Name: 체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 배우세요 성체 쥐 췌장에서 분리한 전구 세포의 체외 식민지 분석 방법을 통해 자가재생 및 분화 능력을 평가하는 기술입니다. 이 방법은 개별 세포의 생물학적 잠재력을 규명하는 데 활용됩니다.

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우리는 정렬에 도움을 희망의 도시에서 분석 세포 계측법 코어에서 루시 브라운과 알렉산더 Spalla 감사합니다. 이 작품은 건강 (NIH)의 국립 연구소 DAT 지지대에 재생 의학 부여 RB5-07398에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 NSF-DMR-1206121 캘리포니아 연구소 R01DK081587 및 R01DK099734 HTK, 그리고 ADR에 U01DK089533 및 부여에 의해 부분적으로 지원 HTK 푸에르 테 재단과 엘라 피츠 제럴드 재단의 조셉 J. 제이콥스 DAT에 캘리포니아 공과 대학에서 의학 분자 공학 연구소, 이들로부터 감사 인정도 있습니다. 자금 조달 :이 작품은 건강 (NIH)의 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원됩니다 HTK에 R01DK081587 및 R01DK099734을 부여하고, ADR에 U01DK089533, 그리고에 재생 의학 부여 RB5-07398에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 NSF-DMR-1206121 캘리포니아 연구소 DAT는 조셉 J. 제이콥스에서 지원DAT에 캘리포니아 공과 대학에서 의학 분자 공학 연구소와 옥스 나드 재단과 HTK에 엘라 피츠 제럴드 재단들도 기꺼이 인정한다. 이 책에서보고 된 연구는 보너스 번호 P30CA33572에서 국립 보건원의 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)에 의해 지원되는 분석 세포 계측법 코어 및 광학 현미경 디지털 이미징 코어에서 수행 한 작업을 포함했다. 연구 스폰서 : 스폰서는 데이터의 연구 설계, 수집, 분석 또는 해석에 참여하지 않았다.

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저자는 공개 아무것도 없어.

췌장 식민지 분석 및 단일 콜로니는 여기에 설명 분석 지난 수십 년 23 조혈 전구 세포의 생물학을 해독에서 중요한 역할을 한 메틸 셀룰로오스 함유 조혈 식민지 분석에 의해 영감을했다. 이 분석에서 (그림 5), 췌장 세포로 도금 해리 메틸 셀룰로오스 함유 링, 밀도 또는 내분비 / 선포 식민지 (7)의 형성을 지원하는 적절한 성장 인자와 ECM 단백질과 반 고형 미디어를. 세포 콜로니에 상승을 부여 할 수있는 하나의 전구 세포는 PCFU 불린다. 미세 유체 QRT-PCR 및 전체 마운트 면역 염색을 사용하여 개별 식민지를 특징으로, 원래 PCFUs의 계보 잠재력을 추론 할 수있다. 그것은 성인 쥐 PCFUs의 대부분은 트라이 강력한, 체외 7,9에 도관, 선포하고, 내분비 계통 세포에 상승을 제공 할 수 있다는 사실을 발견했다. MUR 동안오프라인의 ECM 단백질 덕트 계통으로 트라이 강력한 PCFU의 분화를 촉진, 라미...

