> 형광을 관찰, 간세포의 거의 완전한 제거와 유충을 정렬하려면80X의 배율에서 CFP 필터와 표면 형광 현미경. 간에서 최소한의 CFP 형광의 성공적인 절제의 결과와 크게 감소 간 볼륨. </li><li> 의 EtOH / MTZ 처리 유충의 죽음을 방지하기 위해, 정렬 Tricaine을 사용하지 마십시오. 면역 염색의 유충을 수정 (5 장 참조) 또는 추가 분석을 위해 28 ° C에서 배양 접시에 정렬 된 유충을 유지합니다. </li></ol> EtOH로 / MTZ 처리 애벌레 Zebrafish의 4. 화학 화면 <ol><li> DMSO에 10 밀리미터에게 화학 주식을 포함하는 96 웰 플레이트를 가지고 ° C의 냉동고에서 -80 (상용 화학 라이브러리에 대한 자세한 내용은 재료 목록 참조). 화학 물질의 광촉매 열화를 방지하기 위해 알루미늄 호일로 커버. 부드러운 락으로 실온에서 재고 솔루션을 녹여. </li><li> 96 웰 플레이트에서 50 μM (최종 농도 배아 배지 10 mM의 스톡 용액을 희석 한 약액을 조제 : 초기들creen; 1.5 ml의 튜브 : 재시험). 제어 유충은 배아 매체에서 DMSO의 동일한 농도로 처리 하였다. </li><li> 중 96 웰 (초기 화면)에, 1.5 %의 EtOH / 15 mM의 MTZ로 처리하고 전술로 분류 된 거의 완전한 간세포 절제, 또는 24 웰와 전송 유충 (재시험) 판의 밀도로 배아 매체로 채워져 물론 당 5 애벌레. 각 화학 물질에 대해 중복 우물을 사용합니다. </li><li> 배아 매체를 제거하고 250 μL (96 웰 플레이트) 또는 각 웰에 500 μL (24 웰 플레이트) 화학 솔루션 중 하나를 추가 할 수 있습니다. 알루미늄 호일 커버 플레이트 및 28 ° C에서 50 시간 동안 유충을 취급합니다. 매일 화학 몸을 담글 유충을 검사하고 개별 우물에서 죽은 유충을 제거합니다. </li><li> 화학 처리의 끝에서, 80X의 배율로 CFP 필터와 표면 형광 현미경 CFP 발현 간세포의 수 및 / 또는 강도를 관찰한다. 사진 라이브 애벌레를 보여주는 향상 또는 감소D 번호 및 / 또는 기록을 위해 디지털 카메라와 CFP 발현 간세포의 강도. </li><li> 섹션 5에 설명 된대로 공 촛점 이미징을위한 포름 알데히드 고정하여 유충을 보존합니다. </li><li> 초기 화면에서 간세포 재생을 촉진 화학 물질을 다시 테스트하기 위해, 4.1-4.5 ( &#39;재시험&#39;)에 설명 된 절차에 가장 효과적인 농도를 찾기 위해 더 낮은 농도에서 자신의 힘을 확인합니다. </li></ol> 5. 애벌레 Zebrafish의 고정, 면역 염색 및 공 촛점 이미징 <ol><li> 0.02 %의 최종 농도로 첨가하여 Tricaine 유충 마취. 1.5 ㎖의 튜브에 10-15 유충을 전송하고 인산 완충 식염수 (PBS)로 한번 세척 하였다. PBS를 제거하고 4 ℃에서 O / N를 해결하기 위해 PEM 버퍼에 새로 제조 된 2 %의 포름 알데히드 1 ㎖를 추가합니다. 주의 : 포름 알데히드가 자극을 원인과 인간 발암 물질로 알려져있다. 화학 흄 후드에서 처리합니다. </li><li> 워싱턴 제대로하고 솔루션을 고정 폐기RT에서 PBS와 SH 3 번. 고정 유충 수일까지 4 ℃에서 PBS에 보관 될 수있다. 다음 단계로 진행 즉시 면역 더 나은 결과를 제공한다. </li><li> 조심스럽게 실체 현미경 하에서 # 55 집게를 사용하여 간 영역을 다루는 노른자 피부를 제거합니다. </li><li> Permeabilize 하시려면 및 블록 버퍼 블록 유충 (4 % 소 혈청 알부민 0.3 % PBS에 트리톤 X-100) O / N 4 ° C에서. </li><li> 1의 희석에 토끼 항 - 콜라겐 I 항체와 함께 품어 : (100)를 블록 버퍼 O에서 / N을 4 ℃에서. 세척 버퍼 (PBS에서 0.3 % 트리톤 X-100)를 15 분마다 5 회 반복한다. </li><li> 1의 희석에 AlexaFluor와 647 복합 당나귀 항 - 토끼 항체를 품어 : 200 블록 버퍼 O에서 / N을 4 ℃에서. 세척 버퍼와 15 분마다 5 회 반복한다. 그 후 PBS로 한번 씻어. </li><li> 조심스럽게 왼쪽 측면이 위를 향하도록 유리 피펫 및 동양 고정 애벌레를 사용하여 유리 슬라이드에 애벌레를 전송합니다. 초과 PBS 사용하여 매직 잉크를 킴 와이프를 제거합니다. 장착 미디어 방울을 추가매니큐어와 및 밀봉 용 커버 유리. 실시 공 촛점 영상은 즉시 매우 좋습니다. </li><li> 이미지를 캡처하는 40X / 1.3 오일 렌즈가 장착 된 공 초점 시스템을 사용합니다. 20-50%에서 레이저 강도를 사용합니다. 1 ㎛ 간격으로 Z 스택 이미지를 캡처합니다. </li></ol> 성인 Zebrafish의 6. 준비 <ol><li> [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR)의 설정 결합 GT1; TG : 상대 탱크 (TP1 mCherry) jh11] 15,17 성인 제브라 피쉬. 수확 시스템 물 긴장과 배아 매체와 100mm 배양 접시에 배아를 전송하여 다음 날 아침 배아. </li><li> 페트리 접시 당에는 100 개 이상의 배아를 보관하십시오. 