준비 및 분석 체외 3 차원 유방 암 서로 게이트

이 일련의 절차의 전반적인 목표는 체외 유방암 대리모로 기능하는 3차원 세포 배양을 생성하고 대리모의 조직학적 절편에서 세포 성장을 측정하는 방법을 제시하는 것입니다. 3차원 세포 배양은 2차원 세포 배양보다 체외에서 세포 거동을 모델링하는 생리학적으로 더 관련성이 높은 방법입니다. 실험 조건에서 세포 구성을 변경함으로써 이 일련의 절차는 다양한 생물학적 질문을 해결하고 후보 치료제의 효능을 평가하도록 조정할 수 있습니다.

세포를 ECM에 통합하려면 얼음 위에서 세포와 함께 제공된 원고의 표 1에 나열된 처음 4개의 관련 구성 요소를 2mm 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다. 다음으로, 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고 거품이 생기지 않도록 합니다. 10XD MEM의 페놀 레드를 사용하여 pH 수준을 모니터링하여 혼합물이 pH가 7임을 나타내는 주황색-분홍색을 나타내는지 확인합니다.

혼합물이 노랗게 나타나고 pH가 너무 낮으면 적절한 색상에 도달할 때까지 7.5% 중탄산나트륨을 한 번에 한 방울씩 천천히 첨가하십시오. 혼합물을 얼음 위에 보관하고 조기 ECM 중합을 방지하기 위해 신속하게 작업하십시오. 고체 3D 배양의 경우 챔버를 얼음 위에 밀어 넣어 조기 ECM 중합을 방지할 수 있습니다.

100마이크로리터의 셀 ECM 혼합물을 8개의 웰 챔버 슬라이드의 각 웰에 천천히 피펫팅하고, 웰 가장자리 주위로 셀 ECM 혼합물을 피펫팅하여 혼합물을 더 잘 분배할 수 있습니다. 다음으로, ECM 중합을 허용하기 위해 섭씨 37도, CO2 5%에서 45분 동안 대리모를 배양합니다. 45분 후 각 웰에 100마이크로리터의 배양 배지를 추가하고 실험 기간 동안 섭씨 37도와 5% CO2에서 배양합니다.

이틀에 한 번씩 배양 매체를 교체하십시오. 3D 배양의 한계는 산소와 영양분을 부피로 확산시키는 것이 세포 생존력을 지원하기에 부적절할 수 있다는 것입니다. 바이오 반응기 시스템을 추가하면 이러한 한계를 극복하고 성장을 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다.

바이오 반응기 시스템에서 3D 배양을 풍부하게 하기 위해 대리모를 수용하는 바이오 반응기 시스템의 일부를 멸균 준비하고 조립합니다. 세포 배양 후드에서 26게이지 바늘이 있는 주사기를 사용하여 세포를 포함하도록 설계된 관류 바이오 반응기 영역에 세포 ECM 혼합물을 주입하고 다음 단계로 빠르게 진행합니다. 대리모 내에서 세포가 보다 고르게 분포되도록 하려면 대리모를 수용하는 바이오 반응기 구성 요소를 50ml 원추형 튜브에 넣습니다.

ECM 중합을 허용하기 위해 현장 혼성화 오븐 또는 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 45분 동안 인큐베이팅하는 동안 대리모를 18rpm으로 지속적으로 회전시킵니다. 중합 및 매체 첨가 후 바이오 반응기 어셈블리를 펌프에 연결합니다. 섭씨 37도, CO2 5%의 인큐베이터에서 중간 관류를 시작합니다.

실험 기간 동안 배지 관류를 계속하고 특정 실험 설계에 필요한 대로 배양 배지를 변경합니다. 실험이 끝나면 대리모를 검체 처리 젤에 넣어 처리 중에 대리모를 그대로 유지하고 조직학적 절편을 용이하게 합니다. 이렇게 하려면 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 60도의 수조에서 표본 처리 젤을 녹입니다.