췌장은 세 가지 주요 세포 계통으로 구성된다; 선포 세포는 소화 효소가, 덕트가 병원균을 방어하고 장내에 소화 효소를 수송하는 점액 분비 분비 및 내분비 세포는 포도당 항상성을 유지하는 인슐린과 글루카곤을 포함한 호르몬을 분비. 췌장의 배아 발달 동안 초기 도관 세포는 성체 동물의 1,2- pancreata에서 세 계통 상승을 제공 할 수있는 트라이 강력한 선조 세포의 근원이다. 골수 줄기 세포와 같은 성체 줄기 세포 및 선조 세포는 이미 성공적으로 각종 질병 (3)을 치료하는 데 사용되기 때문에, 성인 췌장 줄기 및 전구 세포를 찾는데 큰 관심이있다. 분리 및 성인 췌장 줄기 및 전구 세포의 조작이 가능하다면,이 세포는 인슐린 분비 세포가자가 면역에 의해 파괴되는 제 1 형 당뇨병 등의 질병을 치료하는 데 사용할 수 있습니다. 생체 CRE-LOX 계보 - 추적 기술을,이나 다와 동료 마커, 탄산 탈수 효소 II 표지 성인 쥐 도관 세포, 세 췌장 계통 (4)을 야기 할 수 있음을 보여 주었다. 그러나, 이러한 HNF1b 5 Sox9이 다른 도관 마커를 이용하면, 도관 세포는 성체 생쥐에서 베타 세포의 주요 원인없는 것으로 결론 지어졌다. 몇 년 전에, 우리는 전술 논쟁의 원인은 필요한 자기 갱신 멀티 혈통 분화 개의 조건을 측정하는데 사용될 수있는 적절한 분석 도구의 필드 -6,7-에서 부족에 기인 할 수 있음을 제안 줄기 세포를 정의합니다. 언급 된 생체 CRE-LOX 계보 - 추적 기술위의 인구 수준에서 조상 - 자손 관계에 대한 증거를 제공 할 수 있습니다. 그러나,이 혈통 추적 기술은 단일 전구 세포는 자기 갱신과 여러 계통으로 분화 할 수 있는지 여부를 식별하기 위해 힘 제한된다. 여러 모노 강력한 조상, 다른 혈통 잠재력이 각각 함께 분석 하였다 경우, 그들은 집단적으로 멀티 혈통 분화 능력을 가지고 나타날 수 있기 때문에 단일 세포 분석은 중요하다. 또한, 줄기 세포는 일반적으로 성숙한 기관의 작은 집단이다. 작은 세포 집단의 활성은 주요 집단에 의해 마스크 될 수있다. 따라서, 모집단 연구에서 부정 결과가 반드시 줄기 세포의 유무를 나타내지 않는다. 마지막으로, CRE-LOX 계보 추적은 현재 자기 갱신의 측정을 허용하지 않습니다. 췌장 전구 세포 생물학, 식민지의 분야에서 기술 격차를 해결하는 시작하려면 7-11 또는 12-15 organoid </su3D 문화 시스템을 사용하여 페이지&gt; 분석 고안되었다. 췌장 전구 세포에 대한 두 식민지 분석은 우리의 실험실에서 개발 된 하나는 쥐의 세포 외 기질 단백질 (ECM) (방법 및 장비 표 참조)의 상업 준비를 포함, 다른 하나는 라미닌 하이드로 겔, 정의 된 인공 ECM 단백질 7-11 포함되어 있습니다. 전구 세포는 반고체 배지 함유 메틸 혼합한다. 메틸 목재 섬유로 제조 된 생물학적 불활성 점성 재료이고, 통상적으로 조혈 콜로니 분석 (16)에 사용되어왔다. 그들은 다시 집합체 수 없도록 메틸 - 함유 반고체 배지 단일 전구 세포의 이동을 제한한다. 