Name: 준비 및 분석 체외 3 차원 유방 암 서로 게이트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 학습하세요 체외 3차원 유방암 서로게이트 제조 및 조직학적 분석 방법을. 관류 바이오리액터 시스템을 활용한 세포 밀도 측정 기술로 생리학적 관련성 높은 암 모델링이 가능합니다.

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앨라배마 대학교 버밍엄 대사성 뼈 질환 센터(University of Alabama at Birmingham Center for Metabolic Bone Disease)는 대리모의 조직학적 처리 및 절편화를 수행했습니다. Southern Research(앨라배마주 버밍엄)는 생물반응기 시스템 제조를 지원했습니다. 자금은 미국 국방부 유방암 연구 프로그램(BC121367)에서 제공했습니다.

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<li>Horning, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+tumor+model+for+in+vitro+evaluation+of+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs.</a> Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).</li>
<li>Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+chitosan+scaffold-based+MCF-7+cell+culture+for+the+determination+of+the+cytotoxicity+of+tamoxifen%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen.</a> Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).</li>
<li>Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironment+in+breast+cancer+progression%3A+biology+and+implications+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 227(2011).</li>
<li>Mao, Y., Keller, E. T., Garfield, D. H., Shen, K., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+in+tumor+microenvironment+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 303-315 (2013).</li>
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<li>Roskelley, C. D., Desprez, P. Y., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix-dependent+tissue-specific+gene+expression+in+mammary+epithelial+cells+requires+both+physical+and+biochemical+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 12378-12382 (1994).</li>
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<li>Ivascu, A., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+single-tumor+spheroids+for+high-throughput+cell+function+and+toxicity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of single-tumor spheroids for high-throughput cell function and toxicity analysis.</a> J Biomol Screen. 11 (8), 922-932 (2006).</li>
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<li>Sadlonova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+fibroblasts+modulate+epithelial+cell+proliferation+in+three-dimensional+in+vitro+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Breast fibroblasts modulate epithelial cell proliferation in three-dimensional in vitro co-culture.</a> Breast Cancer Res. 4, (2004).</li>
<li>Wendt, D., Marsano, A., Jakob, M., Heberer, M., Martin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillating+perfusion+of+cell+suspensions+through+three-dimensional+scaffolds+enhances+cell+seeding+efficiency+and+uniformity%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Oscillating perfusion of cell suspensions through three-dimensional scaffolds enhances cell seeding efficiency and uniformity.</a> Biotechnol Bioeng. 84 (2), 205-214 (2003).</li>
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<li>Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+signatures+of+human+mammary+carcinoma+identify+novel+metastasis+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+extracellular+matrix+constituents+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of extracellular matrix constituents in breast cancer.</a> Semin Cancer Biol. 6 (3), 165-173 (1995).</li>
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<li>Otali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effects+of+formalin+fixation+and+tissue+processing+on+immunorecognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Combined effects of formalin fixation and tissue processing on immunorecognition.</a> Biotech Histochem. 84 (5), 223-247 (2009).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기서, 3 차원 배양 방법은 더 가깝게 모델 인간 유방암은 recapitulative 차원 형태의 개발을 허용하는 양으로, 세포 외 기질 (ECM) 및 인간 간질 섬유 아세포를 포함하는 조직의 미세 환경의 구성 요소를 포함하고 그 설명되었지만 . 기재된 3D 배양 방법은 ECM의 3 차원 볼륨에 포함되는 여러 종류의 세포의 전통적인 2 차원 세포 배양에 비해 인간의 질병을 더 나타낸다. 이 조직 구조는, 미세 환경, 및 차원의 신호 계정 1,8-으로 수행되기 때문에 이러한 파라미터 (예를 들어, 여러 세포 유형, ECM 및 3D 볼륨) 생물학적 과정을 연구하기 위해 더 충당 컨텍스트를 제공하는 것이 주목되고있다. 3D 배양하는 다른 방법은 이전에 3 차원 행렬 (29)의 상부에 세포 배양 물을 포함 설명되었지만, 스페 로이드 (30)의 발생이 매달려 드롭 (31)는이 cutluresND 미세 유동 장치 (32)의...