실체 현미경에서 유리 피펫을 사용하여 미 수정 난자를 제거합니다. 28 ° C에서 배아 성장 및 안료 개발을 억제하기 위해 10 HPF 후 0.003 %의 최종 농도 PTU를 추가합니다. </li><li> 4 DPF에서 애벌레를 마취하고 분류하는 Tricaine를 사용하여 [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR)GT1; TG (TP1 : mCherry) jh11] 애벌레. 신선한 배아 매체를 여러 번 변경하여 Tricaine을 씻으십시오. 그들이 분 18 당 120-180 비트의 정상적인 심장 박동을 달성 할 때까지 애벌레가 28 ° C에서 복구 할 수 있습니다. </li><li> 표준 절차 (19)에 따라 6-12개월 이전에 정렬 된 유충을 올립니다. </li></ol> 성인 Zebrafish의 7. 에탄올, 메트로니다졸 치료 및 간 재생 <ol><li> 6~12개월 된 [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR)로 이동 GT1을; TG : 그물을 사용하여 상대 탱크 (TP1 mCherry) jh11] 성인 제브라 피쉬. 탱크 당 10 개 이상의 물고기의 밀도로 물고기를 유지합니다. </li><li> 1 %의 최종 농도 시스템 물을 EtOH을 첨가하여 신선한의 EtOH 용액을 제조 하였다. 각 탱크에 500 ml의 EtOH를 용액으로 성인 물고기를 치료하고 28 ° C 배양기에서 그들을 유지합니다. </li><li> 매일 신선한 EtOH로 솔루션에 전송 성인 물고기, 폐기 죽은 물고기 소품생물 학적으로 지함. 지속적으로 MTZ 처리하기 전에 72 시간 동안 동물을 취급합니다. </li><li> 0.1 % DMSO의 시스템 물에 신선한 10 mM의 MTZ 솔루션을 준비합니다. 28 ° C를 인큐베이터에서 MTZ 솔루션을 미리 따뜻하게. 28 ° C에서 8 시간 동안 1 L 횡단 탱크에서 500 ml의 MTZ 솔루션으로 물고기를 치료 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 치료 기간 동안 매 시간 관찰하고 즉시 죽은 물고기를 제거합니다. 생물 학적으로 제대로 죽은 물고기를 폐기하십시오. MTZ 처리의 끝에서 두 시스템 신선한 물 동물 전사함으로써 MTZ 씻어. </li><li> 동물이 28 ° C에서 인큐베이터에서 회복하고 유지 할 수 있습니다. 피드 및 분석을위한 시점까지 매일 신선한 시스템 물에 물고기를 전송합니다. </li></ol> 8. 성인 Zebrafish의 간 고정, 면역 염색 및 공 촛점 이미징 <ol><li> 0.02 % Tricaine와 성인 물고기를 마취하고 15 분 동안 얼음 물에 안락사. 팻 물고기 종이 타월에 건조하고 해부 매트에 놓습니다. </li><li> 이전으로 피부와 근육을 제거하여 위장 기관을 노출 20을 설명했다. 항문 지느러미로 다시 후방 물고기의 측면을 따라 다음 아가미에 뒷 지느러미에서 배를 따라 피부와 기본 근육을 잘라 가위를 사용합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 물고기를 넣고 PBS로 한번 씻어. PBS를 제거하고 4 ℃에서 O / N를 해결하기 위해 PEM 버퍼에 새로 제조 된 2 %의 포름 알데히드의 4를 가하여. </li><li> 제대로 솔루션을 고정 폐기하고, RT에서 PBS로 3 회 세척한다. 고정 된 샘플은 수일 동안 4 ℃에서 PBS에 보관 될 수있다. 다음 단계로 진행하기 바로 면역 더 나은 결과를 제공한다. </li><li> 식도를 잘라 물고기의 체강 내에서 간과 전체 장 해부. 4 %가 절편 금형에 아가로 오스 저 융점와 위장 기관을 포함. </li><li> 앞쪽 끝에서 시작하여 얼음 차가운 PBS에 50 μm의 간격으로 가로 섹션으로 샘플을 잘라 vibratome를 사용합니다. 초 이동A # 1 페인트 브러시를 사용하여 PBS 6 웰 플레이트에 TIONS. </li><li> Permeabilize 하시려면 및 블록 버퍼 O에서 블록 섹션 / N 4 ° C에서. </li><li> 1의 희석에 토끼 항 - 콜라겐 I 항체와 함께 품어 : (100)를 블록 버퍼 O에서 / N을 4 ℃에서. 5 회, 15 분 세척 버퍼와 각을 씻으십시오. </li><li> 1의 희석에 AlexaFluor와 647 복합 당나귀 항 - 토끼 항체를 품어 : 200 블록 버퍼 O에서 / N을 4 ℃에서. 세척 완충액으로 한 번 PBS로 5 회, 15 분 각각을 씻으십시오. </li><li> 조심스럽게 # 1 페인트 브러시를 사용하여 유리 슬라이드에 섹션을 전송합니다. , 매직 잉크를 킴 와이프를 사용하여 여분의 PBS를 제거 설치 미디어의 한 방울을 추가하고, 매니큐어와 인감 커버 유리. 실시 공 촛점 영상은 즉시 매우 좋습니다. </li><li> 이미지를 캡처하는 40X / 1.3 오일 렌즈가 장착 된 공 초점 시스템을 사용합니다. 20-50%에서 레이저 강도를 사용합니다. 1 ㎛ 간격으로 Z 스택 이미지를 캡처합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

