Name: 뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 배우세요 뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 기법을 활용한 신경 세포 전기 활성 측정 방법입니다. 이 기술은 신경과학 연구에서 특정 뇌 영역의 뉴런 활동 변화를 분석하는 데 필수적입니다.

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이 연구는 UT 사우스 웨스턴 시작 기금 (SK)에 의해 지원되었다.

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
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<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).</li>
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<li>Mozzachiodi, R., Byrne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+synaptic+plasticity%3A+role+of+nonsynaptic+plasticity+in+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">More than synaptic plasticity: role of nonsynaptic plasticity in learning and memory.</a> Trends Neurosci. 33 (1), 17-26 (2010).</li>
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<li>Kourrich, S., Calu, D. J., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+plasticity%3A+an+emerging+player+in+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intrinsic plasticity: an emerging player in addiction.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (3), 173-184 (2015).</li>
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<li>Sandi, C., Haller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+the+social+brain%3A+behavioural+effects+and+neurobiological+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stress and the social brain: behavioural effects and neurobiological mechanisms.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (5), 290-304 (2015).</li>
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<li>Ganguly, K., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neural+plasticity+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside.</a> Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).</li>
<li>Kullmann, D. M., Moreau, A. W., Bakiri, Y., Nicholson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Plasticity of inhibition.</a> Neuron. 75 (6), 951-962 (2012).</li>
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<li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolleman%2C+A+%22Patch+Clamping%3A+An+Introductory+Guide+To+Patch+Clamp+Electrophysiology%22">Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).</li>
<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Am%22%5BJournal%5D)">The patch clamp technique.</a> Sci Am. 266 (3), 44-51 (1992).</li>
<li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Exp Neurol. 131 (1), 133-143 (1995).</li>
<li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> J Neurosci Methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li>
<li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices%3A+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> J Neurosci Methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li>
<li>Kourrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interaction+between+sigma-1+receptor+and+Kv1.2+shapes+neuronal+and+behavioral+responses+to+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic interaction between sigma-1 receptor and Kv1.2 shapes neuronal and behavioral responses to cocaine.</a> Cell. 152 (1-2), 236-247 (2013).</li>
<li>Kourrich, S., Klug, J. R., Mayford, M., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPAR-Independent+Effect+of+Striatal+aCaMKII+Promotes+the+Sensitization+of+Cocaine+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AMPAR-Independent Effect of Striatal aCaMKII Promotes the Sensitization of Cocaine Reward.</a> J Neurosci. , (2012).</li>
<li>Kourrich, S., Rothwell, P. E., Klug, J. R., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+experience+controls+bidirectional+synaptic+plasticity+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cocaine experience controls bidirectional synaptic plasticity in the nucleus accumbens.</a> J Neurosci. 27 (30), 7921-7928 (2007).</li>
<li>Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+neurons%2C+opposite+adaptations%3A+psychostimulant+experience+differentially+alters+firing+properties+in+accumbens+core+versus+shell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Similar neurons, opposite adaptations: psychostimulant experience differentially alters firing properties in accumbens core versus shell.</a> J Neurosci. 29 (39), 12275-12283 (2009).</li>
<li>Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+novelty+causes+stress-like+adaptations+at+nucleus+accumbens+synapses%3A+implications+for+studying+addiction-related+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Environmental novelty causes stress-like adaptations at nucleus accumbens synapses: implications for studying addiction-related plasticity.</a> Neuropharmacology. 61 (7), 1152-1159 (2011).</li>
<li>Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+adaptations+in+the+nucleus+accumbens+caused+by+experiences+linked+to+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Synaptic adaptations in the nucleus accumbens caused by experiences linked to relapse.</a> Biol Psychiatry. 69 (11), 1124-1126 (2011).</li>
<li>Koya, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+synapses+in+selectively+activated+nucleus+accumbens+neurons+following+cocaine+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Silent synapses in selectively activated nucleus accumbens neurons following cocaine sensitization.</a> Nat Neurosci. 15 (11), 1556-1562 (2012).</li>
<li>Conrad, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+accumbens+GluR2-lacking+AMPA+receptors+mediates+incubation+of+cocaine+craving%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving.</a> Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).</li>
<li>Kruskal, P. B., Jiang, Z., Gao, T., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+patch+clamp%3A+nanotechnologies+for+intracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Beyond the patch clamp: nanotechnologies for intracellular recording.</a> Neuron. 86 (1), 21-24 (2015).</li>
<li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale-targeted+patch-clamp+recordings+of+functional+presynaptic+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nanoscale-targeted patch-clamp recordings of functional presynaptic ion channels.</a> Neuron. 79 (6), 1067-1077 (2013).</li>
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저자의 아무도는 경쟁의 이익 또는 충돌하는 이해 관계가 없습니다.

