격리 및 프로파일 링 마이크로 RNA-포함하는 인간의 담즙에서 엑소 좀을

이 방법의 전반적인 목표는 microRNA 프로파일링을 포함한 추가 분석을 위해 인간 담즙에서 엑소좀을 분리하는 것입니다. 이 방법은 담관암 또는 기타 담도 질환에 대한 특정 담즙 마커의 검출과 같이 간질환 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 견고하고 재현성이 높다는 점입니다.

내시경적 역행성 담췌관 조영술(ERCP)을 수행하려면, 먼저 환자를 누운 자세(supine position)로 배치합니다. 십이지장경을 환자의 입을 통해 삽입하여 십이지장의 제2부에 진입시킨 후 대유두를 확인합니다. 0.35-inch 또는 0.9-millimeter 친수성 가이드와이어가 미리 장착된 삼중 강 유두괄약근 절개 catheter(triple lumen sphincterotome)를 삽입하여 총담관을 선택적으로 삽관합니다.

투시 유도하에 가이드와이어를 좌간관까지 전진시킨 다음, 안정적인 위치를 확보하기 위해 괄약근 절개톰을 담관 안으로 5 cm 전진시킵니다. 가이드와이어를 제거한 후, 하단 잠금 장치를 통해 가이드와이어 포트에 10 mL 주사기를 연결하고 10 mL의 음압을 사용하여 담즙을 흡인합니다. 담즙이 담긴 주사기를 제거하고 가이드와이어를 다시 삽입한 후, 주입 포트를 통해 조영제를 주입하여 담관계를 조영합니다.

그런 다음, 수집한 담즙을 얼음 위에 놓인 15-milliliter 튜브로 옮깁니다. 나중에 사용할 예정이라면, 샘플을 500 times g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리한 후 -80 °C에서 냉동 보관하십시오. 즉시 엑소좀 분리를 진행하려면, 담즙 400 µL를 마이크로원심분리 튜브에 옮기고 300 times g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리하여 세포와 세포 부스러기를 수집합니다. 상층액을 더욱 정제하기 위해, 용액을 새 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 샘플을 16,500 times g, 4 °C에서 20분 동안 원심분리하십시오.

그 후 생물안전작업대에서 상층액을 주입기로 수집하고, 0.2-micrometer 폴리에테르설폰 막 필터로 여과하여 200 nanometers보다 큰 잔류 입자를 제거합니다. 여과된 상층액을 초원심분리관으로 옮기고, 원심분리 중 튜브가 찌그러지는 것을 방지하기 위해 PBS를 사용하여 튜브의 최소 3분의 2 이상을 채웁니다. 120,000 times g, 4 °C에서 70분 동안 초원심분리를 수행하여 엑소좀을 펠릿화합니다.

작고 노란색인 펠릿에 엑소좀이 포함되어 있을 것입니다. 상층액을 조심스럽게 따라내어 버리고, 최종 농도가 10% v/v가 되도록 표백제를 첨가하여 폐기물을 소독하십시오. 그 후 20분 동안 그대로 둡니다.

후속 실험을 위해, 펠렛을 소량의 적절한 용액으로 처리하거나 50 ~ 100 µL의 PBS에 재현탁하여 향후 사용을 위해 -80 °C에서 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 대비 염색된 세포외 소포체(extracellular vesicles, EVs)의 그리드를 준비한 후, 입자 크기를 결정할 때 20,000배 배율에서 시작하여 100,000배까지 높여가며 80 kV의 가속 전압을 사용하는 전자 현미경으로 이미지를 획득하십시오. 엑소좀은 일반적인 현미경이나 유세포 분석기로는 검출하기에 너무 작습니다. 하지만 이 그림은 엑소좀의 전형적인 나노입자 추적 분석(nanoparticle tracking analysis, NTA) 결과를 보여주며, 분리된 이 인간 담즙 샘플의 농도와 크기 분포를 측정한 결과 평균 크기는 97 nm였습니다.

전자 현미경을 사용하여 인간 담즙에서 분리된 입자의 크기를 확인할 수 있으며, 본 도표는 전형적인 투과 전자 현미경(transmission EM) 결과를 보여줍니다. 이 웨스턴 블롯은 tetraspanin CD63 및 Tsg101과 같이 엑소좀에 풍부한 단백질을 탐색했습니다. 이 실시간 증폭 플롯은 인간 담즙의 엑소좀에서 추출한 다양한 microRNA 종을 보여줍니다.

엑소좀은 18S 또는 28S 리보솜 RNA나 하우스키핑 유전자와 같은 신뢰할 수 있는 표준 물질이 부족하기 때문에, 정규화를 위해 합성 microRNA를 스파이킹하는 것이 중요합니다. 엑소좀 분리 기술은 적절하게 수행될 경우 3시간 이내에 완료될 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 환자나 동물로부터 담즙을 얻고 처리하여 세포외 소포를 분리하고 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 재현할 때, 초원심분리가 불가능한 경우에는 샘플을 -80°C에서 냉동하기 전에 500 G, 4°C에서 원심분리해야 함을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 microRNA 프로파일과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 microRNA 연구와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 담즙은 간염 바이러스를 포함하고 있을 수 있어 취급 시 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑과 보안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

이 기술의 개발 이후, 담관암 연구 분야에서는 PSA 폐쇄와 같은 담도 질환 환자의 담즙 내 엑소좀을 잠재적 바이오마커로 탐색하는 연구의 길이 열렸습니다.