그러나, 상기 매체가 전구 세포의 성장과 3 차원 공간에서 세포의 콜로니로 분화 할 수 있도록 충분히 부드러운 것이다. 혈액학의 전통에 따라, 세포의 식민지에 상승을 제공 할 수있는 선수는 췌장 전구 세포는 N이었다아메드 췌장 집락 형성 단위 (PCFU). 뮤린 ECM 함유 콜로니 에세이에서 성장시 PCFUs는 &quot;링&quot;콜로니 7 명명 낭성 콜로니를 야기. 의 Wnt 작용제를 첨가하면, R-spondin1는 쥐 ECM 함유 문화로, 일부 링 식민지는 &quot;밀도&quot;식민지 7 차례. 이 기사에서는 쥐 ECM 문화에서 자란 식민지의 두 가지 유형은 모두 &quot;반지 / 밀도&quot;식민지라고합니다. 벨소리 / 고밀도 콜로니가 단일 세포 현탁액 내로 해리 라미닌 하이드로 겔을 함유 배양에 재 플레이 팅하는 경우 &quot;내분비 / 선포&quot;7 콜로니를 형성한다. 하나의 식민지 분석을 사용하여, 9 쥐의 췌장, 중 성인에서 (2-4개월 된) 7,11 또는 젊은 (1 주령) 링 / 밀도 및 내분비 / 선포 식민지의 대부분, 세 가지를 모두 표현하는 것으로 나타났습니다 혈통 마커. 이것은 원래 PCFUs 대부분 트라이 강력한 것을 시사. 쥐 ECM 함유 식민지 분석에서, 성인 쥐 PCFUs 견고하게 자기 갱신과 문화 7 11 주 동안 약 50 만 회를 확장합니다. 라미닌 하이드로 겔의 존재, 쥐 PCFUs는 내분비 및 선포 세포로 우선적으로 분화하도록 권장하고 유관 계통 7,9,11 너무 적은 반면 쥐 ECM은 우선적으로, 내분비 및 선포 계통을 통해 도관 세포의 분화를 지원합니다. 중요한 것은, 인슐린 + 글루카곤 - 모노 - 호르몬 세포 라미닌 하이드로 배양 생성 기능 성숙 시사 7,9 관내에서 자극 글루코오스에 반응의 인슐린을 분비한다. 7,9 잠재적 인 트라이 혈통 차별화와 개별 PCFUs의 자기 갱신 (11)는 콜로니 형성을 위해 잘 당 하나의 세포를 배양, 단일 셀의 미세 조작, 즉에 의해 확인된다. 함께, 이러한 결과는 자기 갱신, 트리 poten 존재한다는 증거를 제시t, 3D 문화 활동을 보여 출생 후의 쥐의 췌장 전구와 같은 세포. 이 문서에서 설명하는 쥐 PCFU 분석은 쥐의 배아 줄기 세포 (mESCs) 17에서 차별화 된 전구 세포 위해 설계된 이전의 식민지 분석에서 파생됩니다. 즉, 프로토콜은 다른 조브 간행물 (18)에 자세히 설명되어 있습니다. 배양 성분 성인 PCFUs 대한 뮤린 ECM 함유 콜로니 에세이를 수행하는데 필요한 기술은 MESC - 유래 전구 세포 (17, 18)와 동일하다. 따라서, 이러한 분석의 측면은 여기서 반복되지 않을 것이다; 대신 다음 절차는 해결 될 것입니다 : 1) 성인 췌장의 해리 성인 마우스 7, 2) 정렬 된 세포의 단일 세포 조작, 3) 단일 식민지에서 PCFUs을 풍요롭게 CD133 + Sox9 / EGFP + 도관 세포를 정렬 미세 유체 QRT-PCR 및 전체 마운트 면역 염색 및 콜로니 4) 분리를 사용하여 분석단일 세포 현탁액과로의 쥐 ECM 또는 라미닌 하이드로 겔 식민지 분석에 재 도금.