이 프로토콜은 뇌 조각의 뉴런에서 전체 셀 패치 클램프 실험을 수행하기위한 기본 절차를 설명합니다. 그러나,이 기술의 복잡성 전위 감도 완전이 문서에서 설명 될 수 없다. 여기, 우리는 가장 기본적인 단계를 묘사하고 성공적이고 엄격한 전체 세포 녹음을 달성하기위한 제어해야합니다 중요한 매개 변수를 강조하기 위해 노력했다. 더 이론적 인 학습, 많은 책과 기사는 뇌 조각 3,21-24과 세포 생존 능력을 강화하기 위해 25 ~ 27을 사용하는 솔루션을 구체화 할 수 있습니다 방법 모두에서 전체 셀 패치 클램프 녹음에 발표되었다. 정기적으로 적절한 녹음을 수행하기 위해 집중적 인 연습을 통해 기술 능력의 향상이 필요합니다. 시냅스 기능과 고유 excitabi의 변화에​​ 대한 중요한 정보를 제공하는 단계의 적절한 응용 프로그램이 언급​​과 그럼에도 불구하고, 세포가 패치 할 수있는 시간 사후,lity. 일반적으로, 신중 모두 ACSF 내부 ...

패치 클램프 기술은, 1970 년대 후반에 개발 1,2-되었습니다 전기 생리 기술은 실시간 조직에서 단일 또는 다중 이온 채널의 기능을 연구하기위한 기본 툴이다. 달성 될 수있는 다른 패치 구성 중에서, 전체 셀 패치 클램프 기록은 뉴런의 주요부의 전기적 성질의 조사를 허용한다. 고전적으로,이 기술은 시험 관내에서 두 뇌 조각 갓 해리 뉴런 또는 세포 배양 모델 (3)에 행해진 다. 뇌 조각 뉴런에서 수행하는 경우,이 기술은 여러 가지 장점을 제공한다. 특히, (I) 신경 세포는 다소 상대적으로 보존 된 뇌 회로에 기록되고, 세포 배양 용 제제에 비해 3 생리 관련이있는 환경을 제공한다. 이것은 급성 pharmacolog 임의의 유형에 의해 유발되는 세포 및 분자 사건을 초기에 포착, 또는 실시간으로 모니터링 할 수있게iCal의 조작 - 생체 내 조건의 전형적인 사용하여 달성 될 수없는 시간 해상도; 시각적으로 뇌 조각에 뇌 영역을 식별에 (II) 기능은 모두가 형광 마커를 표현 할 때 뇌 영역은 공부에 대한 특정 신경 세포에 대한 높은 지역 특이성 3 수 있습니다; (ⅲ) (세포 내 레코딩을위한 날카로운 마이크로 피펫으로 막을 천공 대조적으로) 원형질막의 상당 부분을 열어 세포의 세포 내 공간에 접근 4. 차례로,이 내부 용액을 구성하는 특정 이온의 함량 또는 농도가 너무 분자 표적을 수정할 또는 셀룰러 메커니즘이 상이한 조건 하에서 조사 될 수 있습니다. 예를 들어, 전체 셀 구성, 특정 약학 제 (예 : 길항제) 설정시 한 기록 마이크로 피펫 (패치 피펫) 용액에 직접 세포질 내로 확산 및 putat에 역할을 추가 할 수 있다는이웃하는 셀들에 상기 타겟의 기능을 변경하지 않고 세포 내 표적 필자. 또한, 마이크로 피펫 날카로운 기록 비교 패치 클램프 전극의 선단에 큰 개구 낮은 저항, 낮은 경쟁중인 잡음 및 셀 (4)의 내부로 더 따라서 전기적 접속을 제공한다. 그러나, 피펫 팁에 큰 구멍이 셀 투석으로 이어질 및 연구 5,6에서있는 생명 현상의 발현에 중요 할 수있다 세포 내 분자 기계함으로써 손실 할 수 있습니다. 이 경우, 날카로운 전극 녹음이 더 적합 할 수있다. 녹음이 유형시켜 세포 내 공간과 내부 피펫 용액의 이온 교환을 최대한 방지 전체 셀 녹음에 사용되는 것보다 훨씬 작은 기공을 가진 마이크로 피펫을 필요로한다. (급성 또는 만성) 경험의 모든 형태를 포함 남용 11,1의 약물에 노출 7-10 학습2 등 응력 13,14은 특정 뇌 영역에서의 신경 기능의 다양한 측면을 변경할 수있다. 