Name: 그만큼 전의 VIVO 문화 및 패턴 인식 수용체 자극 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 학습하세요 마우스 소장 오가노이드 배양 및 PAMPs와 Listeria monocytogenes 처리 방법을 통해 장 면역 반응과 유전자 발현 변화를 연구하는 기법을. 정확한 단백질 정량화를 위한 정규화 기법의 중요성도 함께 확인하세요.

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저자는 기술적인 토론에 대해 Sheryl Coutermarsh-Ott 박사, Dylan McDaniel 및 Bettina Heid에게 감사를 표합니다. 저자는 Caco-2 세포를 제공한 Nanda Nanthakumar 박사에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 버지니아 공대의 다문화 학업 기회 프로그램(MAOP)에 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 국립당뇨병·소화기·신장 질환 연구소(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award)의 지원을 받아 K01DK092355(I.C.A.에)를 수여했습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

장 organoids의 문화 및 유지 보수 적절한 조직 배양 기술로 개별 마스터 할 수있는 절차입니다. 이보다 기존의 단일 층의 세포 성장에 비해 계대에 미묘한가 있지만, 이러한 미묘한 차이는 극복하기 어려운되지 않습니다. 이 방법의 중요한 단계는 최적의 파종을 위해 충분히 높은 밀도로 organoids 성장을 할 수있는 포함한다. 통상적으로 세포주를 달성 할 수있다 큰 파종 밀도가 실질적으로없는 실험 organoids으로 축소되어야한다. 여러 처치 군이 존재하는 경우에 특히 분명해진다. 이 프로토콜은 다양한 박테리아의 다양한 장내 상피 호스트 병원체 상호 작용을 연구하는 단계별 방식을 제공하기위한 것이다 정규화에 대해이 시스템을 사용하여 바이러스, 진균 병원체뿐만 아니라 어드레스 어려움. 보고서는 describ 사용할 수 있습니다전자 세균성 병원체 살모넬라 균과 장 organoids의 상호 작용, 아직 분비되는 사이토 카인...

능력은 수확과 문화 차 organoids 조직 생물학 1-5에 대한보다 생리 학적으로 대표 현상을 이해하는 데 밀접한 흥미로운 발전 소장, 대장, 췌장, 간, 뇌에 대해 설명하고 있습니다되었습니다. 소장 organoids의 문화 및 유지 보수를 설명하는 첫 번째 방법은 사토 등의 알에 의해보고되었다. 한스 Clevers 1의 실험실에서. 이 방법, 수확 및 입증 차 장 상피 세포의 배양에 앞서 제한 상피 세포 성장 유지에 효과가있다. 방법은 궁극적으로 혼합 차 섬유 아세포 (6)의 부산물로 이어질 것 같은 콜라게나 제와 디스 파제 등의 효소와 함께 배양을 통해 조직의 분리를 포함했다. 이러한 조건은 또한 시간은 상피 세포 배양을 지속 제한 될 것이다. 상피 세포로 인해 세포 사멸을 입력으로 더 상피 세포 틈새에 최소가 형성 것적절한 성장 인자 또는 접촉 무결성 손실의 부족 anokis 7 불린다. 입체 · organoid 배양 시스템의 출현은 지속적인 배양 한 장내 세포 유형의 스펙트럼을 포함하는 일차 배양 장 세포에 대한 방법을 제공했다. 이러한 상피 organoids들은 여러 분화 세포로 구성되어 있음되는 세포주에 비해 많은 장점을 가지고, 그들이보다 생체 8로부터 유도 된 기관을 모방. 과정은 결국 다른 자극 하에서 장내 상피 세포의 반응을 평가하기위한 가치있는 도구임이 입증되었다 &quot;접시 미니 창자 성장&quot;한다. 이러한 고분자 패턴은 호스트와 미생물 9 모두에서 다양한 반응을 조절할 수있는 미생물 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가)와 기본 장 세포의 상호 작용을 조사하는 면역학 분야에 적합하다. 뿐만 아니라 연구자들은 이제 마우스 organoids 이러한 상호 작용을 탐구하지만, 수물론이 같은 사람에서 배양 할 수있다. 이 기술은 극적 맞춤 의약품을 변경할 가능성을 가지고 있으며,이 기술은 가까운 미래에 가능하게하는 것으로 추측 발전 유혹된다. 이 방법의 전체 목표는 다양한 자극과 함께 배양 확장을위한 프로토콜 및 장내 organoids의 치료를 제공하는 것이다. 이러한 자극은 백신, 세균 PAMPs가, 살아있는 병원균, 위장관 (GI) 및 암 치료제에서 궁극적으로 범위 수 있습니다. 마우스 장 organoids의 분리 및 배양 사토 등의 알에서 적응하고있다.이 프로토콜을 다음과 같은 경우, 최종 제품은 문화 organoid되는 것은 여전히 달성 원래의 방법에서 약간의 편차가 있지만. 이 방법은 세포, N에 기초하여 분석을 수행 할 때 고려되어야 비 균일 한 셀 구조, 작업시 적절한 정규화를위한 적절한 기술을 설명하기에 집중엄버.

