뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

이 절차의 전반적인 목표는 새로 절부된 뇌 절편에서 전체 세포 패치 클램프 기록을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 실험적 대조군 조작이 특정 뇌 영역에서 특정 뉴런의 활동을 어떻게 변화시키는지와 같은 신경 과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 손상되지 않은 깨어 있는 동물에서 발달한 뉴런 기능의 X 생체 제제 오래 지속되는 변화를 식별할 수 있는 매체를 제공한다는 것입니다.

이 방법은 뇌 절편의 신경 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 배양 중인 세포 및 생체 내 뉴런과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 학생인 Francisco Garcia-Oscos입니다. 이 절차를 시작하려면 끝이 잘린 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 회수실에서 하나의 뇌 절편을 부드럽게 끌어올립니다.

전사 피펫을 기록 챔버에 놓고 피펫 조각을 챔버 바닥의 커버 슬립 라이닝에 부드럽게 짜냅니다. 그런 다음 microscope 4x objective를 사용하여 원하는 영역이 기록 챔버의 중앙에 정확히 배치되도록 슬라이스를 배치합니다. 원하는 위치에 도달한 후 하프라고도 하는 슬라이스 홀드다운으로 브레인 슬라이스 위치를 고정합니다.

그런 다음 40x 대물렌즈로 전환하고 챔버의 ACSF에 닿을 때까지 렌즈를 부드럽게 내립니다. 그런 다음 미세 조정 휠을 사용하여 조직에 초점을 맞춥니다. 초점이 조직 수준에 있을 때 대상 영역의 세포를 관찰합니다.

이제 대상 셀을 찾습니다. 기록 마이크로피펫을 안내하는 데 도움이 되도록 컴퓨터 화면에 표시하십시오. 기록 마이크로피펫을 배치할 수 있는 충분한 공간을 확보하기 위해 대물 렌즈를 올립니다.

이 단계에서는 1ml 주사기, 비금속 마이크로 주사기 바늘 및 전용 필터를 사용하여 미리 준비된 내부 용액을 마이크로 피펫에 채웁니다. 마이크로피펫에 기포가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 마이크로피펫을 전극 홀더에 넣어 용액이 염화은으로 코팅된 와이어 전극과 접촉하도록 합니다.

피펫 캡을 조여 콘 와셔가 마이크로피펫 주위에 밀봉을 형성하도록 합니다. 다음으로, 마이크로피펫을 ACSF에 담그기 전에 파이펫 홀더에 연결된 공기가 채워진 주사기로 양압을 가하여 이물질이 유입되는 것을 방지합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 챔버로 안내하여 침수된 대물렌즈의 중앙 아래에 대략

마이크로 매니퓰레이터로 마이크로피펫을 중고속으로 이동시키면서 컴퓨터 화면에서 마이크로피펫을 찾아 XY축의 셀 위치로 마이크로피펫을 안내합니다. 그 동안 전압 단계를 적용하여 마이크로피펫 저항을 측정합니다. 마이크로피펫을 막고 있는 기포나 기타 이물질을 제거하기 위해 양압을 가합니다.

마이크로피펫을 비운 후 전압 오프셋을 수행하여 피펫 전류를 0으로 줄입니다. 현미경의 미세 초점 휠을 사용하여 마이크로피펫을 서서히 내리면서 초점을 맞추기 시작합니다. 항상 먼저 초점을 맞춘 다음 마이크로피펫 팁이 슬라이스 안으로 갑자기 침투하지 않도록 마이크로피펫을 초점면으로 낮추십시오.

마이크로피펫이 슬라이스 표면과 접촉하면 마이크로 매니퓰레이터 속도를 중간 낮음 모드로 낮춥니다. 가벼운 양압을 부드럽게 가하여 경로의 파편을 제거합니다. 그런 다음 XYZ 컨트롤 노브를 번갈아 사용하거나 Z축 노브의 회전에 따라 두 XZ 축이 변경되는 대각선으로 접근하여 셀에 접근합니다.

마이크로피펫이 세포에 충분히 가까우면 세포 표면에 보조개가 나타납니다. 이제 밀봉을 만들기 위해 피펫 홀더 흡입 튜브에 연결된 튜브를 통해 약하고 짧게 흡입하십시오. 기가 씰이 형성되는 동안 컴퓨터 제어 증폭기 사령관을 사용하여 막이 파열된 후 갑작스러운 변화를 방지하기 위해 전위를 보유하고 있는 세포를 생리적 휴지 전위로 가져옵니다.

기가 씰이 형성된 후 빠르거나 느린 캡시톤을 보상합니다. 여기서 적용된 흡입이 너무 강하지 않은 것이 매우 중요합니다. 그렇지 않으면 밀봉을 설정하기 전에 멤브레인이 파열될 수 있습니다.

씰이 안정적으로 유지되고 1기옴 이상이면 원형질막을 파열시키기 위해 짧고 강한 흡입을 가합니다. 흡입은 밀봉을 설정할 때 가해지는 압력보다 짧고 강해야 합니다. 멤브레인을 적절하게 파열하고 안정적인 전체 세포 구성을 달성하기 위해.

멤브레인 테스트에서 셀 모드로 전환하면 입력 저항, 직렬 저항 및 멤브레인 용량과 같은 셀의 다양한 매개변수를 볼 수 있습니다. 전체 셀 구성을 달성한 후 기록하는 동안 이러한 매개변수를 계속 모니터링합니다. 여기에 표시된 것은 단일 핵 accumbens shell MSN에서 유발된 EPSCs 기울기의 예입니다.

온도를 섭씨 24도에서 28도로, 그리고 섭씨 32도로 높이면 유발된 EPSC의 기울기가 증가합니다. 여기서 유발된 EPSC 진폭은 전압 클램프 모드에서 마이너스 80밀리볼트에서 평가됩니다. 직렬 저항이 증가하면 유발된 EPSCS의 진폭이 감소합니다.

그리고 여기에는 스파이크를 생성하는 뉴런 능력에 대한 입력 저항의 영향을 보여주는 두 뉴런의 트레이스의 예가 있습니다. 뉴런은 전류가 고정되어 영하 80밀리볼트로 유지됩니다. 입력 저항이 증가하면 활동 전위의 수도 증가합니다.

이 절차를 시도하는 동안 건강한 뇌 조각을 생성하는 것이 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 직렬 저항, 입력 저항 및 온도와 같은 전기 신호 파형에 영향을 줄 수 있는 매개변수를 모니터링하는 것도 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 뇌 절편에서 전체 세포 기록 기술의 기본 측면을 잘 이해하게 될 것입니다.