보다 정확하게 생체 내에서 종양의 구조와 미세 모방 삼차원 (3D) 모델은 배양 세포 및 미세 사이의 복잡한 상호 작용을 해부 후보 치료제의 효능을 시험 할 목적으로 연구에 중요하다. 종양 차원에 영향을 산소 및 영양소 구배 약물 노출 삽입 압력 / 혈류 및 3D 구조 1-4의 균일. 적절한 기질 미세 환경의 존재는 종양 차원 및 영향 셀 ECM 시그널링 및 간질 세포 및 악성 상피 세포 사이의 주변 분비 신호에 기여한다. 종양 차원 및 세포 기능의 미세 환경의 영향은 잘 약물 반응 1,3,5-8을 변경하는 두 요소로 설정됩니다. 또한, 세포 성장 속도론, 신진 대사 속도와 세포 신호는 원숭이 이러한 요소와 함께, 3D로 두 차원 (2D) 문화와 문화 사이에 차이가세포 반응 1,3,8-10을 cting. 시험관 내에서 종양 미세 환경 대리 대표적 ECM 성분 및 간질 세포 집단을 포함하여 변조 될 수있다. 악성 상피 세포는 더 종양 전파 5,6,10-을 억제하기 위해 ECM 및 암 관련 기질 세포에 의해 하나 종양의 진행을 촉진 상승 / 보호 방식으로 또는 억제 방식으로 영향을 받는다. 어느 상황에서, 간질 약물 전달 1,6- 감소 분비 시그널링을 통해 그리고 / 또는 결과적으로 종양 내 삽입 압력을 증가시킴으로써, 치료 반응 및 약물 전달에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 전임상 모델에 ECM 및 간질 세포의 추가 차원 배양에서 잘 모델링 될 수 종양의 양태 요점을 되풀이 도울 것이다. 본원 방법은 ECM 성분 및 (S)를 포함하는 미세 recapitulative 통합 유방암 대용을 수립3 차원 볼륨 tromal 세포를 설명한다. 유방암에서 간질 세포 집단은 주로 암 관련 아세포 (CAF)과 간질 ECM 구성되어 주로 라미닌 콜라겐 타입 IV를 포함하는 기저막에서 발견되는 매트릭스 성분의 적은 비율로 콜라겐 타입 I로 구성되는 1,4,11-13. 그러므로, 유방 종양 미세 환경의 이러한 구성 요소 (즉, CAF는 콜라겐 I 및 기저막)는 대리로 통합되었다. 이 방법은 고체 비 - 관류 차원 대리 (도 1A)를 생성하거나 바이오 리액터 (도 1b)을 통해 서로 게이트를 통해 매체의 관류를 포함하도록 구성 될 수 사용될 수있다. 두 가지 접근법은 여기에 설명되어 있습니다. 이 방법은 또한 종양 연관된 대 식세포와 같은 다른 기질 요소를 포함하는, 또는 적절한 셀룰러 및 ECM 성분을 조정함으로써, 고형 종양을 모델링하기 위해 수정 될 수있다. <p유방 암종 대리 대한 클래스 = &quot;jove_content가&quot;&gt; 여기서 설명 우리는 MDA-MB-231 (231) 유방암 세포주, CAF는 이전 인간 유방암 (14)로부터 격리 이용했다 및 ECM은 (90 % 콜라겐 I 이루어지는 6 ㎎ / ㎖) 및 10 %의 성장 인자 감소 된 기저막 재료 (BM). 대리 역시 8 웰 챔버 슬라이드 (고체 대리)에서 성장하거나 바이오 리액터 시스템은 연속 관류 영양소 (관류 대리)를 제공하는데 이용된다. ECM 포함 된 셀의 체적을 수용 할 수있는 관류 생물 반응기 시스템 (15)을 사용할 수있다. 예를 들어, 우리는 바이오 리액터에서 조직 대용의 제조를 설명한다. 이 시스템은 자체 개발 및 상업적으로 사용할 수 없습니다되었다. 우리의 초점은 여기에 3 차원 조직 대용의 준비 및 분석에 있기 때문에, 우리는 우리의 생물 반응기 시스템의 제조 및 조립의 특성에 대한 광범위한 세부 사항으로 사라하지 않았습니다. 그러나, 상세한 설명이 시스템의 개발은 16 게시되었습니다. 본 생물 반응기 시스템에서, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 유로는 PDMS 발포체 지원하는 대리를 수용하기 위해 사용된다 (Calcagnile 외. (17)에 의해 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 형성됨). 이 볼륨 연속적 대리 산소와 영양분을 공급하는 펌프를 통해 microphysiologic 매체에 의해 관류되는 4 마이크로 채널 (직경 400 μm의 각각)에 의해 관통된다. 대용의 적절한 분석은 치료 또는 다른 조작에 응답하여 세포 기능에 대한 관련 정보를 얻기 위해 매우 중요합니다. 대체물은 고정 및 가공 후 분비 된 제품 또는 조직 학적 섹션을 분석을 위해, 공 초점 현미경 또는 비 침습성 영상화의 다른 수단의 조정 배지 또는 관류 액을 분석함으로써 간접적으로 세포 분석을 이용하여 그대로 대용 직접 영상을 포함하는 다양한 방법에 의해 분석 될 수있다 에파라핀. 조직학 부분에 평가 될 수있다 그러한 파라미터는 셀 밀도이다. 우리는 세포 밀도를 측정하는 한 가지 방법을 제시한다 (즉, 단면적 당 유핵 세포의 수) 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 염색을 대리 학적 섹션 현미경인가 반자동 화상 처리 기술을 사용. 세포 밀도는 시간에 따른 세포 수의 상대적인 변화의 지표로 사용할 수도 있고, 그 다양한 성장 조건으로 치료의 결과. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54004/54004fig1.jpg" /> 그림 1. 3D 볼륨 및 생물 반응기 시스템. 프로세스 A) 도식은 고체의 3D 대리를 생성합니다. 