<table><tbody><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td> <td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050</td> <td>(섹션 1,3,6) 또는 동등한 브랜드</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR 원심 분리기</td><td>열</td><td></td> <td>(섹션 1,3)</td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare</td><td>Sh30243.01</td> <td>(섹션 1,6) Caco-2 및 HEK293 Rspondin1 세포</td></tr><tr><td>HEK293T-Rspondin1 분비 세포주</td><td></td><td></td><td>(섹션 1) Kim, K.A. et al.에서 설명 및 수정됨. GeneCopoeia에서 맞춤 주문 및 구매한 pReceiver-Lv105 백본에 복제된 RSPO1(NM_138683) ORF cDNA를 포함하는 렌티바이러스 입자.&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>(Section 1) 또는 동등한 브랜드</td></tr><tr><td>T-175 Flask</td><td>Corning</td><td>431079</td><td>(Section 1) 또는 동등한 브랜드&nbsp;</td></tr><tr><td>단백질 매트릭스</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>(섹션 2,3,4,5,6) Matrigel 성장 인자 감소&nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's (DPBS)</td><td>GE 헬스케어</td><td>SH30264.01</td><td>(섹션 2,3)</td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>(섹션 2,3) 고급 DMEM/F12</td></tr><tr><td>Corning 24 웰 TC 플레이트</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>(섹션 2)</td></tr><tr><td>N2 보충제 100x&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>(섹션 2)</td></tr><tr><td>B27 비타민 A 없음 50x&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지스</td><td>12587-010&nbsp;</td><td>(제2항)</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>(Section 2)</td></tr><tr><td>Glutamine Supplement (Glutamax)</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>(Section 2)은 Advanced DMEM/ F12</td></tr><tr><td>hepes (1 M)</td>와 결합할 수 있습니다. <td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>(Section 2)은 Advanced DMEM/ F12와 결합할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>10ml 혈청 학적 Pipet</td><td>Falcon</td><td>357551</td> <td>(섹션 2) 또는 동급의 브랜드</td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td> <td>(섹션 2) 재고 = 100 mg / ml</td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td> <td>(섹션 2) 재고 = 1M</td></tr><tr><td>재조합 마우스 EGF</td><td>Biolegend</td><td>585608</td> <td>(섹션 2) 재고 = 500 mg / ml</td></tr><tr><td>Rocker Variable</td><td>Bioexpres</td><td></td><td>(섹션 3)</td></tr><tr><td>해부 가위</td><td></td><td></td><td>(섹션 3)</td></tr><tr><td>펜치</td><td></td><td></td><td>(섹션 3)</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td></td><td></td><td>(섹션 3)</td></tr><tr><td>해부 핀셋</td><td></td><td></td><td>(섹션 3)</td></tr><tr><td>25 ml 혈청학 피펫</td><td>팔콘</td><td></td><td>(섹션 3)</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>시그마 Aldrich</td><td>SLBB9821</td><td>(Section 3) 0.5M 또는 대안적인 TC 등급 EDTA</td></tr><tr><td>메마른 페트리 접시 100mm x 15mm</td><td>피셔</td><td>FB0875712</td>(<td>Section 3) 또는 동등한 크기의 TC 접시</td></tr><tr><td>1ml 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>(Section 4)</td></tr> <tr><td>정밀 글라이드 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>305120</td><td>(Section 4) Bacillus subtilis에서 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm)</td></tr> <tr><td>편모</td><td>인비보젠</td><td>tlrl-bsfla&nbsp;</td><td>(섹션 5,6)</td></tr><tr><td>리스테리아 모노사이토제네스</td><td>ATCC</td><td>19115</td><td>(섹션 5,6)&nbsp;( 머레이&nbsp; et&nbsp;al.)&nbsp;</td></tr><tr><td>혈액 분석기</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA(</td><td>Section 5,6) 또는 동등한 브랜드</td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>211065(Section 5)</td></tr><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion</td><td>Becton Dickinson</td><td>237500</td><td>(Section 5)</td></tr><tr><td>Caco-2</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td><td>(Section 6)</td></tr><tr><td>Trypsin&nbsp;</td><td>gibco</td><td>25200056</td><td>(섹션 6)</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔</td><td>A412-4</td><td>(섹션 6)</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>몰레쁠 장치</td><td></td><td>(섹션 6)</td></tr><tr><td>96 웰 분석 플레이트</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>(섹션 6) 블랙 플레이트, 투명 바닥 TC 처리</td></tr><tr><td>핵 염색 염료</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>(섹션 6) Hoechst 33342</td></tr><tr><td>T-75 플라스크</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>(Section 6) 또는 동등한 브랜드</td></tr><tr><td>15 ml 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>(Section1,3) 또는 동등한 브랜드</td></tr><tr><td>1.7 ml 폴리프로필렌 튜브</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td>또는 동등한 브랜드</td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td>또는 동등한 브랜드</td></tr><tr><td>TNF-alpha&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00443260_g1</td><td>Taqman 유전자 발현 분석 키트</td></tr><tr><td>IL-6&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>(Mm 00446190_m1</td><td>Taqman 유전자 발현 분석 키트</td></tr><tr><td>IL-1beta</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00434228_m1</td><td>Taqman 유전자 발현 분석 키트</td></tr><tr><td>IL-18</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00434225_m1</td><td>Taqman 유전자 발현 분석 키트</td></tr><tr><td>18s</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs</td><td>99999901_s1 Taqman 유전자 발현 분석 키트</td></tr><tr><td>7500 Fast Real Time PCR 시스템</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nexus gradient Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA 역전사 키트</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td></td><td></td>4346907</tr><tr><td>재조합 마우스 R-Spondin 1 단백질</td><td>R& D 시스템</td><td>3474-RS-050</td><td>500ng/ml</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>C7559</td><td></td></tr></tbody></table>

