Name: 유방암 전이성 행동에 장기 별 영향 유학을위한 장기 에어컨 미디어 및 응용 프로그램의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 학습하세요 생쥐 림프절, 뼈, 폐, 뇌에서 장기 조건배양액을 생성하여 암세포 전이 행동에 미치는 장기 특이적 용해성 인자를 연구하는 방법을. 이 기술은 암 연구에 중요한 ex vivo 플랫폼을 제공합니다.

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이 작업은 캐나다 유방암 재단-온타리오 지역, 캐나다 혁신 재단(No. 13199)의 보조금, 그리고 런던 건강 과학 재단(ALA)을 통한 John Bristol과 Donna Bristol의 기부자 지원으로 지원되었습니다. 학생 및 펠로우십 지원은 온타리오 대학원 장학금 프로그램(온타리오 주, G.M.P. 및 J.E.C.), 캐나다 대학원 장학금-석사 프로그램(M.M.P.), 캐나다 보건 연구소(CIHR)-전략 교육 프로그램(M.M.P., G.M.P 및 J.E.C.) 및 런던 지역 암 프로그램의 Pamela Greenaway-Kohlmeier 번역 유방암 연구 부서(M.M.P., G.M.P., J.E.C. 및 Y.X.). A.L.A.는 온타리오 연구 혁신부(Ministry of Research and Innovation)로부터 CIHR New Investigator Award와 Early Researcher Award의 지원을 받습니다.

모든 동물 실험은 웨스턴 대학의 동물을 사용 분과위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라, 동물 관리에 캐나다위원회의 권고에 따라 실시 하였다. 1. 장기 격리 (폐, 뇌, 뼈, 림프절) <ol><li> 네 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브를 준비 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 약 30 ㎖를 함유하는 (각 오르간을 격리 함). 전자 저울을 사용하여 PBS의 각 튜브를 미리 무게. </li><li> CO 2 흡입 6~12주 된 마우스를 안락사. 2 분 또는 마우스를 이동하고 호흡이 멈출 때까지 - 마우스는 약 1의 CO 2 챔버에 남아있을 것이다. 손가락으로 직접 확인 성공하면 안락사 더 박동의 부족에 의해 확인 될 수있다. 이 방법은 겨드랑이 림프절을 제거하는 어려움을 선도 목의 혈관을 파열 수 있으므로 자궁 전위를 피하십시오. 참고 : 이전 작업은 구체적으로 사용하고있다건강한 여성 누드 마우스, HSD : 무 흉선 Nude- Foxn1 뉴 13. </li><li> 무균 조직 배양 후드에서, 폴리스티렌 폼 패드의 뒷면에 마우스를 올려 사지를 확산 장소에 보관하는 핀을 사용합니다. </li><li> 멸균 집게와 가위를 사용하여, 성기의 중간 선에서 복부 피부를 잘라 입으로 위쪽으로 잘라. 조심스럽게 복부 근육의 복부 피부를 뒤로 당겨 폴리스티렌 폼 패드의 위치에 핀. </li><li> 겨드랑, 상완 및 서혜부 림프절을 찾습니다. 참고 : 림프 노드는 일반적으로 지방 조직에 의해 둘러싸여있다. 사타구니 림프절들은 철수 복부 피부에 두 개의 혈관의 교차점에 표면적으로 발견으로 찾을 수있는 가장 쉬운입니다. 겨드랑이와 상완 림프 노드는 조직 내에서 깊이있는 조직의 부드러운 기동을 필요로한다. <ol><li> 당신이 림프절을 찾은 후, 부드럽게 조심스럽게 림프를 더 잘라 가위를 사용하지데스 멀리 피부, 지방, 혈관에서 마우스에서 제거. 적절한 절개를 확인 제거 된 조직을 통해 집게를 출시합니다. 조직 위에 나이프 압연시 하드 덩어리가 존재하는 경우, 림프절 가능성이 성공적으로 제거되었다. </li><li> 얼음 차가운 PBS에서 제거 된 림프절을 놓습니다. </li></ol></li><li> 집게와 가위를 사용하여 가슴으로 상향 움직임에 노출 된 복부 벽을 절단하여 복강을 엽니 다. 조심스럽게 흉강을 노출, 흉골을 통해 절단. </li><li> 폐 아래의 다이아 프램을 찾아 조리개를 잘라. 