이러한 변화는 종종 (일 시간)을 개발하기 위해 시간을 필요로하기 때문에, 특정 경험을받은 동물의 뇌 조각에서 전체 셀 녹음 연구자들은 이러한 변화를 식별 할 수 있습니다. 기본적으로 (모든 경우) 신경 세포의 기능 (예를 들면, 리간드 - 활성화 된 이온 채널 전압 관문 이온 채널, 신경 전달 물질 트랜스 포터)함으로써 뇌 회로 활동 및 동작 환경에 의해 변경 될 수있다 (환경 의존성 참여 요소 많은 소성) 10,15-17. 신경 수준에서 뇌 회로의 활동이 시냅스 사이의 지속적인 상호 작용 (예를 들면, 글루타메이트 전송) 및 고유 세포의 흥분 요인 (예를 들어, axosomato-수지상 이온 채널에서 나온다 : 칼륨, K +, 나트륨, 나트륨 + 칼슘, 칼슘 2 + ). 도 ë을 사용하여 특정 조건에서전자 셀 패치 클램프 전기 생리학 기술, 시냅스 대 고유 흥분의 변화에​​서 특히 발생하는 신호 변경은 분리 될 수있다. 대부분의 경우, 시냅스 흥분성 전체 셀 전압 - 클램프 기술을 이용하여 평가된다. 본 촬영 모드는 α 아미노 -3- 히드 록시 -5- 메틸 -4- isoxazolepropionic 산 수용체에 의해 매개되는 예를 들어, 이온 전류 [의 측정 (허용 AMPA 수용체)와 신경 세포막을 통한 N 메틸 -D- 아스파르트 산 수용체 (NMDA 수용체)] 세트 전압의 막전위 채. 여기에서, 실험자는 세슘을 포함하는 내부 마이크로 피펫 솔루션 (고사 +), K + 채널의 폭 넓은 차단제 (키 고유 흥분 요인)를 사용합니다. 전체 셀 구성의 확립되면, 세포 내 공간에서 고사 +의 확산은 K + 채널을 차단하고, 이에 상대적으로 효율적인 공간 클램프 및 사전을 모두 허용다른 측정치들에 내재 흥분성 요인의 영향 벤트. 불규칙한 모양의 세포 (예를 들어, 신경 세포), 그리고 18, 19 아버 광대하고 복잡한 수지상 특히 신경을 녹음 할 때 공간 클램프의 문제, 즉, 전압 클램프에 어려움 전체 셀은 발생한다. 체세포 전압 클램프 저조한 제어 뉴런의 수지상 트리 전압 때문에, 연구중인 수지상 전기 신호의 다양한 양태는 수지상의 거리에 비례하여 변형된다. (인공 뇌 - 척수액, ACSF) 세포 외 용액에 용해 된 이러한 피크로 톡신 (감마 - 아미노 산, GABA 수용체 길항제) 또는 kynurenic 산 (글루타메이트 수용체의 광범위한 차단제)와 같은 약물 학적 도구와 결합하여,이 기술은 글루타메이트를 측정 할 수 있도록 수용체 -와 GABA 각기 전류를 R은 중재. 대조적으로, 극한의 흥분은 일반적으로 전류 - 클램프 기록 모드에서 평가된다.전압 클램프 기록 반대로, 본 촬영 모드는 신경 세포막에 흐르는 이온 전류에 의한 막 전위의 변화를 측정 할 수있다. 뉴런 나 +와 K + 채널 모두를 필요로 활동 전위를 생성하기 위해 일반적으로 고유 흥분의 변화는 능력의 변화를 통해 평가된다. 현재 클램프 녹음을 수행 할 때 따라서, 가능한 Micropipette는 K + 대신 고사 +를 포함하는 내부 용액으로 채워집니다. 글루타메이트와 GABA에게 ACSF에 용해 된 수용체 매개 전류 차단되는 약물과 결합하여,이 실험 설계 시냅스 흥분성의 전위 변화에 의해 오염되지 않고 신경 소성 본질적인 요인 (예를 들면, K는 + 채널)의 기여를 측정 할 수 있도록 요인. 이 문서에서는 t 기본 필요한 절차 단계를 설명합니다O (I) 건강한 뇌 조각을 제조; (ⅱ) 전체 셀 구성을 달성하고, (ⅲ) 극한 흥분성 시냅스 및 평가하는 기본 파라미터를 모니터링한다.