탑 : ECM (핑크), (노란색) 상피 암 세포 및 CAF (오렌지)를 포함하는 고체 3D 볼륨의 만화; 아래 :. 8 잘 챔버 슬라이드 포함 대리의 상위 뷰 B) 도식 프로세스는 3D 대리를 관류 생성합니다. 탑 : 캘리포니아채널 3D 볼륨의 rtoon 매체 관류 및 포함하는 ECM (핑크), 상피 암 세포 (노란색), 및 CAF (오렌지)을 허용하는 단계; 중간 : 발포 PDMS (흑색 화살표)를 포함 PDMS 유로의 이미지 셀 ECM + 주입 및 직경 400 μm의 측정 중합체 피복 스테인리스 와이어 (핑크 화살표)을 관통하는 단계; 바닥 :. 대리 함유 연속 매체 관류를 허용하는 바이오 리액터 시스템에 연결된 PDMS 유로의 화상 (연동 펌프 및 미디어 저장하지 않음) C) 배양 후의 고체 관류 대용 모두 처리 단계의 이미지. 왼쪽 : 젤 대리를 처리하는 표본을 포함하는 cryomold의 이미지; 중간 : 고정 가공 대리를 함유하는 파라핀 블록의 이미지; 오른쪽 :. 대리의 H &amp; E 염색 조직 학적 섹션 유리 슬라이드의 이미지 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54004/54004fig1large.jpg" target="_blank">을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 더 큰 버전.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco의 수정된 Eagel Medium 1x (DMEM)</td><td>Corning CellGro</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin + 2.21&nbsp; mM EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트, 100&nbsp; mm</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229620</td><td>멸균</td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트, 35&nbsp; mm</td><td>CellTreat Scientific 제품</td><td>229638</td><td>PDMS 폼 형성&nbsp;</td></tr><tr><td>9" 유리 피펫</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>13-678-20D</td><td>멸균</td></tr><tr><td>10ml 피펫</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229210B</td><td>멸균</td></tr><tr><td>1,000 &마이크로; l 피펫 팁</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-166</td><td>멸균 필터</td></tr><tr><td>200 &마이크로; l 피펫 팁</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-141</td><td>멸균 필터</td></tr><tr><td>10 &마이크로; l 피펫 팁</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-158</td><td>멸균 여과</td></tr><tr><td>15ml 원뿔형 튜브</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229410</td><td>멸균</td></tr><tr><td>50ml 원추형 튜브</td><td>CellTreat Scientific 제품</td><td>229422</td><td>멸균</td></tr><tr><td>1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>FisherBrand</td><td>05-408-129</td><td>멸균</td></tr><tr><td>트리판 블루</td><td>코닝 Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td>메 마른</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>전자 현미경 과학</td><td>24236-10</td><td>PDMS 엘라스토머 및 경화제. 사내 생물 반응기에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>PDMS 폼은</td><td></td><td></td><td>자체 바이오리액터에 사용하기 위해 자체 제작했습니다.</td></tr><tr><td>고농도 소 콜라겐 타입 I</td><td>고급 바이오매트릭스</td><td>5133-A</td><td>FibriCol ~10 mg/ml</td></tr><tr><td>성장 인자 감소 Matrigel (기저막)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>기저막 재료</td></tr><tr><td>소듐 바이카보네이</td>트 <td>시그마</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>분자생물학 등급 물</td><td>낚시</td>꾼 <td>BP2819-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 10x&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2429</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 챔버 슬라이드 시스템&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>177402</td><td>8웰</td></tr><tr><td>바이오리액터</td><td></td><td></td><td>자체 제작.