이 때문에 장력에 갈비뼈쪽으로 당겨해야합니다. </li><li> 아래에서 폐를 들어 올리고 기관으로 기본 조직을 잘라. 이는 폐는 흉강로부터 자유롭게 제거 될 수있다. 얼음 차가운 PBS에서 블록과 장소 실내 심장과 폐를 제거합니다. 심장은 폐 여기하거나 2 단계에서 계량하기 전에 제거 될 수있다. </li><li> 제거핀 폴리스티렌 폼 패드의 위치에 마우스를 유지. 위에 마우스를 켜고 측면이 측면에하는 맞은 편에 뒷면 하단 끝까지의 피부를 잘라. </li><li> 거즈의 멸균 조각을 사용하여, 마우스의 몸통을 잡고 마우스의 다리와 발 위에 마우스의 뒤쪽 피부를 벗겨합니다. </li><li> 멸균 거즈 같은 조각을 사용하여 조심스럽게 자리에 낮은 다리를 잡고 마우스 다리의 발목 관절 휴식과 무릎 관절을 향해 근위 관절을 통해 피부를 벗겨. </li><li> 가위를 사용하여, 얼음 차가운 PBS에서 무릎 관절과 장소에서 무료로 경골를 제거합니다. </li><li> 반복 반대 사지로) 1.12에) 1.11 단계를 반복합니다. </li><li> 집게를 사용하여, 장소에 대퇴골을 가지고 가위를 사용하여 근육 조직을 둘러싼 절단 차가운 PBS 얼음에 배치, 대퇴골를 제거합니다. </li><li> 반대 다리와 단계를 반복 1.14). </li><li> 멸균 거즈의 새로운 조각을 사용하여 위치에 마우스의 머리를 잡아. 집게와 가위를 사용하여 조심스럽게들 노출 피부를 제거컬 소장. 가위를 사용하여 조심스럽게 후방 뇌를 노출 직선과 아래쪽 라인의 상단 중앙에서 후두부 두개골을 잘라. </li><li> 집게를 사용하여 전방을 향해 뇌의 아래에 특종과 전체 뇌를 제거합니다. 얼음 차가운 PBS의 뇌를 놓습니다. </li><li> 적어도 네 마우스에 대한 단계 1.1) 1.17에)를 반복합니다. </li></ol> 무게 2. 장기 <ol><li> 장기 분리 후, 전자 저울을 사용하여 폐 및 뇌 조직을 포함하는 각 튜브를 PBS 무게. </li><li> PBS를 튜브 + 기관 (폐 및 뇌)의 중량으로부터 미리 분리 체중 (PBS 만) 뺀 중량 차이를 계산한다. </li><li> 계산 된 무게 차이로부터 조직편을 재현 탁에 필요한 용지의 양을 결정한다. 참고 : 폐와 뇌 조직은 4 재 부유에 의해 정규화 무게 : 1 미디어 : 조직 비율 (부피 / 중량). </li></ol> 폐 - 및 뇌 - 금연실 미디어의 3 세대 <ol><li> 멸균 t에서문제 문화 후드는 혈액을 포함하는 기관 및 흡인 PBS에서 잔류 혈액을 제거하기 위해 폐 또는 뇌 세 번을 포함하는 PBS 튜브를 반전. 솔루션은 혈액의 증거와 명확한 나타날 때까지 신선한 차가운 PBS로 반복합니다. </li><li> 별도의 60mm 2 유리 페트리 접시에 폐와 뇌를 놓습니다. 조직 절편의 크기가 약 ~ 1mm 3 때까지 반복적으로 앞뒤로 슬라이스하여 두 멸균 메스 블레이드, 말하다 폐 또는 두뇌를 사용하여. </li><li> 재현 탁 조직 단편은 해당 볼륨에 둘 베코의 변형 이글의 중간 (DMEM)의 (단계 2.3에서 이전에 결정된) : 1 배 보충 F12 미디어 미토 겐 보충 및 페니실린 (50 μg의 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ml)에 집중. </li><li> 6 잘 플레이트 잘 하나에 재 부유 폐 또는 뇌 조직 조각을 추가합니다. </li><li> 37 ° C에서 24 시간 5 % CO 2 미디어에서 조직 조각을 품어. 배양 후, 각 조직과 f를 위해 미디어를 조절 수집합니다urther 한 50㎖ 원추형 튜브에 신선한 미디어 세 동등한 양을 첨가하여 희석한다. </li><li> 15 분 동안 4 ° C에서 각 기관에 대한 희석 된 배지에서 1,000 XG에 원심 분리기는 큰 조직 파편을 제거합니다. 미디어 뜨는 수집하고 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 필터링합니다. </li><li> 수영장은 각 기관에서 미디어를 조절 (예., 뇌와 폐, 뇌와 폐) 여러 마우스의 마우스 투 마우스 변동을 설명 할 수 있습니다. 