<table><tbody><tr><td>절연 펄스 자극 생성기</td><td>A.M.P.I</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>절연 유닛 (ISO-Flex)</td><td>A.M.P.I</td><td>ISO-Flex</td><td></td></tr><tr><td>컴퓨터 제어 증폭기&nbsp;</td><td>분자 장치</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>디지털 수집 시스템</td><td>분자 장치</td><td>Digidata 1500</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>BX-51</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>챔버 및 인라인 히터</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Slicer Leica&nbsp;</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 풀러</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>이미징 카메라</td><td>Q 이미징</td><td>QIClick-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>Narishige 피펫 풀러 PC-10</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td></td><td>WPI TW150F-3</td><td></td></tr><tr><td>슬라이스 홀드 다운 (하프)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0255</td><td></td></tr><tr><td>Slice 챔버</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>비금속 주사기 바늘</td><td>세계 정밀 기기</td><td>MF28G67-5</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Nalgene</td><td>176-0045</td><td></td></tr><tr><td>글루 건</td><td>홈 디포</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>가스 분산 튜브</td><td>Ace Glass Inc.</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>참수 가위</td><td>Home Depot</td><td>100649198</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들 #3</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>작은 직선 날카로운 팁 가위</td><td>세계 정밀 기기</td><td>14218</td><td></td></tr><tr><td>용기 캐끰레이션 펜셉스&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>500453</td><td></td></tr><tr><td>곡선형 지혈 겸자</td><td>World Precision Instruments</td><td>501288</td><td></td></tr><tr><td>이코노미 핀셋 #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>501976-6</td><td></td></tr><tr><td>주</td>걱 <td>Fisher Scientific</td><td>14357Q</td><td></td></tr><tr><td>스쿱 주걱</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747B</td><td></td></tr><tr><td>여과지</td><td>Lab Depot</td><td>CFP1-110</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Solutions</td></tr><tr><td colspan="4">Cs-Gluconate 내부 용액 (pH 7.2&ndash; 7.3, 280&ndash; 290 mOsm)</td></tr><tr><td>D-gluconic acid 50%&nbsp;</td><td>시그마 Aldrich/다양한</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Cesium-OH (CsOH) 50%&nbsp;</td><td>시그마 알드리치/다양한</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 2.8mM</td><td>시그마 알드리치/다양한</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 20mM</td><td>시그마 알드리치/다양한</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0.4mM</td><td>시그마 알드리치/다양한</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>테트라에틸암모늄-Cl, 5mM</td><td>시그마 알드리치/다양한</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>Na2GTP, 0.3mM</td><td>시그마 Aldrich/various</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">K-Gluconate 내부 용액 (pH 7.2&ndash; 7.3, 280&ndash; 290 mOsm)</td></tr><tr><td>K D-gluconate, 120 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KCl, 20 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0.2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Na2GTP, 0.3 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity &asymp; 300-310 mOsm)</td></tr><tr><td>KCl, 2.5 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 119 mM</td><td>Sigma Aldrich/ 다양한</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&#8226; H2O, 1 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, 26.2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, 11 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O, 1.3 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2- 2H2O, 2.5 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">용액 준비에 사용되는 추가 화합물</td></tr><tr><td>KOH</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>K3375</td><td></td></tr></tbody></table>

