그만큼
2016년 5월 18일
여기서, 수확 유지하고, 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 및 리스테리아 마우스 소장 organoids을 치료하는 프로토콜뿐만 아니라, 유전자 발현 및 단백질 적절한 정규화 기술에 중점으로 설명한다.
이 절차의 전반적인 목표는 총 세포 수에 대한 정규화 기술에 중점을 두어 병원성 챌린지가 소장 오가노이드에 미치는 영향을 측정하는 것입니다. 이 방법은 인비트로(in vitro)에서 박테리아와 장 상피 세포의 숙주-병원체 상호작용을 조사하는 수단을 제공함으로써 선천 및 점막 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 절차에서 필수적인 것은 총 세포 수에 대한 정규화 방법이며, 이는 ELISA와 같은 기술을 통해 오가노이드 분비 단백질을 측정할 때 반드시 필요합니다. 오가노이드 배양을 위해 마우스 소장 크립트(crypts)를 수확하려면, 먼저 멸균된 유리 슬라이드를 사용하여 소장의 내강 표면에서 융모를 부드럽게 긁어냅니다. 다음으로, 해부 가위를 사용하여 조직을 1-2cm 길이의 조각으로 자릅니다. 그리고 이 조각들을 10mL의 차가운 PBS가 들어 있는 50mL 원추형 튜브에 넣습니다. 내용을 부드럽게 반전시켜 혼합하고 조직 내용물이 튜브 바닥에 가라앉도록 둡니다. 그런 다음 PBS를 흡입하여 제거하고, 동일한 방식으로 10mL의 신선한 PBS에서 세 번 더 씻어냅니다. 마지막 세척 후 튜브를 얼음에 10분 동안 둡니다. 그 후 PBS를 2mM EDTA가 보충된 25mL PBS로 교체하고, 로킹 플랫폼 위의 아이스 버킷에서 45분 동안 둡니다. 배양이 끝나면 조직 조각들이 튜브 바닥에 가라앉도록 두고, PBS-EDTA를 10% FBS가 보충된 10mL PBS로 교체합니다. 튜브를 손으로 10회 강하게 흔듭니다. 그런 다음 조직이 튜브 바닥에 가라앉도록 두고 상청액을 'Fraction 1'이라고 표시된 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. PBS-FBS 내의 조직을 5회 더 흔들어 줍니다. 이때 매번 상청액을 새로운 분획 튜브로 옮깁니다. 마지막 교반 후 모든 샘플을 원심 분리하고 펠렛을 성장 인자가 첨가되지 않은 예열된 5mL DMEM/F12에 재현탁합니다. 이제 샘플을 다시 원심 분리하고 각 튜브에서 4mL의 상청액을 흡입하여 제거합니다. 펠렛을 남은 1mL의 배지에 재현탁하고, 각 분획에서 20µL씩 분취하여 유리 슬라이드에서 크립트와 잔해를 시각화합니다. 크립트 대 잔해 비율이 가장 높은 비율을 얻기 위해 적절한 분획들을 합친 후, 합쳐진 분획들을 원심 분리하고 상청액의 마지막 50-100µL를 제외한 모두를 흡입하여 제거합니다. 튜브를 얼음에 둔 상태에서, 기포가 생기지 않도록 천천히 피펫팅하며 합쳐진 분획에 1mL의 단백질 매트릭스를 추가합니다. 그런 다음, 37mm 웰의 중앙에 단백질 매트릭스/크립트 현탁액 50µL를 추가합니다.
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개요
본 논문은 마우스 소장 오가노이드를 수확하고 유지하며, 병원체 관련 분자 패턴(PAMPs) 및 Listeria monocytogenes로 처리하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 단백질 분석을 위한 유전자 발현 및 적절한 정규화 기술을 강조합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 미생물학
- 세포생물학
배경
- 마우스 소장 오가노이드는 장 생물학 연구에 매우 유용합니다.
- 병원체 관련 분자 패턴(PAMPs)은 면역 반응에서 중요한 역할을 합니다.
- 유전자 발현을 이해하는 것은 실험 결과를 해석하는 데 필수적입니다.
- 정규화 기술은 정확한 단백질 분석을 위해 반드시 필요합니다.
연구 목적
- 마우스 소장 오가노이드 작업에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
- PAMPs와 Listeria monocytogenes가 이러한 오가노이드에 미치는 영향을 탐구합니다.
- 유전자 발현 분석 및 정규화의 중요성을 강조합니다.