나누어지는 및 저장은 사용할 때까지 -80 ° C에서 미디어를 조절. </li></ol> 골수 에어컨 미디어의 4 세대 <ol><li> 무균 조직 배양 후드에서 뼈의 과도한 조직을 잘라 내고 가위로 뼈에서 이환 (끝 부분)를 제거합니다. </li><li> 각 골의 중심을 PBS 1 ㎖ 밀어 뼈 ½ 27 G 바늘 플러시 골수 공동 사용. 이는 PBS를 함유하는 신선한 튜브 골수 간질 세포 (BMSC)를 수집 할 수 있도록한다. </li><li> 1,00 원심 분리기0 4 ° C에서 5 분 XG와 PBS로 두 번 BMSC를 씻는다. 뼈 기질 세포 성장 배지 20ml에 재현 탁 골수 간질 세포 (DMEM은 : 1X 보충 된 F12 배지는 분열 촉진 보조제, 페니실린 (50 μg의 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ml) 및 10 % 태아 보벤 혈청 (FBS)을 농축하여 ). </li><li> 접시 한 ​​T75 플라스크에 재현 탁 골수 간질 세포 10 ㎖. 참고 : 각 T75 플라스크에있는 모든 2 마우스에서 결합 및 플레이트 세포; 네 마우스를 들어, 두 개의 T75 플라스크는 (약 1 × 10 7 세포 / 플라스크)이 필요하다. </li><li> 37 ° C에서 24 시간 동안 뼈 기질 세포 성장 배지에서 골수 간질 세포를 인큐베이션하고, 5 % CO 2. 배양 후, 두 T75 플라스크에서 미디어를 제거하고 새로운 T75 플라스크에 넣고, &quot;플로터 플라스크&quot;등이 플라스크 레이블을 붙입니다. 이전 2 플라스크에 신선한 뼈 기질 세포 성장 미디어를 추가하고 CO 2를 37 ° C에서 3 플라스크를 품어 5 %. </li><li> 7 - 세포는 약 70 % 컨 플루 (약 5에 도달 한 후일) 통로 세포. 이 작업을 수행하려면 미디어를 제거하고 PBS (3 ㎖ 각 세척)로 두 번 세포를 씻으십시오. 그 트립신을 보장하는 플라스크의 전체 표면을 커버 PBS를 제거하고 트립신 / EDTA 용액 3 ㎖를 추가한다. 세포를 플라스크 리프트 오프 후 (~ 2-3 분)) 3 ㎖ 뼈 기질 세포 성장 배지를 첨가함으로써 트립신의 반응을 멈춘다. 원심 분리는 900 × g으로 4 ℃에서 5 분 동안 새로운 뼈 기질 세포 성장 배지 10ml에 미디어 및 재현 탁 된 세포를 버린다. </li><li> 모든 플라스크 및 통로 1 풀 세포 : 5 세 개의 새로운 T75 플라스크에 넣고 37 ° C에서 품어 5 % CO 2. 세포가 다시 한 번 70 %에 도달 한 후, 단계 4.6 수영장과 통로 모든 부착 세포를 두 번 반복합니다. 다시 플레이트 네 개의 T75 플라스크에 세포와 37 ° C, 5 % CO 2를 품어. 뼈 기질 세포 성장 매체는 모든 단계에 사용한다. </li><li> 세포가 뼈 기질 세포 수집 미디어를 합류에 도달 PBS로 세포를 세 번 세척하고 추가 할 수 있습니다 (DMEM : F12 미디어 + 1 배 농축 미토 겐 스와pplement + 페니실린 (50 μg의 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (/ ㎖를 50㎍); 이 매체는 FBS이 없는지 확인하고 10 ㎖ / T75). 72 시간 후 골수 에어컨 미디어를 수집, 사용할 때까지 -80 ° C에서 0.22 μm의 필터, 수영장, 나누어지는 및 저장을 통해 필터링합니다. </li><li> 원하는 경우, 이전 13 바와 같이 기술 계측법 표준 흐름을 사용하여 마우스 무서-1, CD105, CD29 및 CD73, CD44,에 대한 항체를 사용하여 분리 된 골수 간질 세포 (BMSC)의 표현형을 확인한다. </li></ol> 림프절 에어컨 미디어의 5 세대 <ol><li> 멸균 조직 배양 후드에서, 림프절 및 흡 묻은 PBS에서 잔여 혈액을 제거하는 림프절 세 번을 함유하는 PBS 튜브를 반전한다. 솔루션은 혈액의 증거와 명확한 나타날 때까지 신선한 차가운 PBS로 반복합니다. </li><li> 60mm 2 유리 페트리 접시에서 림프절를 놓습니다. 