그만큼<em&gt; 전의 vivo</em마우스 소장 organoids의&gt; 문화 및 패턴 인식 수용체 자극

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

기본 장 organoids 크게 점막 면역학 분야에 영향을 미칠 수있는 유용한 모델 시스템이다. 그러나, organoid 성장 특성의 복잡성은 연구자에 대한 상당한주의를 실시하고 있습니다. 특히, 각각의 organoid의 성장 패턴은 매우 다양하며, 문화 상피 세포의 이종 인구를 만듭니다. 이러한주의 사항과 함께, 일반 조직 배양 방법은 단순히 의한 세포 구조의 복잡성으로 organoid 시스템에 적용 할 수 없다. 일부 정규화 기술을 적용하지 않는 계산 및 세포주 개별적으로 분리 된 셀에 대해 공통 셀 번호만을 기준 도금 organoids위한 신뢰할 수있는 방법이 아니다. 총 단백질 함량 정규화 때문에 거주자 단백질 매트릭스 복합체 이루어진다. 분비 된 콘을 평가할 때 세포 수, 형상 및 세포 형태 측면에서 이러한 특성은 고려되어야organoid 질량에서 텐트. 이 프로토콜은 문화 간단한 절차를 간략하게 설명하고 미생물 병원체 및 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가)에 소장 organoids을 치료하기 위해 생성되었습니다. 또한 단백질 분석은 이러한 공격 후 수행 할 때 적용해야 정규화 기술을 강조한다.