</td></tr><tr><td>스프링백 304 스테인리스 스틸&mdash; PTFE 폴리머</td><td>McMaster-Carr</td><td>1749T19</td><td>스테인리스 스틸 와이어로 코팅되어 우리의 사내&nbsp; 생물반응기 시스템에서 마이크로채널을 생성합니다. 0.016" 직경</td></tr>의 <tr><td>BioPharm Plus 백금 경화 실리콘 펌프 튜브, L/S 14</td><td>Masterflex</td><td>EW-96440-14</td><td>우리의 사내 생물반응기 시스템에서 사용하기 위해. 튜빙 ID: 1.6mm, 호스 미늘 크기: 1/16인치</td></tr><tr><td>2-Stop 튜빙 세트, 비플레어 PVC, 1.52&nbsp; mm ID</td><td>콜-파머&nbsp;</td><td>EW-74906-36</td><td>우리의 사내 바이오리액터 시스템에서 사용하기 위한 것입니다 (마이크로페리스탈틱 펌프 포함).</td></tr><tr><td>6 채널 정밀 마이크로 연동 펌프</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-74906-04</td><td>사내 생물 반응기 시스템</td></tr><tr><td>Tuberculin 주사기</td><td>BD Medical</td><td>309625</td><td>26 게이지 3/8 인치 바늘과 함께 사용; 멸균</td></tr><tr><td>해부 조직 겸자</td><td>FisherBrand</td><td>13-812-36</td><td>5.5 인치</td></tr><tr><td>미니 튜브 로테이터</td><td>Boekel Scientific</td><td>260750</td><td>대리 회전을 위한 장비 옵션. 50 ml 튜브 (모델 번호 260753)용 캐러셀과 함께 사용되며,</td></tr> <tr><td>50 ml 튜브 캐러셀</td><td>Boekel Scientific</td><td>260753</td><td>미니 튜브 로테이터</td></tr><tr><td>Bambino와 함께 사용됩니다&nbsp; 하이브리드화 오븐</td><td>Boekel Scientific</td><td>230301</td><td>장비 대리 회전 장비 옵션</td></tr><tr><td>HistoGel 표본 처리 젤</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>단계 5.2에서 설명한 표본 처리 젤</td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Andwin Scientific</td><td>4566</td><td>15 mm x 15 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Tissue Marking Dye Cancer</td><td>Diagnostics, inc.&nbsp;</td><td>03000P</td><td>는 대리모를 표시하는 데 사용할 수 있으며, 하나의 조직 카세트에 여러 샘플을 포함할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>힌지 티슈 카세트&nbsp;</td><td>FisherBrand</td><td>22-272-416</td><td></td></tr><tr><td>포르말린</td><td>Fisher</td><td>23-245-685</td><td></td></tr><tr><td>GoldSeal 일반 유리 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>3048-002</td><td></td></tr><tr><td>자일렌</td><td>피셔</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 200 프루프 (100%), USP</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2805M</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7211</td><td></td></tr><tr><td>정화기</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7401</td><td></td></tr><tr><td>블루잉 솔루션</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7301</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL 장착 미디어</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>83124</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>12-548-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