반복 tissu 때까지 앞뒤로 슬라이스하여 두 멸균 메스 블레이드, 말하다 림프절을 사용하여E 단편의 크기는 대략 1 내지 3 mm이다. </li><li> 원추형 튜브 로스웰 파크 메모리얼 연구소 1640 (RPMI1640) 페니실린 (50 μg의 / ml)로 보충 된 미디어 / 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ㎖), 5 × 10-5 M 멸균 β 머 캅토 에탄올 10ml에 재현 탁 조직 절편 ( 1.75 μL / 500 ml의 미디어) 10 % FBS. </li><li> 4 ° C에서 5 분 900 XG에 원심 분리기 30 ml의 미디어에있는 모든 세포를 재현 탁. 5 ml의 미디어 / 잘 6 웰 플레이트에 추가하고 37 ° C에서 칠일, 5 % CO 2 품어. </li><li> 7 일간 배양 한 후, 미디어를 버리고 5 ml의 따뜻한 PBS에 부착 된 세포를 씻어 각 웰에 5 ml의에게 신선한 매체를 추가 할 수 있습니다. 단계 4.6에 설명 된대로 모든 세포를, - (7 일 약 5)를 Trypsinize 수영장 및 통로 세포가 포화 상태로 성장 할 수 있습니다. 6 웰 플레이트에 다시 플레이트 세포. 이 단계를 세 번 반복합니다. </li><li> 세 구절 후, PBS로 우물을 세 번 씻어 추가, 세포가 포화 상태로 성장 할 수 있도록 2 ㎖ / 잘 DMEM : F12 + 1 배이 매체는 FBS의 무료 보장 집중 미토 겐 보충 및 페니실린 (50 μg의 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ㎖). 사용할 때까지 -80 ° C에서 72 시간, 수영장, 나누어지는 및 저장 후 림프절 에어컨 미디어를 수집합니다. </li><li> 원하는 경우, 이전 13 바와 같은 기술 표준 유동 세포 계측법을 사용하여 마우스 CD45과 gp38,에 대한 항체를 사용하여 단리 림프절 간질 세포 (LNSC)의 표현형을 확인한다. </li></ol> 암 세포의 전이성 동작에 관련 다운 스트림 분석 실험에 대한 장기 에어컨 미디어 6. <ol><li> 5, 암세포의 전이 거동에 용해 장기 유래 인자의 영향을 결정하기 위해 다른 하류 세포 및 분자 생물학적 분석법을 수행하는 데 사용 - 장기 조정 배지되면 단계 1에 기재된 바와 같이 생성되었다. (다른 문헌에 기재되어 있음) 표준 분석법의 예로는 단백질 어레이 (13), 세포 성장 분석을 포함 &lt;SUP&gt; (13), 셀룰러 이동은 tumorsphere 형성 (14), (13) 분석 및 RT-PCR 15. 원래 기본 미디어 (장기 에어컨 미디어를 생성하는 데 사용 즉, 무조건 DMEM :. 1 배 보충 F12 미디어) 미토 겐 보충 및 페니실린 (50 μg의 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ㎖를 집중 음성 대조군으로 사용한다 . </li></ol>

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

전이는 세포 일련의 이벤트가 조직의 침략과 먼 종양 설립 4,30,31에 대한 궁극적 책임이있는 복잡한 과정이다. 해당 기관의 특정 기관 ( &quot;거기에 도착&quot;)과 성장 ( &quot;가 성장&quot;)에 암 세포 유도 또는 마이그레이션 : 여기에 제시된 생체 모델 시스템은 전이성 진행의 두 가지 중요한 측면을 연구하는데 이용 될 수있다. 많은 연구는 이전 전이 과정에 기여 암세포 자체와 연관된 주요 분자의 특성을 식별에 초점을 맞추고있다. 예를 들어, 조안 Massagué의 그룹에 의해 수행 작업은 폐 별, 뼈 별 및 확산 10-12,32의 뇌 특정 패턴과 관련된 고유 한 유전자 서명을 확인했습니다. 이 작업이 과정 암세포의 기여에 관하여 중요한 식견을 제공하지만, 훨씬 적은 t 기부 기관 특이 요소의 역할에 대해 알려진(13) 연구 상대적으로 도전 남아있다 그는 차 미세. 이것은 <...