장 organoids을 육성하기 위해이 프로토콜을 다음과 같은 경우, 특성 구 모양의 organoids는 수확 후 존재합니다. R-spondin1 에어컨 미디어의 추가는 매일 organoids의 성장과 신진를 시작합니다. organoids의 성장은도 1a에 도시되어있다 - F, 및 일 1, 2, 4, 5, 6 일에 장내 organoids 대표 인 14도 1F는 14 일째 organoids의 비 균일 한 성장 특성을 나타낸다. organoids는 적절한 수의 성장되면, 그들은 플레이 팅과 다양한 PAMPs가 및 / 또는 미생물에 도전 할 수있다. 발현 분석은 표준 기술을 통해 수행 될 수있다. 이는 다음 분석 하였다 염증성 사이토 카인 IL-...

여기서, 수확 유지하고, 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 및 리스테리아 마우스 소장 organoids을 치료하는 프로토콜뿐만 아니라, 유전자 발현 및 단백질 적절한 정규화 기술에 중점으로 설명한다.

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em마우스 소장 Organoids의&gt; 문화 및 패턴 인식 수용체 자극

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

이 절차의 전반적인 목표는 총 세포 수에 대한 정규화 기술에 중점을 두어 병원성 챌린지가 소장 오가노이드에 미치는 영향을 측정하는 것입니다. 이 방법은 인비트로(in vitro)에서 박테리아와 장 상피 세포의 숙주-병원체 상호작용을 조사하는 수단을 제공함으로써 선천 및 점막 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 절차에서 필수적인 것은 총 세포 수에 대한 정규화 방법이며, 이는 ELISA와 같은 기술을 통해 오가노이드 분비 단백질을 측정할 때 반드시 필요합니다. 오가노이드 배양을 위해 마우스 소장 크립트(crypts)를 수확하려면, 먼저 멸균된 유리 슬라이드를 사용하여 소장의 내강 표면에서 융모를 부드럽게 긁어냅니다. 다음으로, 해부 가위를 사용하여 조직을 1-2cm 길이의 조각으로 자릅니다. 그리고 이 조각들을 10mL의 차가운 PBS가 들어 있는 50mL 원추형 튜브에 넣습니다. 내용을 부드럽게 반전시켜 혼합하고 조직 내용물이 튜브 바닥에 가라앉도록 둡니다. 그런 다음 PBS를 흡입하여 제거하고, 동일한 방식으로 10mL의 신선한 PBS에서 세 번 더 씻어냅니다. 마지막 세척 후 튜브를 얼음에 10분 동안 둡니다. 그 후 PBS를 2mM EDTA가 보충된 25mL PBS로 교체하고, 로킹 플랫폼 위의 아이스 버킷에서 45분 동안 둡니다. 배양이 끝나면 조직 조각들이 튜브 바닥에 가라앉도록 두고, PBS-EDTA를 10% FBS가 보충된 10mL PBS로 교체합니다. 튜브를 손으로 10회 강하게 흔듭니다. 그런 다음 조직이 튜브 바닥에 가라앉도록 두고 상청액을 'Fraction 1'이라고 표시된 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. PBS-FBS 내의 조직을 5회 더 흔들어 줍니다. 이때 매번 상청액을 새로운 분획 튜브로 옮깁니다. 마지막 교반 후 모든 샘플을 원심 분리하고 펠렛을 성장 인자가 첨가되지 않은 예열된 5mL DMEM/F12에 재현탁합니다. 이제 샘플을 다시 원심 분리하고 각 튜브에서 4mL의 상청액을 흡입하여 제거합니다. 펠렛을 남은 1mL의 배지에 재현탁하고, 각 분획에서 20µL씩 분취하여 유리 슬라이드에서 크립트와 잔해를 시각화합니다. 크립트 대 잔해 비율이 가장 높은 비율을 얻기 위해 적절한 분획들을 합친 후, 합쳐진 분획들을 원심 분리하고 상청액의 마지막 50-100µL를 제외한 모두를 흡입하여 제거합니다. 튜브를 얼음에 둔 상태에서, 기포가 생기지 않도록 천천히