<table><tbody><tr><td>쥐 ECM 단백질(Matrigel)</td><td>Becton Dickson(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크)</td><td>354230</td><td>재고 -20 &#176; C</td></tr><tr><td>라미닌 하이드로겔</td><td>제공: David Tirrell (Pasadena, CA, USA)</td><td></td> <td>재고는 -20 &#176으로 유지되었습니다. C</td></tr><tr><td>메틸셀룰로오스</td><td>Shinetsu Chemical (일본 도쿄)</td><td></td><td>1,500 센티포이즈 (15 g/cm/sec와 동등한 동적 점도 단위) (고점도)</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Mediatech (Manassas, VA, USA)</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Flacon Conical vial</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, 미국)</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm 현탁 배양 접시</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>DNase1</td><td>Calbiochem (Darmstadt, Germany)</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland)</td><td>11088831001</td><td>재고는 -20 &#176으로 유지되었습니다. C</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD16/32</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>101310</td><td>저내독소, 아지드 프리</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Rat IgG2a &kappa; Isotype Control</td><td>Biolegend (미국 캘리포니아주 샌디에이고)</td><td>400522</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG1 &kappa; Isotype Control</td><td>eBioscience (미국 캘리포니아주 샌디에이고)</td><td>13-4301-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD133-Biotin</td><td>eBioscience (미국 캘리포니아주 샌디에이고)</td><td>13-1331-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD71-PE-Cy7</td><td>Biolegend (미국 캘리포니아주 샌디에이고)</td><td>113812</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Allophycocyanin</td><td>Biolegend (미국 캘리포니아주 샌디에이고)</td><td>405207</td><td></td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌</td><td>인비트로겐 ( 매사추세츠주 월섬,&nbsp; USA)</td><td>3571</td><td>재고는 -20 &#176으로 유지되었습니다. C</td></tr><tr><td>Anti-mucin 1</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>HM-1630-P1</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>127-495-160</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td><td>Mediatech(Manassas, VA, USA)</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA)</td><td>101</td><td>재고는 -20 &#176으로 유지되었습니다. C</td></tr><tr><td>Tris Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>TEKnova (Hollister, CA, USA)</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Micro Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTec Reverse transcription Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Netherlands)</td><td>205310</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA)</td><td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>005-000-121</td><td>재고 유지 -20 &#176; C</td></tr><tr><td>당나귀 혈청</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>0017-000-121</td><td>재고 유지 -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>T-4799</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Invitrogen (Waltham, MA,&nbsp; 미국)</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies (Waltham, MA, USA)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Water</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15230-147</td><td>Molecular biology grade</td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filter Mesh</td><td>Fisher Scientific (미국 펜실베니아 주 피츠버그)</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m filter mesh</td><td>Fisher Scientific (미국 펜실베이니아 주 피츠버그)</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 96 well suspension</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924 (previously 83.1835)</td><td></td></tr><tr><td>1 cc Syringe</td><td>Becton Dickson (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10cc Syringe</td><td>Becton Dickson (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>48.48 Dyanmic Array Chip</td><td>Fluidigm (샌프란시스코, 캘리포니아, 미국)</td><td>BMK-M-48.48</td><td></td></tr><tr><td>Fluidigm GE 48.48 동적 어레이 샘플 및 Assay Loading Reagent Kit</td><td>Fluidigm(미국 캘리포니아주 샌프란시스코)</td><td>85000800</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master</td><td>Mix Applied Biosystems(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트</td><td>시그마(미국 미주리주 세인트루이스)</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>MatTek(미국 매사추세츠주 애쉬랜드)</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>유리 바닥</td></tr><tr><td>이 있는 35mm 페트리 접시마우스 피스/고무 튜빙</td><td>Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)</td><td>MP-SET</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마(미국 미주리주 세인트루이스)</td><td>N0636</td><td>재고 -20 &#176 유지; C</td></tr><tr><td>혈관 내피 성장 인자</td><td>R& D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>293-VE</td><td>재고는 -80 &#176으로 유지되었습니다. C</td></tr><tr><td>액티브뱅 B</td><td>R& D Systems(미국 미네소타주 미니애폴리스)</td><td>659-AB</td><td>재고는 -80 &#176으로 유지되었습니다. C</td></tr><tr><td>Extendin 4</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>E7144</td><td>재고는 -20 &#176으로 유지되었습니다. C</td></tr><tr><td>Rspondin-1</td><td>R& D Systems(미국 미네소타주 미니애폴리스)</td><td>3474-RS</td><td>재고는 -80 &#176으로 유지되었습니다. C</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml 폴리스티렌 라운드-바텀 튜브</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle 18 G x1 1/2</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle 16 G x 1 1/2</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate&nbsp;</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 Black Well Plate</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>3603</td><td>평평하고 투명한 바닥과 뚜껑.&nbsp; 검은색 폴리스티렌 TC 처리된 마이크로플레이트</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M 도립 현미경</td><td>Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biomark HD&nbsp;</td><td>Fluidigm (샌프란시스코, 캘리포니아, 미국)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aria Special Order Research Product Cell Sorter</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS/BSA</td><td></td><td></td><td>1x PBS 
0.1%(중량/부피) BSA 
펜스트렙 (49 단위/ml 페니실린, 49 &mu; g/ml 스트렙토마이신)</td></tr><tr><td>PBS/BSA/Dnase1</td><td></td><td></td><td>1x PBS 
0.1%(중량/부피) BSA 
펜스트렙 (49 단위/ml 페니실린, 49 &mu; g/ml 스트렙토마이신) 
Dnase 1 (췌장당 2,400 단위/ml)</td></tr></tbody></table>