우리는 심지어 내가 콜라겐 섬유의 유형을 포함하여 ECM 단백질의 상당한 양의 존재의의 HPC가 간세포로 재생하기 위해 자신의 역량을 유지하는 것이 시사의 EtOH / MTZ 처리 복구 간에서 HPC 매개 간세포의 재생을 관찰했다. 의 EtOH 만 처리는 HPC 활성화 (15)를 유도하지 않은 반면, MTZ 전용 치료는 크게 ECM 단백질의 침착을 증가하지 않았다. 조합의 EtOH / MTZ 처리를 이용하여, 우리는 섬유 성 간에서 HPC 기반의 재생을 조사 할 수 있었다. 간세포의 거의 완전한 제거는 HPC 중심의 간세포 재생을 이끌어, 클러스터 NRCS에 의해 간세포 특이 형광의 유무의 기준에 따라 MTZ 처리 유충과 크게 감소 간 볼륨을 정리하는 것이 중요합니다. 동물 수의 음료 또는 intraga을 요구하는 것을 허용 할 필요가 없기 때문에 물고기에서, 길 및 피부의 혈관, 알콜 (24)을 흡수포유 동물 모델에서와 같이 STRIC 주입. 우리는 물을 순환하지 않고 ...

간 실질 주요 세포 타입 간세포 하나의 놀라운 재생 능력에도 불구하고, 만성 간부전 간장 전구 세포 (HPC) 의존성이 재생 선도,이 능력을 손상시킨다. 만성 간 손상은 주로 알코올 남용, 만성 C 형 간염 바이러스 (HCV) 감염 (3) 및 비 - 알코올성 지방 간 질환 (NAFLD) (4)로부터 유도된다. 이 세포 외 기질 (ECM) 단백질의 축적과 연관되어 유지 간 섬유증으로 이끈다. 지속 ECM 축적 이후 높은 이환율과 사망률과 간경변의 결과로, 섬유 반흔 조직 (5)을 형성하여 그대로 간 구조를 왜곡. 많은 시도가 profibrogenic 사이토 카인 활성을 억제 근섬유 6에 초점을 주로 섬유 성 반응을 완화하기 위해 이루어졌다. 후자는 주로 H (간 성상 세포에서 유래희주), 간 흉터 형성 (4)에 대한 책임 원칙 간 비 실질 세포. 그럼에도 불구하고, 지속적인 폐의 섬유 성 모욕의 존재 간세포를 재생하는 HPC의 등 내인성 세포 소스를 자극 재생 치료법은 추가 조사를 기다리고 있습니다. 간 섬유화 많은 실험 모델은 포유류에 기재되어있다. 사염화탄소 (사염화탄소)의 반복적 인 주입 널리 뮤린 및 래트 모델 7 간 섬유화를 유도하는 데 사용되어왔다. 높은 지방 (HF)식이 요법과 함께 사용하면 알코올 profibrogenic 유전자 발현 및 간 섬유화 (8)의 실질적인 상향 조절되었다. 지방증 (지질 축적) 급성 알코올 노출의 결과이지만, 더 심각한 간 손상에 취약 9 간을 만든다. 제브라 피쉬, 다니오 레 리오는 재생 연구를위한 귀중한 척추 동물 모델 시스템으로 떠오르고있다. 그래도이러한 도롱뇽과 axolotls 같은 다른 낮은 척추 동물은 제브라 피쉬는 잠재적 인 재생을 조작하는 데 필요한 유전자 조작 및 시각화 전략에 관해서 다른 모델 시스템에 비해 장점이 있습니다 (10) 요인, 재생에 놀라운 능력을 가지고있다. 제브라 피쉬는 단순히 물에 에탄올 (EtOH로)를 추가하여 알코올성 간 질환 (ALD)을 연구하는 매력적인 척추 동물 모델을 나타냅니다. 애벌레와 성인 제브라 피쉬에 급성 EtOH로 노출 간 지방증 11-13 발생했습니다. 성인 지브라 피쉬가 확장을 EtOH 노출을 수신하면, 콜라겐 침착은 섬유증 관련 유전자 (14)의 상향 조절을 관찰 하였다. 그러나, 필요는 폐의 섬유 자극 등의 EtOH에 응답 간 재생을 연구 모델의 개발에 대한 필요성이 존재한다. 최근에는 제브라 15에서 EtOH로 인한 간 섬유화 모델을 개발 하였다. 우리는 애벌레 및 adul에 EtOH로 처리와 간세포 특이 유전자 제거 시스템을 결합t의 제브라 피쉬. 우리가 두 개의 형질 전환 라인을 생성, Tg는 (fabp10a : CFP-NTR) GT1, Tg 및 (fabp10a : mCherry-NTR) GT2, 대장균 nitroreductase (NTR)의 제어하에 각각 시안 mCherry 형광 단백질에 융합 된 단백질 10A, 간 기본 (fabp10a) 프로모터 바인딩 간세포 특이 지방산. 이 시스템에서, NTR은 간세포의 명시 적 죽음을 유도하는 DNA 간 가닥 가교제 (16)로 독성 전구 약물 메트로니다졸 (MTZ)을 변환합니다. 이 모델을 사용하여, 우리는 노치 신호 전달에 반응하는 간 세포의 집단은 간세포의 근처에 부재와 ECM의 초과 간세포로 변환하는 것이 보였다. 우리는 HPC의 이러한 세포를 지정. 또한, 화학 화면을 통해, 우리는 섬유 성 간에서 간세포의 재생을 증가 작은 분자 Wnt 신호의 활성화 및 노치 신호 전달의 억제를 확인 하였다. Therefo다시는 제브라 피쉬에서 우리의 섬유 성 간 모델은 셀 문화 - 또는 포유류 기반 검사 시스템에 비해 뛰어난 화학 검사 시스템을 나타냅니다. 그것은 상당한 비용과 시간을 절약 혜택을 생체 시스템입니다. 여기에서 우리는 EtOH로 유도 된 섬유 성 간 모델을 확립하고 제브라 피쉬에서이 모델을 사용하여 화학 화면을 수행하기위한 세부 절차에 대해 설명합니다. 또한, 시간 코스 분석은 섬유 성 간에서 발생하는 방법 간세포 재생 조사를 실시 하였다. 