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

전체 셀 패치 클램프 기록은 신경 세포의 상당한 부분의 전기적 특성의 조사를 허용하는 전기 생리 기술이다. 이러한 구성에서, 마이크로 피펫은 이전에 사용 된 세포 날카로운 전극 기록 방법보다 더욱 정확한 이온 전류 측정 전류 누설을 방지함으로써 제공 세포막에 밀착된다. 고전적으로, 전체 셀 기록 세포 배양 모델 해리 신경 뇌 조각 뉴런 제제를 포함하는 다양한 형태의 신경 세포에서 수행하고, 그대로 마취 또는 웨이크 동물 일 수있다. 요약하면,이 기술은 대단히 흥분 세포의 수동 및 능동 생물 물리학 적 특성의 이해에 기여하고있다. 이 기술의 주요 장점은 조작 (예, 약물은 실험자 유도 가소성)는 특정한 신경 기능 또는 C를 변경할 수있는 방법의 특정 정보를 제공하는 것이다실시간 hannels. 또한 세포막의 중요한 개구 내부 피펫 용액 자유롭게 도입하는 약물, 예를 들어 작용제 또는 특정 세포 단백질의 길항제를위한 수단을 제공하며 인접 셀의 기능을 변경하지 않고 이러한 대상을 조작하는 세포질 내로 확산 할 수있다. 전체 셀 기록에 초점이 문서는 뇌 조각의 뉴런에 생리 학적으로 관련 맥락에서, 즉 상대적으로 잘 보존 된 뇌 회로에 신경을 기록하는 장점을 가지고 준비를 시행 하였다. 특히, 적절한 약리학과 결합 될 때, 이러한 기술은 학습, 약물 남용에 대한 노출, 스트레스 등의 경험 중 어느 방식에 따른 구체적인 neuroadaptations 발생을 식별 할 수있는 강력한 도구이다. 요약하면, 뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음은 생체 준비를 오래 지속 변화를 측정 할 수있는 수단을 제공신경 기능에 해당 그대로 깨어 동물에서 개발했습니다.

온도 용이 실험자에 의해 제어되는 요소는, 이온 채널과 수용체의 생물 리 학적 특성에 영향을 미치는, 이로써 시냅스 전류 (PSC를) (EPSC 및 IPSCs) 스파이크를 유발하는 신경 기능의 파형.도 3 도 4는 신경 세포에 소성 온도의 영향을 각각 유발 EPSCs (eEPSCs)의 기울기를 나타낸다. 소성 패턴 (도 3)는 초과되어 조정 개구 특정 전압 - 게이트 이온 채널을 폐쇄함으로써 형성된다 (즉, 1 차 스파이크 레이턴시, 수, 주파수 및 활동 전위 파형 스파이크) (NA +, 칼슘 + 및 K +), 온도에 민감한 공정. 평균 스파이크 수는 온도에 따라 증가하는 방법 3은 그림. 스파이크 freque하지만 여기에 설명 된 실험 조건 (MSNs 녹...