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

줄기 성인 췌장 전구 세포가 제 1 형 당뇨병 환자를 치료하기위한 치료제 베타 - 유사 세포의 잠재적 인 원인이 될 수있다. 줄기 및 전구 세포를 성인 췌장에 존재하는지 그러나, 아직 알려져 있지 않다. 성인 쥐 계통 추적 CRE-LOX를 사용하여 연구 전략 지원 또는 중 베타 세포 덕트 성인 췌장 전구 세포가 존재할 수있다 추정 위치에서 생성 될 수 있다는 생각을 반박한다는 결과를 수득 하였다. 이러한 생체 CRE-LOX 계보-추적 방법은, 그러나, 자기 갱신과 줄기 세포를 정의하는 데 필요한 멀티 혈통 분화 두 가지 기준의 질문에 대답 할 수 없습니다. 이 기술 격차를 해결하기 위해, 우리는 췌장 전구 세포에 대한 3 차원 식민지 분석을 고안했다. 곧 우리의 초기 발행 후, 다른 연구소는 독립적으로 organoid 분석라는 비슷하지만 동일하지, 방법을 개발했다. organoid 검정에 비해, 우리의 방법을 사용낮은 농도에서 세포 외 기질 단백질의 포함을 허용 점성 용액을 형성하는 메틸. 많은 성인 장기 줄기 세포의 경우, 상기 메틸 - 함유 분석은 쉽게 검출 및 선조 작은 서브 모집단을 구성 할 때 중요한 단일 세포 수준에서 선조 세포의 분석을 허용한다. 함께, 여러 실험실에서 결과는 마우스의 췌장 전구와 같은 세포의 체외 자기 갱신 및 멀티 혈통 분화에 보여줍니다. 현재의 프로토콜을 마우스 췌장 전구 세포의 특징을 두 메틸 계 콜로니 검정을 기술; 하나는 라미닌 하이드로 알려진 뮤린 세포 외 기질 단백질의 상업적 제조 및 다른 인공 세포 외 기질 단백질을 포함한다. 여기에 도시 된 기술은 1)은 췌장의 해리 CD133 + Sox9 / EGFP의 정렬 성체 생쥐 + 도관 셀은 S 2) 단일 세포 조작이다orted 세포, 3) 단일 콜로니는 자기 갱신 또는 차별화를 평가하기 위해 보조 식민지 분석에 미세 유체 QRT-PCR 및 전체 마운트 면역 염색 및 단일 세포 현탁액 및 재 도금에 차 식민지 4) 분리를 사용하여 분석한다.

성인 췌장 전구 세포는 형광 활성화 세포 분류 (도 1)에 의해 농축 될 수있다. ~ Sox9 20 75킬로바이트 상류 ~ 150킬로바이트 하류 서열을 여기서 사용 Sox9 / EGFP 유전자 변형 마우스 선 먼저 GENSAT 뇌 아틀라스 프로젝트 (19)의 결과로 생성하고, EGFP 리포터를 함유하는 세균 인공 염색체가 제어 . 이러한 쥐, EGFP 효율적 특히 22 췌장 관 라벨. 췌장 조달 및 단일 세포 현탁액 내로 해리 및 STV - APC와 접합 이차 항체로 염색 하였다 비오틴과 접합 항 CD133 항체로 염색 하였다. 생성 된 세포는 적절한 게이팅 파라미터들 (도 1)와 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 다른 게이팅 매개 변수를 사용하여 얻은 세포 분류와의 메틸 셀룰로오스 함유 식민지 분석에 도금 될 수있다콜로니 형성. 이전 연구에서,...

자기 갱신 성인 쥐의 췌장으로부터 분리 전구 세포의 분화를 검출하는 시험 관내 콜로니 검정 고안되어있다. 이러한 분석에서, 췌장 전구 세포가 메틸 - 함유 반고체 배지에서 3 차원 공간에서 세포 콜로니를 야기. 단일 세포와 개별 식민지의 특성을 처리하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