준비 및 분석<em&gt; 체외</em&gt; 3 차원 유방 암 서로 게이트

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

삼차원 (3D) 배양 이차원 배양보다 시험 관내에서 세포 행동 모델에 더 중요한 생리 학적 방법이다. 유방 암종을 비롯한 암종, 섬유 아세포 및 세포 외 기질 (ECM)을 포함 경부암 상피 세포 및 간질 성분으로 이루어지는 복잡한 3 차원 조직이다. 그러나 유방암 대부분의 시험 관내 모델에 따라서, 기질을 생략 만 암 상피 세포로 구성하고, 생체 내에서 종양의 3 차원 구조. 암의 적절한 3D 모델링 종양 생물학, 행동 및 치료에 대한 반응의 정확한 이해를 위해 중요하다. 그러나, 문화, 3D 모델의 볼륨의 지속 시간은 문화 내에서 산소와 영양분의 가용성에 의해 제한된다. 여기서, 우리는 유방암 상피 세포 및 섬유 아세포가 간질 기질을 포함하고으로 배양 할 수있는 3D 유방암 대리를 생성 ECM에 포함시키는 방법을 보여고체 차원 구조 또는 산소와 영양분을 제공하기 위해 관류 생물 반응기 시스템을 사용함으로써. 설정 및 초기 성장 기간 후, 대리모는 임상 약물 테스트에 사용될 수있다. 대안 적으로, 대리모의 세포 매트릭스 성분은 생물학적 다양한 질문을 해결하기 위해 변형 될 수있다. 배양 후, 대체물은 고정 관심 파라미터의 평가를위한 임상 유방암 표본의 처리와 유사한 방식으로, 파라핀 처리된다. ImageJ에 CellProfiler 및 이미지 분석 소프트웨어 시스템을 대리의 조직​​ 학적 섹션 현미경에 적용되고, 설명 하나의 파라미터, 본 셀의 밀도 평가 면적당의 유핵 세포 수를 정량화한다. 이것은 시간이 지남에 따라 세포 수의 변화 또는 다양한 성장 조건으로 치료로 인한 세포 수의 변화의 지표로 사용될 수있다.

7 일간 상술 한 바와 같이 성장 두 고체 및 관류 3D 유방암 대체물을 제조 하였다. 이어서, 대체물은 고정 된 파라핀 처리, 절단, 전술 한 바와 같이, 헤 마톡 실린 및 에오신으로 염색 하였다. 핵 생성 영역 당 셀 (모두 231 세포 및 CAF) 각각의 대용의 수를 측정 하였다. 도 12에서 알 수있는 바와 같이, H &amp; E 염색 섹션 나타내는 현미경 세포의 농도가 초기에 통합하더라도, 고체 대용 (도 12b)에 비해 관류 대용 (도 12a)에 존재하는 세포의 높은 농도를 보여 대용은 모두 고체 및 관류 조건에서 동일하다. 세포 성장이 시각적 표현은 관류 대용 인 영역 (밀도) 당 세포의 높은 평균 개수에 의해지지된다 (N = 3) (N = 3), t에 의해 결정되는, 고체 대용 비해그는 분석 (그림 12C)를 CellProfiler....

우리는 산소와 영양분을 전달하기 위해 관류 생물 반응기 시스템을 사용하여 배양할 수 있는 3D 유방암 대리모를 생성하는 방법을 시연합니다. 성장 후, 대리모는 관심 매개변수의 평가를 위해 고정되고 파라핀으로 처리됩니다. 이러한 매개 변수 중 하나 인 세포 밀도의 평가가 설명됩니다.