이 프로토콜은 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하기위한 기본 절차 단계를 설명합니다. 이 기술은 신경 세포의 전기적 동작의 연구를 허용하고, 뇌 조각에서 수행하는 경우, 여전히 상대적으로 잘 보존 된 뇌 회로에 통합되어 신경 세포에서 다양한 신경 기능의 평가를 할 수 있습니다.

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

본 절차의 전반적인 목표는 갓 분리한 뇌 절편에서 전세포 패치클램프(whole-cell patch-clamp) 기록을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 실험적 조작이 특정 뇌 영역 내 특정 뉴런의 활성을 어떻게 변화시키는지와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 깨어 있는 완전한 상태의 동물에서 발달한 뉴런 기능의 장기적인 변화를 ex vivo 표본에서 식별할 수 있는 수단을 제공한다는 점입니다.이 방법은 뇌 절편의 신경세포 기능에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 배양 세포나 생체 내(in vivo) 신경세포와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 본 실험 과정은 저희 연구실의 학생인 Francisco Garcia-Oscos가 시연하겠습니다. 먼저, 플라스틱 트리밍 팁 전송 피펫을 사용하여 회복 챔버에서 뇌 절편 하나를 조심스럽게 흡입합니다.전송 피펫을 기록 챔버에 넣고, 피펫을 살짝 눌러 뇌 절편을 챔버 바닥의 커버슬립 위에 놓습니다. 다음으로, 현미경 4배율 대물렌즈를 사용하여 원하는 영역이 기록 챔버의 정중앙에 오도록 절편의 위치를 잡습니다. 원하는 위치가 잡히면, 하프(harp)라고도 알려진 절편 고정 장치를 사용하여 뇌 절편의 위치를 고정합니다.그 후, 40배 대물렌즈로 교체하고 렌즈가 챔버 내의 ACSF에 닿을 때까지 천천히 내립니다. 그런 다음 미동나사를 사용하여 조직의 초점을 맞춥니다. 초점이 조직 수준에 맞춰지면 표적 영역의 세포를 관찰합니다.이제 표적 세포를 찾으십시오. 기록용 마이크로피펫의 안내를 돕기 위해 컴퓨터 화면에 이를 표시합니다. 기록용 마이크로피펫을 배치할 충분한 공간을 확보하기 위해 대물렌즈를 올리십시오.이 단계에서는 1 mL 시린지, 비금속 마이크로시린지 바늘 및 전용 필터를 사용하여 미리 준비한 내부 용액을 마이크로피펫에 채웁니다. 마이크로피펫 내부에 기포가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 마이크로피펫을 전극 홀더에 장착하여 용액이 염화은 코팅 와이어 전극과 접촉하도록 합니다.피펫 캡을 조여 콘 와셔가 마이크로피펫 주변을 밀봉하게 합니다. 다음으로, 이물질이 유입되는 것을 방지하기 위해 피펫 홀더에 연결된 공기 충전 시린지로 양압을 가한 후 마이크로피펫을 ACSF에 담급니다. 마이크로 조작기를 사용하여 피펫을 챔버 쪽으로 내려, 침지 렌즈의 중심부 아래에 대략적으로 위치하도록 안내합니다.마이크로 조작기를 사용하여 중간에서 빠른 속도로 마이크로피펫을 이동시키며, 컴퓨터 화면에서 마이크로피펫의 위치를 확인하고 XY 축을 따라 세포가 있는 위치로 유도합니다. 