사용된 방법
- 마우스 소장 오가노이드 수확하기.
- 특정 조건 하에서 오가노이드 배양 유지하기.
- PAMPs 및 Listeria monocytogenes를 이용한 오가노이드 처리하기.
- 유전자 발현 분석 및 단백질 정규화 기술 분석하기.
주요 결과
- 오가노이드의 성공적인 유지 및 처리 과정이 이루어졌다.
- 처리에 따른 유전자 발현 변화가 관찰되었다.
- 정규화 기술을 통해 단백질 분석의 정확도를 향상시켰다.
- 본 프로토콜은 장 생물학 관련 다양한 연구에 적용 가능하다.
결론
- 설명된 프로토콜은 장 오가노이드를 연구하는 데 효과적입니다.
- PAMPs와 Listeria monocytogenes는 유전자 발현에 상당한 영향을 미칩니다.
- 신뢰할 수 있는 결과를 위해서는 적절한 정규화 기술이 매우 중요합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
Ex vivo 마우스 장 오가노이드는 점막 조직 내의 호스트-병원체 상호작용 및 선천 면역 신호 전달을 조사하기 위한 생리학적으로 유의미한 시스템을 제공합니다. 본 프로토콜에서 총 세포 수 대비 정규화에 중점을 둔 것은 불균일한 오가노이드 배양으로부터 재현 가능하고 정량적인 데이터를 생성하는 데 있어 매우 중요한 과제를 해결한 것입니다. 이러한 역량은 면역학 및 마이크로바이옴 중심의 치료 프로그램에서 초기 발견 및 표적 검증에 대한 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 일차 상피 세포 환경에서 패턴 인식 수용체 경로의 기전적 조사가 가능합니다.
- ex vivo에서 복잡한 숙주-병원체 상호작용을 모델링함으로써 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
- 선천 면역 조절제에 대한 기능적 타겟 검증을 용이하게 합니다.
- 면역학적 자산의 진전을 위한 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 면역 조절 화합물의 하위 스크리닝을 위한 검증된 오가노이드 시스템을 구축합니다.
- 엄격한 정규화 기술을 통해 분석의 표준화 및 재현성 문제를 해결합니다.
- 분비 단백질의 정량적 측정을 가능하게 하여 신뢰할 수 있는 화합물 평가를 지원합니다.
- 발견 프로그램 전반에서 플랫폼의 확장성과 재사용성을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 바이오마커 탐색을 위해 질병 관련 점막 생물학적 특성과 일치합니다.
- 면역 및 장벽 기능 연구에서 발견부터 전임상 검증까지의 연속성을 제공합니다.
- 생리학적으로 유의미한 상피 세포 반응을 모델링하여 진전 결정에 따른 리스크를 줄여줍니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 프로토콜은 초기 가설 검증부터 리드 화합물 도출 및 전임상 검증에 이르기까지, 점막 면역학 및 호스트-미생물 상호작용 프로그램의 발견 연속체에 통합되어 적용됩니다.
- 발견 생물학: 선천성 면역 신호 전달 및 숙주-병원체 메커니즘의 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 오가노이드 분석에서 분비 단백질 분석을 위한 재현 가능하고 정량적인 판독값을 제공합니다.
- 분석: 총 세포 수에 대한 정규화를 가능하게 하여 실험 조건 간의 비교 가능성을 향상시킵니다.
- 중개 연구: 바이오마커 정렬을 위해 인비트로(in vitro) 결과와 인비보(in vivo) 점막 생물학을 연결합니다.
- 기업적 재사용: 면역학 및 마이크로바이옴 R&D 포트폴리오를 위한 재사용 가능한 오가노이드 기반 워크플로우를 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 타겟 검증 시 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 복잡한 오가노이드 시스템 내의 정규화 및 정량화를 표준화합니다.
- 전략적 가치: 정보에 기반한 추진/중단(go/no-go) 결정과 자본 효율적인 포트폴리오 진전을 가능하게 합니다.
- 포트폴리오 영향: 면역학 및 마이크로바이옴 자산의 위험 조정 우선순위 설정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 오가노이드 배양 및 상피 생물학에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 특수 조직 배양 및 단백질 정량 분석 장비의 사용 권한이 필요합니다.
- 정규화 및 분석 프로토콜의 팀 간 표준화가 필요합니다.
- 다양한 오가노이드 유형 또는 질환 모델에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.
- 오가노이드 성장 및 매트릭스 조성의 불균질성이 분석 재현성에 영향을 미칠 수 있습니다.