이 프로토콜은 메커니즘과 섬유 성 간에서 간세포의 재생을 향상시키는 전략을 연구하는 귀중한 도구를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>칼슘 설페이트 헤미하이드레이트 (CaSO4)</td><td>Acros</td><td>AC385355000</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 설페이트 (MgSO4)</td><td>EMD</td><td>MX0075</td><td></td></tr><tr><td>1,4-피페라진 디에탄설폰산 (PIPES)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)- N,N,N&prime;,N&prime; -테트라아세트산(EGTA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>E7023</td><td>200 프루프</td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>메트로니다졸(MTZ)</td><td>시그마-알드리치</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>1-페닐-2-티오우레아(PTU)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-아미노 벤조산 에틸 에스테르 (트리카인)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 정제</td><td>Amresco</td><td>E404</td><td>1정을 100ml 증류수</td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td>에 녹임시<td>그마-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>저융점 아가로스&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>BP165</td><td></td></tr><tr><td>줄기세포 신호 화합물 라이브러리</td><td>Selleck 화학물질</td><td>L2100</td><td>10&nbsp; DMSO</td></tr><tr><td>ActiProbe-1K 라이브러리</td>의 mM 재고 <td>Timtec</td><td>ActiProbe-1K</td><td>10&nbsp; DMSO</td></tr><tr><td>SB 415286</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2729</td>의 mM 재고 <td>DMSO로 10&nbsp; mM</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2924</td><td>DMSO로 10&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Anti-Collagen I 항체</td><td>Abcam</td><td>ab23730</td><td>면역 염색을 위해 1:100에서 사용, 물고기와 반응</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 당나귀 항토끼 IgG (H + L)</td><td>분자 프로브</td><td>A31573</td><td>면역 염색을 위해 1:200에서 사용</td></tr><tr><td>마운팅 미디어 (Vectorshield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>24-well 플레이트</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11255-20</td><td>Dumont #55</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75x25 mm</td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>VWR</td><td>48366-045</td><td>18 mm</td></tr><tr><td>플라스틱 랩</td><td>Fisher Scientific</td><td>22305654</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>Fisher Scientific</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Vibrotome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescentence microscope</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Confocol microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish의에서 에탄올에 의한 섬유 성 간 모델의 개발은 전구 세포 매개 간세포의 재생을 연구하는