그런 다음 약 300마이크로리터의 표본 처리 젤을 라벨이 붙은 cryomold의 바닥에 피펫으로 주입합니다. 메스 날과 집게를 사용하여 바이오 반응기 또는 8웰 챔버 슬라이드의 웰에서 대리물을 조심스럽게 제거하고 표본 처리 젤이 들어 있는 cryomold에 넣습니다. 약 300 마이크로 리터의 표본 처리 젤을 피펫으로 만들어 cryomold의 대리물을 덮습니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다. 검체 처리 젤이 응고되면 cryomold에서 대리모가 포함된 검체 처리 젤을 제거하고 조직 카세트에 넣습니다. 하나 이상의 대리모를 동일한 조직 카세트에 넣어야 하는 경우, 조직 마킹 염료를 사용하여 고정 및 처리 후 샘플을 구별할 수 있습니다.

그 후, 대리모를 포함하는 조직 카세트를 실온에서 10-12시간 동안 10% 중성 완충 포뮬러에 넣어 완전히 고정할 수 있도록 합니다. 고정 후, 대리모를 포함하는 조직 카세트를 70% 에탄올로 옮깁니다. fixed surrogate는 이제 파라핀 및 후속 조직학적 절편을 처리할 준비가 되었습니다.

염색된 H 및 E 절편의 세포 밀도와 광현미경 이미지를 측정하려면 대리모의 이미지 파일을 엽니다. ImageJ의 다각형 도구와 ECM의 가장자리를 가이드로 사용하여 마우스를 드래그하고 클릭하여 앵커 포인트를 만들어 서로게이트 영역의 윤곽을 그립니다. 윤곽이 잡히면 Analyze(분석) 탭에서 Measure(측정)를 선택합니다.

다음으로, 이미지 파일을 파일 목록으로 드래그하여 대리 영역을 측정하는 데 사용되는 이미지 파일을 Cell Profiler에 업로드합니다. 그런 다음 이름 및 유형 가져오기 모듈에서 가져온 각 이미지에 이름을 할당하고 이미지 유형을 선택합니다. 분석 파이프라인이 생성되면 테스트 모드를 시작하고 셀 프로파일러에서 실행을 클릭합니다.

또한 필터링된 개체를 평가하여 테스트 이미지에서 대부분의 핵이 적절하게 식별되고 세포를 식별하기 위한 최적의 매개변수가 선택되었는지 확인합니다. 포함된 핵은 녹색으로 원으로 표시됩니다. 그런 다음 프로젝트를 저장하고 테스트 모드를 종료한 다음 이미지 분석을 클릭합니다.

여기에 보이는 것은 7일 동안 성장한 관류된 대리모의 H 및 E 염색 단면의 대표적인 이미지입니다. 그리고 이것은 2일마다 배지를 교체하여 7일 동안 성장한 고체 대리모의 H와 E 염색 단면을 대표하는 이미지입니다. cellularity는 solid surrogates에서 훨씬 낮습니다.

이 그래프는 7일간의 성장 후 면적당 핵이 있는 세포의 평균 수를 비교한 것을 보여줍니다. 관류되고 견고한 대리자입니다. 이러한 수치 데이터는 H 및 E 염색 섹션의 사진 현미경 그래프에서 셀룰러리티를 뒷받침합니다.

그리고 이 그래프는 관류 대리모와 고체 대리모의 7일 성장에 따른 세포 증식의 미미한 수준인 Ki-67 표지 지수의 비교를 보여줍니다. 이러한 데이터는 다시 관류된 대리모의 더 큰 성장을 지원합니다. 이 절차에 따라 RNA 및 단백질 발현과 같은 질문에 답하기 위해 대리모의 조직학적 섹션에서 현장 혼성화 및 아미노 조직화학과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 3차원 체외 조직 대리모를 준비 및 처리하는 방법과 H 및 E 염색 조직학적 절편에 대한 대리 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.