체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

이러한 프로토콜의 전반적인 목표는 반고체 배지를 함유한 메틸셀룰로오스를 사용하는 배양 분석을 사용하여 성체 마우스에서 분리된 췌장 전구 세포에서 성장한 세포 콜로니를 특성화하는 것입니다. 우리의 방법은 췌장 전구 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 성인 췌장에서 전구 세포의 자가 재생 및 분화 능력은 무엇입니까? 이러한 기술의 주요 장점은 개별 전구 세포를 연구할 수 있다는 것이며, 이는 진정한 생물학적 잠재력을 식별하는 데 중요합니다.

우리는 조혈 줄기 세포를 연구하는 콜로니 분석이 췌장 세포 집단에도 적용될 수 있다는 것을 깨달았을 때 이러한 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 제 연구실의 대학원생인 Jacob Tremblay, 박사후 연구원인 Janine Quijano 박사, 기술자인 Miss Angela Luo가 절차를 시연할 것입니다. 희생 후 가능한 한 빨리 가위를 사용하여 복벽의 정중선을 수직 절개하고 복강을 엽니다.

집게를 사용하여 비장을 부드럽게 들어 올려 비장과 췌장의 비장 엽 사이의 결합 조직을 가위로 자릅니다. 같은 방법으로 십이지장과 위엽의 결합 조직을 절단하고, 췌장 조직을 0.1% BSA와 항생제가 보충된 DPBS가 들어 있는 페트리 접시에 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 해부 현미경으로 가는 끝 집게를 사용하여 지방 조직을 제거합니다.

이제 췌장을 조직 배양 후드로 옮기고 각각 10ml의 차가운 PBS와 BSA가 포함된 3개의 순차적인 100mm 페트리 접시에서 조직을 헹굽니다. 최종 세척 후 췌장을 멸균 건조 페트리 접시에 넣어 PBS와 BSA를 최대한 많이 제거하고 조직을 얼음 위의 다른 건조 페트리 접시로 옮깁니다. 다음으로, 스프링 가위를 사용하여 미세한 조직 조각이 생성될 때까지 2-3분 동안 췌장을 다진 다음 새로 준비한 2-3ml의 차가운 PBS BSA DNase I 용액에 조직 조각을 현탁시킵니다.

10ml 피펫을 사용하여 조각을 50ml 원추형 튜브로 옮기고 총 부피를 최대 10ml까지 끌어올리기에 충분한 PBS BSA DNase I을 추가합니다. 그런 다음 350-450 마이크로 리터의 콜라겐 분해 효소 B를 조직에 첨가하십시오. 튜브를 섭씨 37도의 수조에 8분 동안 넣고 3-4분마다 소용돌이치며 넣습니다.

배양이 끝나면 16 및 16 게이지 반의 바늘이 달린 10 밀리리터 주사기를 사용하여 실온에서 50 밀리리터 튜브의 벽을 따라 조직 용액을 7 번 분사합니다. 그런 다음 티슈를 수조에 다시 8분 동안 넣고 가끔 소용돌이치며 방금 시연한 대로 주사기를 7번 통과시킵니다. 마지막 기계적 중단 후 세포 현탁액의 10마이크로리터 분취액을 건조 페트리 접시에 옮기고 10x 대물 렌즈가 있는 반전 위상차 광학 현미경 아래에서 단일 세포와 작은 크기의 세포 클러스터의 존재를 확인합니다.

다음으로, 얼음에 튜브를 놓고 PBS BSA DNase I. 원심 분리기로 총 부피를 최대 50 밀리리터로 가져 와서 P1000 피펫을 사용하여 차가운 PBS BSA DNase I.Then 70 미크론 나일론 메쉬 필터를 통해 세포를 필터링하고 40 미크론 나일론 메쉬 필터를 새로운 50 밀리리터 폴리 프로필렌 원추형 튜브로 필터링합니다. 부피를 PBS BSA DNase I의 5ml로 조정하고 세포를 계수합니다. 그런 다음 단일 세포 현탁액을 얼음 위의 차가운 PBS BSA DNase I에서 밀리리터당 7개 세포의 2배 10의 최종 농도로 희석합니다.