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

세포외 기질(ECM) 단백질 축적이 지속되면서 간 섬유화가 지속되면 간의 세포 역량이 상실되어 간세포 기능 장애를 동반한 간경변증이 발생합니다. 여러 가지 간 모욕 중 알코올 남용은 간 기능 부전 및 간세포 암종을 포함한 심각한 건강 문제로 이어질 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 알코올에 반응하여 간세포를 재생하는 내인성 세포 공급원의 정체는 제대로 조사되지 않았습니다. 더욱이, 알코올로 인한 손상에 대한 간세포 재생을 효과적으로 모델링한 연구는 거의 없습니다. 우리는 최근 제브라피시에서 에탄올(EtOH) 유도 섬유성 간 모델을 확립한 것에 대해 보고했는데, 여기서 간전구세포(HPC)는 섬유생성 자극이 있는 상태에서 거의 완전한 간세포 소실 시 간세포를 생성했습니다. 또한, 이 모델을 사용한 화학적 스크리닝을 통해 간세포 재생을 향상시키는 여러 개의 소분자를 확인했습니다. 여기에서는 EtOH 유도 섬유성 간 모델을 개발하고 이 모델을 제브라피시에서 사용하여 화학 스크리닝을 수행하는 절차를 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 섬유성 간에서 간세포가 어떻게 재생되는지에 대한 분자 및 세포 메커니즘을 설명하는 중요한 도구가 될 것입니다. 또한, 이러한 방법은 in vivo에서 만성 간 질환에 대한 새로운 치료 전략의 잠재적 발견을 촉진할 것입니다.

도 1은 유충 지브라 피쉬의 EtOH로 인한 간 섬유화 모델의 개발을 도시한다. 의 EtOH에 제브라 피쉬 애벌레를 노출 프로토콜을 최적화하기 위해, 우리는 먼저 EtOH로 독성을 평가 하였다. 2.5 일 후 - 수정 (DPF) 유충은 동시 24 시간을 EtOH / MTZ 처리 한 다음 24 시간 동안 EtOH 중 농도 1 %, 1.5 %, 2 %를 노출시켰다. 거의 모든 애벌레 콜라겐 등 세포 외 기질 단백질의 희귀 증착 최소한의 폐의 섬유 성 변화를 보여 1 %의 EtOH 이하로 노출 동안 2 %의 EtOH에 노출, 높은 사망률을 일으키는 원인이되었다. 이러한 결과에 기초하여, 유충 24 시간 (2.5-3.5 DPF), 그리고, 동시에 24 시간 (3.5-4.5 DPF) (도 1A)에 대해 MTZ 처리 1.5 % EtOH로 전처리 하였다. 의 EtOH / MTZ 처리 된 유충은 트렁크와 꼬리의 위쪽 곡률,...