the-ex-vivo-culture-pattern-recognition-receptor-stimulation-mouse

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

기본 생쥐 대장 종양 organoid을 설정하는 간단한 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 대장 종양 세포가 생존하고 상피 정상적인 결장하지 않는 반면, 제한된 성장 인자를 포함하는 미디어 organoids로 성장하는 기능을 사용합니다.

기본 마우스 대장 종양의 체외 Organoid의 문화

향상된 이미징 기술은 발달 중에 장기의 3차원 이미징을 가능하게 합니다. 여기에서는 태아 쥐의 장에서 발달 중인 융모의 실시간 이미징을 허용하는 전체 장기 배양 시스템에 대해 설명합니다.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템 전의 VIVO 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

소장 토굴 organoids 줄기 세포와 그 틈새에 의존 소낭의 성장을 되풀이 조직 배양 시스템을 제공하는 생체 외 배양. 우리는 기본 마우스 토굴 organoids에 실시간으로 대사 프로파일을 분석하는 방법을 설립했다. 우리는 organoids 자신의 소스에 의해 정의 된 생리 학적 특성을 유지했습니다.

대사 프로파일의 실시간 분석 전의 VIVO 마우스 장내 크립트 Organoid 문화

이 비디오 프로토콜에서는 1차 장 상피의 오가노이드에서 렌티바이러스 형질전환과 정량적 RT-PCR, RNA-마이크로어레이 및 면역조직화학에 의한 이러한 배양의 처리 및 다운스트림 분석에 대해 단계별로 설명합니다.

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

생체 외 장기 배양은 온전한 조직 구조의 맥락에서 생물학적 과정을 조사할 수 있게 해줍니다. 여기에서는 장내 선천면역 및 항균 숙주 방어를 연구하는 데 사용할 수 있는 마우스 결장의 체외 배양 방법을 소개합니다.

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em항균 호스트 방어 연구에&gt; 콜론 오르간 문화와 그것의 사용

이 문서는 전 생체 내 실험을 위한 새로운 창자 기관 배양 시스템을 사용하여 호스트-미생물군유전체 상호 작용을 분석하기 위한 독특한 방법을 제시합니다.

호스트-미생물군유병 상호 분석을 위한 장 내 장관 장기 배양 시스템

이 프로토콜은 뮤린 소장 오가노이드를 확립하고, 뮤린 소장 라미나 프로프리아로부터 유형 1 선천성 림프성 세포를 분리하고, 장 상피 세포와 유형 1 선천성 림프 세포 간의 양방향 상호 작용을 연구하기 위해 두 세포 유형 간의 3 차원 (3D) 공동 배양을 수립하기위한 자세한 지침을 제공합니다.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

본 프로토콜은 claudin-7 녹아웃 모델에서 결장 줄기 세포의 활성 및 기능을 연구하기 위해 쥐 결장 오가노이드 시스템을 확립하는 것을 설명합니다.

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

우리는 쥐의 소장 선와와 배양 장 3D 오가노이드를 선와에서 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 상피하 세포 틈새가 없는 단일 장 줄기 세포에서 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다.

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

학습하세요 마우스 소장 오가노이드 배양 및 PAMPs와 Listeria monocytogenes 처리 방법을 통해 장 면역 반응과 유전자 발현 변화를 연구하는 기법을. 정확한 단백질 정량화를 위한 정규화 기법의 중요성도 함께 확인하세요.

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