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

이 일련의 절차의 전반적인 목표는 인비트로(in vitro) 유방암 대리 모델로 기능하는 3차원 세포 배양물을 생성하고, 이 대리 모델의 조직학적 절편에서 세포 성장을 측정하는 방법을 제시하는 것입니다. 3차원 세포 배양은 2차원 세포 배양보다 인비트로에서 세포 행동을 모델링하는 데 있어 생리학적으로 더 적절한 방법입니다. 실험 조건에 따라 세포 구성을 변경함으로써, 이 절차를 다양한 생물학적 문제 해결 및 후보 치료제의 효능 평가에 맞게 조정하여 적용할 수 있습니다.세포를 ECM에 포함시키기 위해, 얼음 위에서 세포와 동봉된 원고의 표 1에 나열된 처음 네 가지 관련 성분을 2mm 마이크로원심분리 튜브에 넣습니다. 다음으로, 파이펫팅을 통해 부드럽게 혼합하며, 이때 기포가 생성되지 않도록 주의합니다. 10XD MEM 내의 페놀 레드(phenol red)를 사용하여 pH 수준을 모니터링하여, 혼합물이 pH 7을 나타내는 오렌지-분홍색을 띠는지 확인합니다.혼합물이 노란색으로 보이고 pH가 너무 낮다면, 적절한 색상이 될 때까지 7.5% sodium bicarbonate를 한 방울씩 천천히 첨가하십시오. 혼합물을 계속 얼음 위에 유지하고, ECM의 조기 중합을 방지하기 위해 신속하게 작업하십시오. 고체 3D 배양의 경우, ECM의 조기 중합을 방지하기 위해 챔버 슬라이드를 얼음 위에 두십시오.8-웰 챔버 슬라이드의 각 웰에 세포 ECM 혼합물 100 µL를 천천히 피펫팅하고, 혼합물이 더 잘 분포되도록 웰의 가장자리를 따라 피펫팅합니다. 다음으로, ECM 중합이 일어날 수 있도록 대리물을 37 °C, 5% CO2 조건에서 45분 동안 배양합니다. 45분 후, 각 웰에 배양액 100 µL를 첨가하고 실험 기간 동안 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다.배양액을 이틀마다 교체하십시오. 3D 배양의 한계점은 산소와 영양분이 부피 내로 확산되는 양이 세포 생존력을 유지하기에 부족할 수 있다는 점입니다. 바이오리액터 시스템을 추가하면 이러한 한계를 극복하고 성장을 촉진하는 데 도움이 될 수 있습니다.바이오리액터 시스템에서 3D 배양물을 관류시키기 위해, 대용물을 수용하는 바이오리액터 시스템 부분을 멸균적으로 준비하고 조립합니다. 세포 배양 후드 내에서 26 gauge 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 세포-ECM 혼합물을 세포가 포함되도록 설계된 관류 바이오리액터 영역에 주입하고, 신속하게 다음 단계로 진행합니다. 대용물 내에 세포가 더 균일하게 분포되도록 하려면, 대용물을 수용하는 바이오리액터 구성 요소를 50 milliliter 원심분리관(conical tube)에 넣습니다.ECM 중합이 일어날 수 있도록 in situ hybridization 오븐 또는 배양기에서 37 °C로 45분 동안 배양하면서 대용물을 18 rpm으로 계속 회전시킵니다. 중합 과정과 배지 첨가가 완료되면 바이오리액터 조립체를 펌프에 연결합니다. 37 °C, 5% CO2 조건의 배양기에서 배지 관류를 시작합니다.실험 기간 동안 배지 관류를 지속하고, 특정 실험 설계에 따라 필요시 배양 배지를 교체하십시오. 실험 종료 후, 처리 과정 동안 대용물을 온전하게 유지하고 조직 절편 제작을 용이하게 하기 위해 대용물을 시편 처리 젤로 감싸십시오. 이를 위해, 시편 처리 젤을 60 °C 항온수조에서 사용할 수 있을 때까지 녹이십시오.그런 다음, 라벨이 부착된 크라이오몰드(cryomold) 바닥에 약 300 µL의 시료 처리 젤을 피펫으로 분주합니다. 메스 날과 핀셋을 사용하여 바이오리액터 또는 8웰 챔버 슬라이드의 웰에서 대리물을 조심스럽게 꺼내어 시료 처리 젤이 들어 있는 크라이오몰드에 넣습니다. 