과도한 세포외 기질 단백질의 침착으로 인한 지속적인 섬유화는 간경변증을 유발합니다. 알코올 남용은 심각한 간 질환의 주요 원인 중 하나입니다. 우리는 알코올로 인한 부상 시 간세포 재생을 촉진하는 메커니즘과 전략을 연구하기 위해 에탄올 유도 제브라피시 섬유성 간 모델을 구축했습니다.

Zebrafish의에서 에탄올에 의한 섬유 성 간 모델의 개발은 전구 세포 매개 간세포의 재생을 연구하는

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 제브라피쉬에서 에탄올로 유도된 간섬유화 모델을 구축하고, 이 모델을 사용하여 화학적 스크리닝을 수행하는 것입니다. 이 방법은 섬유화된 간에서 간세포가 재생되는 분자 및 세포 메커니즘과 같이 간 재생 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 vevo 화학 스크리닝에서 비용 효율적이며 시간을 절약할 수 있다는 점입니다. 또한, 단일 세포의 시각화를 통해 상세한 시간 경과 분석을 수행할 수 있습니다. 실험 절차는 연구실의 박사후 연구원인 Mianbo Huang과 대학원생 Jin Xu가 시연하겠습니다.텍스트 프로토콜에 따라 시약을 준비한 후, Tp1:mCherry와 fatty acid binding protein 10a:CFP-NTR를 포함하는 성체 형질전환 제브라피시와 Tg(hand2:EGFP) 제브라피시를 사용하여 격리판이 있는 교배 수조를 설정합니다. 다음 날 아침, 격리판을 제거하고 2시간 후에 시스템 워터를 걸러내고 배아를 배아 배지가 담긴 100 millimeter 페트리 접시에 옮겨 수확합니다. 수정 후 56시간(HPF)에 배아에 1.5 percent 에탄올을 첨가합니다.에탄올 증발을 방지하기 위해 플라스틱 랩으로 플레이트를 덮습니다. 그런 다음 28 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 신선한 15 mM MTZ와 0.1% DMSO가 포함된 배아 배지를 준비하고, 에탄올을 최종 농도 1.5%가 되도록 첨가합니다.그 후, 80 HPF에 정렬된 배아를 페트리 접시당 20 milliliters의 에탄올 MTZ 용액으로 처리합니다. 에탄올 증발을 막기 위해 플레이트를 플라스틱 랩으로 덮고, 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 덮습니다. 그런 다음 28 degrees Celsius에서 24시간 동안 배양합니다.다음 날, CFP 필터와 80배 배율의 형광 현미경으로 배아를 관찰하여 간세포가 거의 완전히 절제된 유충을 선별합니다. 화학물질 스크리닝을 수행하기 위해, DMSO에 녹인 10 mM 화학물질 스톡이 담긴 96-웰 플레이트를 -80°C 냉동고에서 꺼냅니다. 화학물질의 광촉매 분해를 방지하기 위해 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고, 실온에서 부드럽게 흔들어 해동합니다.1.5 mL 튜브에 10 mM 스탁 용액 5 µL를 배아 배지 1 mL로 희석하여 최종 농도가 50 µM이 되도록 화학 용액을 준비합니다. 다음으로, 간세포 절제가 거의 완료된 유충 5마리를 배아 배지가 채워진 24웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 그 후, 배아 배지를 제거하고 각 웰에 준비된 화학 용액 500 µL를 첨가합니다.알루미늄 호일로 플레이트를 덮고 유충을 28°C에서 50시간 동안 배양합니다. 배양 후, 형광 현미경의 80배 배율에서 CFP를 발현하는 간세포의 수 및/또는 강도를 관찰합니다. CFP 발현 간세포의 수가 증가하거나 감소한, 또는 강도가 증가하거나 감소한 살아있는 유충의 이미지를 촬영합니다.fatty acid binding protein 10a:CFP-NTR와 TP1:mCherry를 가진 형질전환 제브라피시(Zebrafish)의 교배 쌍을 구성하고, 선별된 치어를 6~12개월령까지 성장시킵니다. 뜰채를 사용하여 성체 형질전환 제브라피시를 교배 탱크로 옮깁니다. 시스템수로 1% 에탄올 신선 용액을 준비한 후, 이 용액 500 mL를 사용하여 교배 탱크의 시스템수를 교체합니다.수조를 28°C에서 72시간 동안 배양하며, 배양 기간 동안 매일 물고기를 신선한 에탄올 용액으로 옮기고 죽은 물고기는 제거합니다. 0.1% DMSO가 포함된 시스템수로 10 mM MTZ 신선 용액을 준비한 다음, 1 L 산란 수조에 있는 물고기에 미리 데워둔 MTZ 용액 500 mL를 첨가합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 수조를 덮습니다.28°C에서 8시간 동안 배양하고 텍스트 프로토콜에 따라 분석하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 마취한 후, 항문지에서 덮개뼈까지 배를 따라 피부와 피하 근육을 가위로 절개하여 위장관 기관을 노출시킵니다. 