동시에 전압 단계를 인가하여 마이크로피펫의 저항을 측정합니다. 양압을 가하여 마이크로피펫을 막고 있는 기포나 기타 이물질을 제거합니다.마이크로피펫을 세척한 후, 피펫 전류를 0으로 줄이기 위해 전압 오프셋을 수행합니다. 현미경의 미세 초점 조절 휠을 사용하여, 마이크로피펫을 서서히 내리면서 아래쪽으로 초점을 맞추기 시작합니다. 마이크로피펫 팁이 슬라이스 내부로 갑자기 뚫고 들어가지 않도록 항상 먼저 아래쪽으로 초점을 맞춘 다음, 마이크로피펫을 초점 평면까지 내리십시오.마이크로피펫이 슬라이스 표면에 닿으면, 마이크로 조절기의 속도를 중간 낮음 모드로 낮춥니다. 가벼운 양압을 살짝 가해 경로상의 이물질을 제거하십시오. 그 다음, XYZ 조절 노브를 교대로 조작하거나 Z축 노브를 회전시켜 XZ축이 모두 변경되는 대각선 방향으로 접근하여 세포에 다가갑니다.마이크로피펫이 세포에 충분히 가까워지면 세포 표면에 딤플(dimple)이 나타납니다. 이제 밀봉(seal)을 형성하기 위해 피펫 홀더 흡입 튜브에 연결된 튜브를 통해 약하고 짧게 흡입을 가합니다. 기가실(giga-seal)이 형성되는 동안, 컴퓨터 제어 증폭기 명령어를 사용하여 세포 유지 전위를 생리학적 휴지 전위로 맞춤으로써 막이 파열되었을 때 갑작스러운 변화가 일어나는 것을 방지합니다.기가씰(giga-seal)이 형성된 후, 빠른 또는 느린 정전용량을 보정합니다. 이때 흡입력이 너무 강하지 않게 조절하는 것이 매우 중요합니다. 그렇지 않으면 씰이 형성되기 전에 막이 파열될 수 있습니다.실(seal)이 안정적이고 1 GΩ 이상으로 유지되면, 짧고 강한 흡입을 가하여 세포막을 파열시킵니다. 흡입은 짧아야 하며, 실을 형성할 때 가한 압력보다 더 강해야 합니다. 이는 막을 적절히 파열시켜 안정적인 전체 세포(whole-cell) 구성을 달성하기 위함입니다.막 테스트에서 세포 모드로 전환하여 입력 저항, 직렬 저항, 막 커패시턴스와 같은 세포의 다양한 파라미터를 확인합니다. whole-cell 구성이 완료된 후에는 기록하는 동안 이러한 파라미터들을 지속적으로 모니터링하십시오. 여기 제시된 내용은 단일 nucleus accumbens shell MSN에서 유도된 EPSC slope의 예시입니다.온도를 24°C에서 28°C, 그리고 32°C로 높이면 유발된 EPSC의 기울기가 증가합니다. 여기서 유발된 EPSC의 진폭은 -80 mV의 전압 클램프 모드에서 측정되었습니다. 직렬 저항이 증가하면 유발된 EPSC의 진폭이 감소합니다.여기에 입력 저항이 뉴런의 스파이크 생성 능력에 미치는 영향을 보여주는 두 뉴런의 트레이스 예시가 있습니다. 뉴런들은 전류 클램프 상태에서 -80 mV로 유지되었습니다. 입력 저항이 증가함에 따라 활동 전위의 수도 함께 증가합니다.이 실험 절차를 수행할 때, 건강한 뇌 절편을 제작하는 것이 매우 중요하다는 점을 기억하십시오. 또한 직렬 저항, 입력 저항 및 온도와 같이 전기 신호 파형에 영향을 줄 수 있는 매개변수들을 모니터링하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 뇌 절편 내 전체 세포 기록(whole-cell recording) 기술의 기본적인 측면에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