이 프로토콜들의 전반적인 목표는 메틸셀룰로오스가 포함된 반고체 배지를 이용한 배양 분석법을 통해, 성체 마우스에서 분리한 췌장 전구세포로부터 성장한 세포 콜로니의 특성을 분석하는 것입니다. 본 방법론은 성체 췌장 내 전구세포의 자기 재생 및 분화 능력은 어떠한가와 같이 췌장 전구세포 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 개별 전구세포를 연구할 수 있다는 점이며, 이는 전구세포의 실제 생물학적 잠재력을 파악하는 데 있어 매우 중요합니다.저희는 조혈모세포를 연구하는 콜로니 분석법이 췌장 세포군에도 적용될 수 있다는 점을 깨달았을 때 이 방법들에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 시연은 제 실험실의 대학원생인 Jacob Tremblay, 박사후 연구원인 Dr.Janine Quijano, 그리고 기술자인 Miss Angela Luo가 맡을 것입니다. 희생 직후 가능한 한 빨리 가위를 사용하여 복벽 중앙선에 수직 절개를 가하고 복강을 엽니다.포셉을 사용하여 비장을 조심스럽게 들어 올리고, 가위를 이용해 비장과 췌장의 비장엽 사이의 결합 조직을 절단합니다. 동일한 방식으로 십이지장엽과 위엽의 결합 조직을 절단한 후, 0.1% BSA와 항생제가 첨가된 DPBS가 담긴 페트리 접시에 췌장 조직을 넣고 얼음 위에 둡니다. 그런 다음 해부 현미경 하에서 미세 팁 포셉을 사용하여 지방 조직을 제거합니다.이제 췌장을 조직 배양 후드로 옮기고, 각각 10 mL의 차가운 PBS 및 BSA가 담긴 세 개의 100 mm 페트리 접시에서 순차적으로 세척합니다. 마지막 세척 후, 췌장을 멸균된 건조 페트리 접시에 넣어 PBS 및 BSA를 최대한 제거하고, 조직을 얼음 위의 다른 건조 페트리 접시로 옮깁니다. 다음으로, 스프링 가위를 사용하여 췌장을 2~3분 동안 잘게 다져 미세한 조직 조각이 생성될 때까지 분쇄한 후, 조직 파편을 갓 조제한 2~3 mL의 차가운 PBS BSA DNase I 용액에 현탁합니다.10밀리리터 피펫을 사용하여 조각들을 50밀리리터 원추형 튜브로 옮기고, 총 부피가 10밀리리터가 될 때까지 PBS BSA DNase I을 첨가합니다. 그다음 조직에 350~450마이크로리터의 collagenase B를 첨가합니다. 튜브를 37도 워터배스에 8분 동안 넣어두며, 3~4분마다 한 번씩 소용돌이 모양으로 흔들어 섞어줍니다.배양이 끝나면 16.5 gauge 바늘이 장착된 10 milliliter 주사기를 사용하여 조직 용액을 빨아들인 후, 실온에서 50 milliliter 튜브 벽면을 따라 7회 분사합니다. 그런 다음 조직을 다시 항온수조에 넣고 가끔씩 소용돌이치게 흔들어주며 8분 동안 더 배양한 후, 앞서 시연한 것과 같이 주사기를 이용해 7회 반복합니다. 마지막 기계적 분쇄 후, 세포 현탁액 10 microliter를 건조한 Petri dish에 옮기고, 10x 대물렌즈가 장착된 도립 위상차 현미경으로 단일 세포 및 소형 세포 클러스터의 존재를 확인합니다.다음으로, 튜브를 얼음 위에 두고 PBS BSA DNase I을 사용하여 총 부피를 50 milliliters로 맞춥니다. 세포를 원심 분리하고, P1000 피펫을 사용하여 펠릿을 5 milliliters의 차가운 PBS BSA DNase I에 재부유시킵니다. 그 후, 세포를 70 micron 나일론 메쉬 필터와 40 micron 나일론 메쉬 필터에 순차적으로 걸러 새로운 50 milliliters 폴리프로필렌 원추형 튜브에 담습니다. 부피를 5 milliliters의 PBS BSA DNase I로 조정한 후 세포 수를 측정합니다. 이어서 단일 세포 현탁액을 얼음 위에서 차가운 PBS BSA DNase I로 희석하여 최종 농도를 2 × 10⁷ cells/milliliter로 맞춥니다.메틸셀룰로스가 함유된 반고체 배지에서 배양한 췌장 콜로니의 전체 마운트 면역 염색을 위해, 먼저 분젠 버너를 사용하여 입구가 좁은 유리 파스퇴르 피펫을 준비합니다. 다음으로, 1 mL 피펫 팁의 작은 끝단을 벽이 얇은 고무 튜브의 한쪽 끝에 연결하고, 반대쪽 끝에는 마우스피스를 연결합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 피펫 팁의 넓은 끝단에 부착합니다.