유방암은 여성에서 가장 흔히 진단 암 및 암 관련 사망의 제 1 원인이다. 유방암의 높은 사망률 완화 및 전이성 질환을 제거하기 위해 통상적 인 치료 실패 주로이고; 암 관련 사망의 대략 90 %가이 전이에 기인한다. 전이성 캐스케이드의 기본 분자 메커니즘을 이해하는 것은 초기와 후기 단계의 유방암 모두에 효과적인 치료제의 개발에 매우​​ 중요합니다. 최근 연구는 유방암 전이의 다단계 특성을 규명 도왔다하고 두 암의 진행과 전이의 결과 암세포 호스트 환경 (3) 사이의 상호 작용에 따라 크게 좌우된다는 가설이다. 임상 관찰은 많은 암 즉, 장기 친 화성을 ​​표시 있음을 나타냅니다., 경향이 우선적으로 캐스 organs.In 특정에 전이하기유방암의 예는 환자의 질병은 일반적으로 전파 나 뼈, 폐, 림프절, 간, 뇌 4-6 포함한 5 개의 주요 부위로 전이된다. 많은 이론이 과정을 설명하기 위해 개발되었지만, 몇 시간의 시험을 견뎌왔다. 1920 년대에 제안 전이 유잉의 이론은, 전이 thatthe 분포는 기계적인 요인에 엄격 때문 가정; 종양 세포가 정상 정의 생리 혈액의 흐름 패턴에 의해 몸 전체에 실시 단순히 첫 번째 모세관 침대에 체포되어 이에 그들은 7을 발생합니다. 반면에, 스티븐 파 제트 1889 &quot;종자 및 토양&quot;가설은 추가 분자 상호 작용이 생존과 전이의 성장, 암세포는 ( &quot;씨&quot;) 만 자신을 설정할 수있다 적절한 분자 요소를 생산 proliferatein 기관의 미세 환경 ( &quot;토양에 대한 책임이 제안 &quot;) 8. 거의 한 세기 후, 레너드 와이즈에서이전에 출판 부검 데이터의 메타 분석했다 부검시에 검출 된 다수의 전이성 종양 전이 장기 향성 단독 혈류 패턴에 의해 결정된 경우 예상되는 예상 비율로 발견되었다는 유잉 예측을 확인 하였다. 그러나 manyinstances에 다음 유잉 제안 기계 요소 (9)에 의해 예상되는 특정 사이트에 형성된 적은 이상의 전이가 있었다. 이러한 계정과 이론은 특정 장기의 미세 환경이 보급 패턴과 유방암 등 많은 암의 이후의 성장과 생존에 중요한 역할을하는 것이 좋습니다. 과거의 연구 노력은 주로 종양 세포 유래 인자에 집중하고 유방암 전이 10-12에서 관찰 장기 향성 대한 기여는 장기 미세로부터 유래하지만 약간의 연구 탐구되었다 요인 설립 유리한 틈새를 제공 할 수 있다는유방암 전이. 이는 시험관 내에서의 미세 기관의 성분을 연구의 기술적 문제에 주로 기인한다. 현재 문서 인간 유방암 세포의 전이 거동에 림프절, 뼈, 폐, 뇌의 용해 성분의 영향을 연구하기위한 광범위한 생체 모델 시스템을 설명한다. 이전의 연구는 다양한 유방암 세포주가 생체 전이성 전위 (13)에 대응하는 장기 조정 배지에 응답 세포주 특정 및 기관 특이 악성 동작을 표시하는 것을 증명함으로써이 모델 시스템을 검증했다. 이 모델은 시스템 식별 및 유방암의 성장, 이동에 영향을 포함한 암 세포의 다른 유형의 전이 동작 역할을하는 특정 장기 유래 가용성 인자를 평가하고, 행동 및 유전자 발현 등을 막기 위해 사용될 수있다 도의 확인 등암에 대한 잠재적 인 새로운 치료 목표. 이를 상세히 기관 특이 전이 거동을 연구하고, 암전이 과정을 구동하기에 장기 유래 가용성 인자의 역할을 평가하기 위해 사용될 수있는 제 체외 모델 시스템이다.

<table><tbody><tr><td>50 ml 원뿔형 튜브</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>339652</td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>1x 인산염 완충 식염수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>누드 마우스</td><td>Harlan Laboratories</td><td>Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu</td><td>6 - 12주 령에 사용</td></tr><tr><td>폴리스티렌 폼 패드</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>폴리스티렌 폼 선적 컨테이너의 버려진 뚜껑 (~ 4 x 8 인치 이상)을 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다. 