whole-cell-patch-clamp-recordings-in-brain-slices

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 마우스 뇌 슬라이스의 전체 세포 패치 클램프 기술을 보여줍니다. 이 기술은 마이크로피펫과 뉴런 멤브레인 사이에 안정적인 연결을 구축하며, 이는 뉴런의 건강과 생리적 반응을 연구하기 위한 전체 세포 구성을 확립하기 위해 더욱 파괴됩니다.

Patch Clamp 방법을 통한 전체 셀 구성 설정

이 비디오는 수지상 멤브레인 표면에서 패치 클램프 기록 기술을 보여줍니다. 이는 도파민 뉴런에서 수상돌기와 그 아래에 있는 전위의존성 이온 채널의 전기적 특성을 직접 조사하는 데 도움이 됩니다.

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

이 비디오는 뇌 절편 근처에 가는 뾰족한 피펫을 배치하여 신경 세포와 밀봉을 형성하는 방법을 보여줍니다. 흡입은 세포막을 파괴하여 전기생리학 실험을 위한 전류 측정을 가능하게 하는 전체 세포 패치 클램프를 생성합니다.

Brain Slices의 전기생리학적 기록을 위한 전체 셀 전압 클램프 구성 설정

이 비디오는 뉴런 발화 패턴을 분석하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 척수 절편의 SG(substantia gelatinosa) 뉴런에서 전기생리학적 기록을 수행하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 척수의 SG 뉴런의 자극에 대한 신경 반응을 연구할 수 있습니다.

척수 절편의 실질체 젤라티노사 뉴런에서 기록하는 전체 세포 패치 클램프

이 비디오는 뇌 절편을 고정하고, 전체 세포 구성을 달성하기 위해 피펫을 배치하고, 시냅스후 반응을 기록하도록 시냅스전 뉴런을 자극하여 뉴런 연결을 매핑하는 절차를 보여줍니다.

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices(급성 뇌 절편에서 뉴런 연결의 쌍을 이룬 패치 클램프 기록)

급성 뇌 절편에서 시냅스로 결합된 뉴런의 패치 클램프 기록 및 동시 세포 내 바이오사이틴 충전을 통해 구조적 및 기능적 특성의 상관 분석을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 뉴런 미세 회로에서 전기생리학적 기록의 필수 기술 단계와 후속 형태학적 분석을 설명하는 것입니다.

급성 뇌 조각에서 신경 세포의 미세 회로의 전기 생리 및 형태 학적 특성은 페어 패치 클램프 녹음을 사용하여

이 프로토콜에서는 최적화 된 N의 구현을 보여 줍니다.-메 틸-D-glucamine (NMDG) 보호 복구 방법의 뇌 조각 준비. 단일 미디어 공식 안정적으로 다양 한 실험적인 응용 프로그램에 대 한 어떤 나이의 동물에서 건강 한 뇌 조각 얻을 하는 데 사용 됩니다.

최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

Subcellular patch-clamp recordings는 수상돌기의 기능적 특성을 조사할 수 있는 가능성을 제공합니다. 그러나 이러한 미세한 구조는 직경이 작기 때문에 쉽게 접근할 수 없습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 in vitro에서 도파민 뉴런의 수상돌기로부터 안정적이고 신뢰할 수 있는 기록 수집을 용이하게 하는 것을 목표로 합니다.

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

조각 패치 클램프 기술 기본 속성 및 흥분 성의 또는 억제 시 냅 스의가 소성 학습 유도 된 변화를 분석 하기 위한 효과적인 방법입니다.

조각 패치 클램프 기술 학습 유도 소성을 분석 하기 위한

여기, 선물이 급성 뇌 조각에 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 기능 시 냅 스 다양성을 평가 하기 위한 프로토콜.

전기 생리학 전체 셀 패치 클램프를 사용 하 여 시 냅 스 다양성의 평가

여기에서 우리는 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH) 세포의 주요 조절자인 키스펩틴 뉴런을 포함하는 뇌 조각에 전체 세포 패치 클램프를 수행하는 프로토콜을 제시합니다. 키스펩틴 뉴런 활동에 대한 지식을 추가함으로써 이 전기생리학적 도구는 지난 20년 동안 신경내분비학 분야에서 상당한 발전의 기초가 되었습니다.

시상하부 키스펩틴 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 기록의 표적입니다.

배우세요 뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 기법을 활용한 신경 세포 전기 활성 측정 방법입니다. 이 기술은 신경과학 연구에서 특정 뇌 영역의 뉴런 활동 변화를 분석하는 데 필수적입니다.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

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