그런 다음 물고기의 측면을 따라 항문지 방향으로 후방 절개하십시오.물고기를 15 mL 원추형 튜브에 넣고 PBS로 한 번 세척합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 PEM 버퍼로 조제한 3% 포름알데히드 4 mL를 첨가합니다. 물고기를 고정하기 위해 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 세척한 후, 식도를 절단하여 간과 함께 전체 장을 체강에서 적출합니다. 그런 다음 위장관 기관을 섹셔닝 몰드에 넣고 4% 저융점 아가로스를 사용하여 조직을 매립합니다. 이어서 블록을 사다리꼴 모양으로 다듬고 베이스에 접착합니다.그 다음 vibratome을 사용하여 조직의 내부 끝단부터 시작하여 50 µm 간격으로 횡단면 샘플을 절단하고 이를 ice-cold PBS에 담급니다. 1호 붓을 사용하여 절단된 섹션들을 PBS가 담긴 6-well plate로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 섹션들을 면역염색한 후, 1호 붓을 사용하여 섹션들을 유리 슬라이드로 조심스럽게 옮깁니다.마운팅 용액 한 방울과 커버슬립을 추가하기 전에 Kimwipes를 사용하여 과량의 PBS를 제거합니다. 그 다음, 매니큐어를 사용하여 커버글라스를 밀봉합니다. 마지막으로, 40x 1.3 NA 오일 렌즈가 장착된 공초점 시스템을 사용하여 20~50% 강도와 1 µm 간격으로 Z-Stack 이미지를 캡처합니다.이 그림은 ethanol MTZ 처리된 유충에서 몸통과 꼬리의 상향 만곡, 심낭부종 및 부레 팽창 부전이 나타남을 보여줍니다. 여기서 보는 바와 같이, DMSO 처리된 대조군 간에서는 섬유성 type one collagen 침착이 관찰되지 않았습니다. 반면, ethanol MTZ 처리된 간에서는 절제 후 25시간 및 50시간째에 type one collagen 축적이 증가한 것으로 나타났습니다.또한, DMSO 처리된 대조군 간과 비교하여, ethanol MTZ 처리 후 재생 중인 간에서는 HSC의 수가 증가하고 세포질 돌기가 없는 근섬유아세포 유사 형태로 변했습니다. 이 그림은 1% ethanol 처리 후 MTZ를 투여한 성체 제브라피쉬에서 ethanol 유도 섬유화 간 모델의 발달 과정을 보여줍니다. 이러한 시계열 분석 결과, DMSO 처리된 간과 비교하여 ethanol MTZ 처리 후 재생 중인 간의 절제 후 2일, 3일, 4일 차에 type one collagen 침착이 유의하게 증가한 것이 관찰되었습니다.본 화학물질 스크리닝 실험에서는 1.5% 에탄올과 15 mM MTZ 존재 하에 간세포를 제거하였습니다. 그 후 유충을 50시간 동안 화학물질에 노출시켰습니다. glycogen synthase kinase-3 억제제와 같은 다수의 Wnt 작용제 및 Wnt 활성제는 DMSO와 비교하여 간세포 재생을 촉진하였습니다.이러한 데이터는 이 지속적인 섬유화 모델이 간세포 재생을 촉진하는 소분자를 발굴하는 데 매우 유용한 도구임을 시사합니다. 숙달된 후에는 적절히 수행할 경우 이 기술을 1주일 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 간세포의 거의 완전한 절제를 달성하고 절차 전반에 걸쳐 에탄올 농도를 유지하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.이 절차에 따라, 확인된 화학 화합물의 효율성을 포유류 간 손상 모델에서 테스트할 수 있습니다. 이 기술이 개발되면, 만성 간부전 환자를 위한 새로운 치료 전략의 잠재적 발견을 탐색함으로써 세포 재생 치료 분야의 새로운 경로를 열 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 제브라피쉬(Zebrafish)에서 에탄올 유도 섬유성 간 모델을 개발하는 방법과 화학적 스크리닝을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.포름알데히드를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑 착용 및 화학 흄 후드 내에서 시약 취급과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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태아 알코올 노출의 Zebrafish 모델에서 Teratogenic 변경 사항 평가