반고체 매체를 함유한 메틸셀룰로오스에서 자란 전체 마운트 면역염색 췌장 집락을 만들려면 먼저 분젠 버너를 사용하여 미세한 구멍이 있는 유리 파스퇴르 피펫을 준비합니다. 다음으로, 1밀리리터 피펫 팁의 작은 끝을 얇은 벽으로 된 고무 튜브의 한쪽 끝에 부착하고 마우스피스를 다른 쪽 끝에 부착합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 피펫 팁의 큰 쪽 끝에 부착합니다.

그런 다음 10-50 마이크로리터의 DMEM/F12 배지와 1% 메틸셀룰로오스를 입 피펫에 주입합니다. 이제 군집 접시를 반전 위상차 현미경 스테이지에 놓고 10x 대물렌즈를 사용하여 채취에 적합한 군체를 찾습니다. 그런 다음 관심 식민지 옆에 피펫 구멍을 놓고 입에 천천히 흡입하여 단일 식민지를 선택합니다.

효과적인 채취를 위해서는 세포 클러스터 옆에 유리 피펫 개구부를 배치하기 전에 관심 콜로니에 초점이 맞춰져 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 콜로니를 수확하면 피펫 팁을 4%파라포름알데히드가 포함된 96웰 플레이트의 한 웰에 넣고 콜로니를 웰에 넣습니다. 모든 군체를 채취한 후 부드럽게 흔들면서 밤새 군체를 섭씨 4도에서 고정합니다.

다음 날 아침, 실온에서 10-30분 동안 PBS로 군체를 두 번 씻습니다. 이 시점부터는 팁이 구부러진 플라스틱 P10 피펫을 사용하여 집락을 집습니다. 두 번째 세척 후 고정된 집락을 섭씨 4도의 파라핀으로 채워진 1.5mm 튜브에 밤새 보관하십시오.

그런 다음 콜로니를 웰당 200마이크로리터의 차단 버퍼를 포함하는 투명한 바닥이 있는 96웰 블랙 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 접시를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 다음 날 아침, 200마이크로리터의 1차 관심 항체가 들어 있는 새로운 웰로 콜로니를 옮겨 섭씨 4도에서 부드러운 쉐이킹으로 또 다른 하룻밤 배양을 합니다.

다음 날 아침, 200마이크로리터의 PBS와 0.1%Tween 20을 포함하는 3개의 연속 웰로 콜로니를 실온에서 10분 동안 세척합니다. 세 번째 세척 후 콜로니를 200마이크로리터의 적절한 2차 항체가 들어 있는 깨끗한 웰로 옮기고 어둠 속에서 2시간 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다. 배양이 끝나면 방금 시연한 대로 PBS Tween에서 군체를 세 번 세척하고 실온에서 5분 동안 군체를 DAPI의 새 웰로 옮깁니다.

그런 다음 면역 염색된 집락을 35mm 유리 바닥 페트리 접시에 넣고 커버 슬립으로 덮습니다. 마지막으로, 컨포칼 현미경에서 군체를 이미지화합니다. 성체 췌장 전구 세포는 집락 형성 능력이 CD133 Sox9/EGFP 양성 관 세포 내에서만 발견되기 때문에 적절한 게이팅 매개변수를 사용하여 형광 활성화 세포 분류를 통해 농축할 수 있습니다.

그런 다음 췌장 군집은 반전 위상차 광학 현미경에 의해 형태에 따라 분류할 수 있습니다. 손으로 채취한 후 유전자 발현을 위한 미세유체 qRT-PCR 분석 또는 단백질 발현을 위한 전체 마운트 면역염색으로 콜로니를 분석할 수도 있습니다. 실제로, 많은 개별 콜로니는 관, 내분비 및 아시나르 세포에 대한 계통 마커를 발현하는데, 이는 이러한 콜로니의 선조를 형성하는 초기 췌장 콜로니의 대다수가 삼중전능임을 나타냅니다.

일단 숙달되면 해부, 박리, 세포 염색 및 분류, 반고체 배지를 함유한 메틸셀룰로오스로 세포 도금 절차를 적절하게 수행할 경우 6-7시간 내에 완료할 수 있습니다. 군체 형성 후 정량적 RT-PCR, 웨스턴 블롯 또는 인슐린 분비 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 군체의 유전자 발현 또는 기능적 능력에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 성체 쥐 췌장을 해리하는 방법과 반고체 배양을 포함하는 메틸셀룰로오스에서 췌장 전구 세포 생성 콜로니를 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.