그만큼 전의 VIVO 문화 및 패턴 인식 수용체 자극

이 절차의 전반적인 목표는 총 세포 수에 대한 정규화 기술에 중점을 두고 소장 오가노이드에 대한 병원성 챌린지의 영향을 측정하는 것입니다. 이 방법은 체외에서 박테리아와 장 상피 세포의 숙주 병원체 상호 작용을 조사하는 수단을 제공함으로써 선천성 및 점막 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차의 핵심은 총 세포 수에 대한 정규화 방법이며, 오가노이드 배양을 위한 ELISA.To 수확 마우스 소장 소굴과 같은 기술을 통해 오가노이드 분비 단백질을 측정할 때 필요한 것은 멸균 유리 슬라이드를 사용하여 소장의 내강 표면에서 융모를 부드럽게 긁어내는 것으로 시작합니다. 그런 다음 해부 가위를 사용하여 조직을 1-2cm 길이의 스트립으로 자릅니다. 그리고 스트립을 10밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 50리터 원뿔형 튜브에 넣습니다. 내용물을 부드럽게 뒤집어 섞고 조직 내용물이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 그런 다음 PBS를 흡인하고 10ml의 새 PBS로 스트립을 매번 같은 방식으로 세 번 더 세척합니다. 마지막 세척이 끝나면 튜브를 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 그런 다음 PBS를 25ml의 PBS와 2밀리몰 EDTA가 보충된 PBS로 교체하고 45분 동안 흔들 플랫폼의 얼음 양동이에 넣습니다. 배양이 끝나면 조직 스트립이 튜브 바닥에 가라앉도록 하고 PBS-EDTA를 10% FBS가 보충된 10ml의 PBS로 교체합니다. 튜브를 손으로 10회 세게 흔듭니다. 그런 다음 조직이 튜브 바닥에 가라앉도록 하고 상등액을 Fraction 1.Agitate라고 표시된 15ml 원추형 튜브로 PBS FBS의 조직을 5번 더 교반합니다. 매번 상등액을 새로운 분획 튜브로 옮깁니다. 마지막 교반 후, 모든 샘플을 원심분리하고 성장 인자를 추가하지 않고 예열된 DMEM/F12 5ml에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 이제 샘플을 다시 스핀다운하고 각 튜브에서 4ml의 상층액을 흡입합니다. 남은 배지의 마지막 밀리리터에 펠릿을 재현탁시키고 각 분획에서 20마이크로리터 분취액을 사용하여 유리 슬라이드의 소굴과 파편을 시각화합니다. crypt 대 debris 비율의 가장 큰 비율을 달성하기 위해 적절한 분획을 풀링한 후, 풀링된 분획을 원심분리하고 상층액의 마지막 50-100마이크로리터를 제외한 모든 것을 흡인합니다. 튜브를 얼음 위에 두고, 1ml의 단백질 매트릭스를 모은 분획에 추가하고, 기포가 추가되는 것을 방지하기 위해 천천히 위아래로 피펫팅합니다. 그런 다음 50마이크로리터의 단백질 매트릭스/crypt 현탁액을 37개의 각 웰 중간에 추가합니다.