그 다음 1% 메틸셀룰로스가 포함된 DMEM/F12 배지 10~50 µL를 마우스 피펫으로 흡입합니다. 이제 콜로니가 담긴 디쉬를 도립 위상차 현미경 스테이지 위에 놓고 10배율 대물렌즈를 사용하여 피킹에 적합한 콜로니를 찾습니다. 그런 다음 피펫의 입구를 선택한 콜로니 옆에 두고, 입으로 천천히 흡입하여 단일 콜로니를 피킹합니다.효과적인 수집을 위해, 유리 피펫의 입구를 세포 집단 옆에 배치하기 전 관심 콜로니가 초점에 맞았는지 확인하는 것이 중요합니다. 콜로니를 수확한 후, 4% paraformaldehyde가 포함된 96-웰 플레이트의 한 웰에 피펫 팁을 넣고 콜로니를 해당 웰에 안착시킵니다. 모든 콜로니를 수집한 후, 4°C에서 부드럽게 흔들어주며 하룻밤 동안 콜로니를 고정합니다.다음 날 아침, 상온에서 10~30분 동안 PBS로 콜로니를 2회 세척합니다. 이 시점부터는 팁이 굽은 플라스틱 P10 피펫을 사용하여 콜로니를 채취하십시오. 2차 세척 후, 고정된 콜로니를 파라핀이 채워진 1.5 milliliter 튜브에 넣어 4 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다.그 다음, 콜로니를 웰당 200 microliters의 블로킹 버퍼가 들어 있는 바닥이 투명한 96-웰 블랙 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 플레이트를 4 °C에서 부드럽게 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 콜로니를 200 microliters의 목적 1차 항체가 들어 있는 새 웰로 옮겨 4 °C에서 부드럽게 흔들어주며 다시 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 아침, 콜로니를 0.1% Tween 20이 포함된 200 µL의 PBS가 들어 있는 세 개의 연속된 웰로 옮겨 실온에서 10분 동안 세척합니다. 세 번째 세척 후, 콜로니를 적절한 2차 항체 200 µL가 들어 있는 깨끗한 웰로 옮기고, 플레이트를 암실의 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 앞서 설명한 것과 같이 PBS Tween으로 콜로니를 세 번 세척하고, 콜로니를 DAPI가 들어 있는 새 웰로 옮겨 실온에서 5분 동안 처리합니다.그 후 면역 염색된 콜로니들을 35 millimeter 유리 바닥 페트리 접시에 모으고 커버 슬립으로 덮습니다. 마지막으로, 공초점 현미경을 사용하여 콜로니의 이미지를 촬영합니다. 콜로니 형성 능력은 CD133 Sox9/EGFP 양성 도관 세포에서만 발견되므로, 적절한 게이팅 파라미터를 이용한 형광 활성 세포 분류법을 통해 성체 췌장 전구 세포를 농축할 수 있습니다.그 후 도립 위상차 현미경을 통해 췌장 콜로니를 그 형태에 따라 분류할 수 있습니다. 핸드 피킹 후, 마이크로플루이딕 qRT-PCR 분석을 통해 유전자 발현을 분석하거나, 전체 마운트 면역 염색을 통해 단백질 발현을 분석할 수 있습니다. 실제로 많은 개별 콜로니들이 예를 들어 도관, 내분비 및 선세포의 계통 마커를 발현하며, 이는 이러한 콜로니를 형성하는 초기 췌장 콜로니 형성 전구세포의 대부분이 삼중 분화 능력을 갖추고 있음을 나타냅니다.숙달되면 박리, 해리, 세포 염색 및 소팅, 그리고 메틸셀룰로스가 포함된 반고체 배지로의 세포 도말 절차를 적절하게 수행했을 때 6~7시간 내에 완료할 수 있습니다. 콜로니 형성 후에는 quantitative RT-PCR, western blot 또는 인슐린 분비 분석과 같은 다른 방법들을 수행하여 콜로니의 유전자 발현이나 기능적 능력에 관한 추가적인 질문에 답할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 성체 마우스 췌장을 해리하는 방법과 메틸셀룰로스가 포함된 반고체 배양에서 생성된 췌장 전구세포 콜로니를 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