신진 대사 메모리는 당뇨병 합병증이 지속하고 euglycemia이 약물 달성 후에도 unimpeded 진행되는이 현상이다. 여기 우리는 신진 대사 메모리의 mitotically 보낼 수있는 epigenetic 구성 요소의 시험을 할 수 있다는 점에서 고유 한 당뇨병 zebrafish 모델을...

당뇨병과 신진 대사 메모리의 Zebrafish 모델

제브라피시 담즙 유도 간 재생의 기저에 있는 분자 메커니즘을 평가하는 데 도움이 되도록 우리는 니트로환원효소 발현 간세포가 메트로니다졸 처리 시 유전적으로 절제되는 간 손상 모델을 확립했습니다.  이 프로토콜에서는 간세포 절제 및 담즙 주도 간 재생을 능숙하게 조작, 모니터링 및 분석하는 방법을 설명합니다.

담즙 중심의 간 재생을 연구하는 Zebrafish의에서 간세포 특이 절제

이 프로토콜은 24 시간 동안 2 % 에탄올로 치료 zebrafish의 유충에서 간 조직 분석을 설명합니다. 이러한 급성 에탄올 처리는 간 지방증 및 간 혈관계의 팽창을 초래한다.

Zebrafish에서의 급성 알코올성 간 손상의 조직 학적 분석

여기에서 우리는 애벌레 얼룩말어에 있는 간 크기를 정량화하는 방법을 보여줍니다, 간 성장 및 발달에 유전과 약리학 적인 조작의 효력을 평가하는 쪽을 제공하는.

브라이트필드 현미경을 사용하여 애벌레 제브라피시의 간 크기 정량화

이 작품은 적절한 노출 방법에서 배아 처리 및 에탄올 분석에 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 제브라피쉬 배아에서 에탄올 수준을 정량화하는 프로토콜을 설명합니다.

헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 이용한 제브라피시 배아의 에탄올 수치 정량화

이 프로토콜은 신장 독성 제로 cisplatin를 사용하여 성인 얼룩말 피시에 급성 신장 상해 (AKI)를 유도하는 절차를 설명합니다. 신장 조직에서 염증및 세포사멸을 분석하기 위한 기술과 2가지 기술의 재현성을 평가하는 단계, 각각 세포측정및 TUNEL을 상세히 설명했다.

성인 얼룩말 피시에 있는 Cisplatin에 의해 유도된 급성 신장 상해 모형

이 프로토콜은 간 재생의 연구를 가능하게 하기 위하여 성인 얼룩말물고기에 있는 간의 복부 엽을 제거하기 위한 절차를 기술합니다.

성인 얼룩말 피시의 부분 간 절제술

여기에서는 콜레스테롤 과잉이 간 미세 환경 및 면역 세포 환경에 미치는 영향을 연구하기 위해 비 알코올성 지방간 질환 (NAFLD) 관련 간세포 암종 (HCC) 제브라 피쉬 모델을 생성하는 방법을 제시합니다.

제브라피쉬에서 비알코올성 지방간 질환 관련 간세포암의 초기 진행 중 간 미세환경 분석

이 작업은 제브라피쉬 배아에 형질전환 구조를 만들어 주입하기 위한 게이트웨이 기반 복제 방법인 모듈식 Tol2 형질전환 시스템에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Zebrafish Tol2 시스템: 유연한 모듈식 게이트웨이 기반 트랜스제네시스 접근 방식

여기에서 우리는 수정 후 최소 1일에서 7일 사이의 모든 단계에서 제브라피시 배아와 유충에서 높은 공간적 및 시간적 해상도로 세포를 이식하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

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학습하세요 제브라피시에서 에탄올 유도 섬유성 간 모델을 이용한 간세포 재생 메커니즘 연구 방법을. 이 비용 효율적인 화학 스크리닝 기법은 단일 세포 가시화를 통해 상세한 시간 경과 분석을 가능하게 합니다.

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