크라이오몰드 내의 대리물을 덮을 수 있도록 약 300 µL의 시료 처리 젤을 추가로 분주합니다.그런 다음, 4 °C에서 30분 동안 배양합니다. 검체 처리 젤이 응고되면, 대용물이 포함된 검체 처리 젤을 크라이오몰드(cryomold)에서 꺼내 조직 카세트에 넣습니다. 하나 이상의 대용물을 동일한 조직 카세트에 넣는 경우, 고정 및 처리 후 샘플을 구분하기 위해 조직 표시 염색약을 사용할 수 있습니다.그 후, 대용물을 담은 조직 카세트를 실온에서 10% 중성 완충 포르말린에 10~12시간 동안 넣어 완전히 고정시킵니다. 고정이 완료되면 대용물이 담긴 조직 카세트를 70% 에탄올로 옮깁니다. 이제 고정된 대용물을 파라핀 처리한 후 조직학적 절편 제작을 할 수 있는 상태가 되었습니다.H 및 E 염색된 절편의 세포 밀도를 측정하고 광학 현미경 이미지를 얻으려면, 대리물의 이미지 파일을 엽니다. ImageJ의 Polygon 도구를 사용하고 ECM의 가장자리를 가이드로 삼아, 마우스를 드래그하고 클릭하여 고정점을 만들어 대리물의 영역을 외곽으로 지정합니다. 외곽 지정이 완료되면 Analyze 탭에서 Measure를 선택합니다.다음으로, 대리 면적(surrogate area) 측정에 사용된 이미지 파일들을 파일 목록으로 드래그하여 Cell Profiler로 업로드합니다. 그다음, Names and Types Import 모듈에서 가져온 각 이미지에 이름을 지정하고 이미지 유형을 선택합니다. 분석 파이프라인이 생성되면 Test Mode를 시작하고 Cell Profiler에서 Run을 클릭합니다.필터링된 객체들을 평가하여 테스트 이미지의 대부분의 핵이 적절하게 식별되었는지 확인하고, 세포를 식별하기 위한 최적의 파라미터가 선택되었는지 확인합니다. 포함된 핵은 녹색 원으로 표시됩니다. 그런 다음 프로젝트를 저장하고 테스트 모드를 종료한 후, Analyze Images를 클릭하십시오.여기에 7일 동안 배양한 관류 대리 조직의 H and E 염색 절편 대표 이미지가 나와 있습니다. 그리고 이것은 2일마다 배지를 교체하며 7일 동안 배양한 고체 대리 조직의 H and E 염색 절편 대표 이미지입니다. 고체 대리 조직의 세포 밀도가 훨씬 더 낮습니다.이 그래프는 7일간의 성장 후 단위 면적당 평균 핵 세포 수의 비교를 보여줍니다. 관류된 대용물과 고체 대용물에 대한 결과입니다. 이 수치 데이터는 H and E 염색 단면의 현미경 사진에 나타난 세포 밀도를 뒷받침합니다.이 그래프는 관류 및 고체 대용물의 7일간 성장에 따른 세포 증식의 척도인 Ki-67 표지 지수의 비교를 보여줍니다. 이 데이터는 관류 대용물에서 더 큰 성장이 일어남을 다시 한번 뒷받침합니다. 이 절차 이후, RNA 및 단백질 발현과 같은 질문에 답하기 위해 대용물의 조직 절편을 대상으로 인시투 하이브리다이제이션(in situ hybridization) 및 아미노 조직 화학과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 3차원 인비트로(in vitro) 조직 대용물을 준비하고 처리하는 방법과 H &amp; E 염색된 조직 절편의 대용물 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

preparation-analysis-vitro-three-dimensional-breast-carcinoma

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

정량 PCR을 사용하여, 우리는 잘 설립된 여자 CAM 모델이 양적 먼 기관으로 인간의 종양 세포의 전이를 분석하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.