췌장과 같은 progenitors은 인슐린을 표현 식민지로 차별화할 수있는 3 차원 clonogenic 분석이 설명되어 있습니다. 이 방법은 메틸 셀룰로오스, Matrigel 및 성장 요인을 포함하는 반 고체의 미디어 활용,하는 하나의 progenitors는 분아 따위에 의해 중식과...

인슐린을 표현 콜로니를 형성 Progenitors에 대한 정량 분석

현재의 연구는 인간 배아 줄기 세포를 췌장 분화를 유도으로 이동 차별화 접근 방식에 대해 설명합니다. 큰 의미 중 인슐린을 표현하는 세포로 췌장 progenitors을 얻은​​ 인간 배아 줄기 세포를 찾는 것이 내피 세포 공동 배양 mediates의 성숙입니다.

인간 배아의 내피 세포 공동 배양 Mediates의 성숙은 감독 차별화 접근법에서 췌장 인슐린 생산 세포로 세포를 줄기

분리하는 프로토콜은, 인간 태아의 췌장 세포에서 파생 된 문화, 이미지 섬 세포 클러스터 (ICCS)를 설명한다. 이 방법은 조직, 문화, 단일 층으로 또는 집계 등의 현탁액 및 확산 마커와 췌장 세포의 운명 결정에 대한 이미지에서 ICCS을 생성하는 데 필요한 단계를 자세히 설명합니다.

인간의 태아 췌장 세포 클러스터의 분리, 문화, 및 이미징

이 프로토콜에 기재된 삼차원 배양법 분지 기관에 자신의 상당한 팽창, 분화 및 형태 발생을 포함한 분산 배아 마우스 췌장 전구 세포로부터 췌장 개발 되풀이되었습니다. 이 방법은 영상, 틈새 시장의 기능 장애 및 조작에 대한 의무입니다.

분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 생체 췌장 기관 형성에

여기에서는 시험 관내 NKX6-1 + 췌장 전구 세포에 인간 배아 줄기 세포가 분화하는 4 단째의 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은, 인간 다 능성 줄기 세포의 종류에 적용될 수있다.

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

여기, 선물이 해리 했다 부동성 e10.5 췌 장 창시자와 관련된 mesenchyme 3D murine pancreatoids을 표현 하는 인슐린을 생성 하는 프로토콜.

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

이 프로토콜은 생체 외에서췌장 계보로 인간 치과 펄프 줄기 세포 (hDPSC)를 분화하기위한 두 가지 다른 유도 프로토콜 사이의 비교를 제시합니다 : 통합 프로토콜 및 비 통합 프로토콜. 통합 프로토콜은 더 많은 인슐린 생산 세포(IPC)를 생성합니다.

시험관 내 췌장 혈통을 향한 인간 치과 펄프 줄기 세포의 유도

본 프로토콜은 평면 단일층에서 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터 유래된 췌장 전구세포에서 PDX1 및 NKX6.1 전사 인자의 동시 발현을 증가시키는 향상된 방법을 기술한다. 이것은 신선한 매트릭스를 보충하고, 세포 밀도를 조작하고, 내배엽 세포를 해리시킴으로써 달성됩니다.

2D 배양 시스템에서 인간 만능줄기세포를 췌장 베타세포 전구체로 분화

줄기세포를 섬세포로 분화하는 것은 기존의 당뇨병 치료 및 질병 모델링에 대한 대안을 제공합니다. 상용 분화 키트와 이전에 검증된 방법을 결합하여 접시에서 인슐린 분비, 줄기 세포 유래 섬을 생성하는 데 도움이 되는 자세한 줄기 세포 배양 프로토콜에 대해 설명합니다.

인간 만능 줄기세포를 인슐린 생산 섬 클러스터로 분화(Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-producing Islet Clusters)

이 기사에서는 β-cell 유사 세포의 유도 분화 및 기능 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 인슐린을 생산하는 췌장 세포를 생성하기 전에 인간 만능 줄기세포에 대한 최적의 배양 조건과 통로를 설명합니다. 6단계 분화는 최종 내배엽 형성에서 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 세포와 같은 기능적 β세포로 진행됩니다.

인간 만능 줄기세포에서 기능성 췌장 인슐린 분비 세포를 생성하기 위한 최적화된 프로토콜

우리는 인간 줄기세포에서 유래한 췌장 줄기세포 섬을 면역결핍 쥐에 근육 내 이식하여 생체 내 이식과 후속 분석을 위한 최소 침습 프로토콜을 제공합니다.

쥐에서 인간 다능성 줄기세포 유래 췌장 내분비세포의 근육 내 이식

배우세요 성체 쥐 췌장에서 분리한 전구 세포의 체외 식민지 분석 방법을 통해 자가재생 및 분화 능력을 평가하는 기술입니다. 이 방법은 개별 세포의 생물학적 잠재력을 규명하는 데 활용됩니다.

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

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