조류 엠브료 모델을 사용하여 암 전이의 정량 분석

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이 비디오에서는 신경 주위 침습을 연구하기 위해 병아리 융모축막(CAM)에서 등뿌리 신경절과 암세포를 공동 배양하는 방법을 설명합니다.

Chick Chorioallantoic Membrane 또는 CAM Tumor Model: An An An In Ovo Method to simulate Perineural Peripheral Imaging of Tumor Cells (병아리 융모대박막 또는 CAM 종양 모델: 종양 세포의 신경주위 침입을 시뮬레이션하기 위한 In Ovo 방법)

이 문서는 유방암 세포의 침입을 정량화하는 3 차원 (3D) 분석의 사용에 대한 자세한 방법을 제공합니다. 특히, 우리는 세포가 침입 할 때 발생하는 멤브레인 무결성의 손실을 검사하는 등의 분석을 설정하는 데 필요한 절차, 정량화 및 데이터 분석뿐만 아니라 방법에 대해 설명합니다.

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주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

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여기, 우리는 기본 유 방 암 세포 뿐만 monocytes 그리고 콜라겐 저하, 면역 세포 모집, 셀 결과 함께 그들의 직접/간접적인 상호 작용 연구로 형태를 분석 하는 3 차원 문화 방법 설명 침공, 그리고 암 관련 된 염증의 승진.

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환자 BMPC 견본및 뼈 전이성 전립선암의 이종이식의 3차원 배양은 낭종, 스페로이드 및 복잡한, 종양 같이 organoids의 결과로 그들의 본래 종양의 기능적인 이질성을 유지합니다. 이 원고는 IFC를 사용하여 이기종 환자 유래 샘플 및 이들의 분석의 3D 배양에 대한 최적화 전략 및 프로토콜을 제공한다.

환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석

이 논문은 이전에 설명한 3차원 콜라겐 기반 스캐폴드에 신경모세포종 세포주를 파종하고, 미리 결정된 기간 동안 세포 성장을 유지하고, 다양한 실험 목표를 충족하도록 적응할 수 있는 여러 세포 성장 및 세포 행동 분석 및 다운스트림 애플리케이션을 위한 스캐폴드를 검색하는 데 필요한 단계를 나열합니다.

콜라겐 기반 스캐폴드를 사용한 신경모세포종의 3차원 체외 생체모방 모델

유방 상피 세포와 내피 세포 사이 교차 토크는 중요한 유방암 진행에 기여, 종양 성장, 및 전이. 이 연구에서는, 스페로이드는 혈관 및/또는 림프 성 내피 세포와 함께 유방암 세포에서 만들어졌으며 유방암 연구를위한 체외 시스템으로서 자신의 적용성을 입증했습니다.

유방암 연구를 위한 잠재적인 기능적인 시험관 내 모형으로 유방 상피 및 내피 세포 스페로이드

이 프로토콜은 체외/생체 내 기능 분석, 전사체학 및 컴퓨터 분석을 포함하여 쥐 CAF를 배양, 조작 및 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다. 또한, 인간 유방암 종양 컬렉션에서 레이저 캡처 미세 절개 기질 및 상피 구성 요소의 공개적으로 사용 가능한 전사체를 분석하기 위해 개발된 웹 기반 플랫폼에 대해 설명합니다.

Cancer-Associated Fibroblasts from Mouse Mammary Tumors as Tools for Molecular and Computational Studies(분자 및 컴퓨터 연구를 위한 도구로서의 마우스 유방 종양에서 유래한 암 관련 섬유아세포)

학습하세요 체외 3차원 유방암 서로게이트 제조 및 조직학적 분석 방법을. 관류 바이오리액터 시스템을 활용한 세포 밀도 측정 기술로 생리학적 관련성 높은 암 모델링이 가능합니다.

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