에탄올로 닦아 살균합니다.</td></tr><tr><td>집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>멸균</td></tr><tr><td>가위</td><td>유지 Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>멸균</td></tr><tr><td>거즈 패드</td> 유지 <td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>60mm2 유리 페트리 접시</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7016560</td><td>멸균</td></tr><tr><td>메스 블레이드</td> 유지 <td>Fisher Scientific</td><td>S95937A</td><td>멸균 상태</td></tr><tr><td>유지 DMEM:F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td>37°C에서 따뜻하게 하십시오. 사용 전에 C 물 목욕, 멸균 상태를 유지하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Mito + Serum Extender</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td>원고에서 "농축 미토겐 보충제"라고 합니다. 멸균 페</td></tr><tr><td>니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)</td><td>을 유지하세요Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>멸균 상태를 유지</td></tr>하세요 <tr><td>Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>37 &deg에서 따뜻하게; 사용 전에 C 물 목욕, 멸균 상태를 유지하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051-500ML</td><td>멸균</td></tr><tr><td>트립신/EDTA 용액</td> 유지 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>R-001-100</td><td>37°C에서 따뜻하게; 사용 전에 C 물 목욕, 멸균 상태를 유지하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>6웰 조직 배양 플레이트</td><td>Thermo Scientific(Nunc)</td><td>140675</td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>0.22 &mu; m 주사기 필터</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359904</td><td>멸균</td></tr><tr><td>T75 조직 배양 플라스크</td> 유지 <td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>178905</td><td>멸균 Transwell 유지</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3464</td><td>멸균 유지, 마이그레이션 분석에 사용</td></tr><tr><td>Anti-mouse Sca-1</td><td>R& D 체계</td><td>는</td><td>10 &micro에 사용을 FAB1226P 있습니다; l/106 세포</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD105</td><td>R& D Systems</td><td>FAB1320P</td><td>10 &micro에서 사용합니다. l/106 셀</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD29</td><td>R& D Systems</td><td>FAB2405P-025</td><td>10 &micro에서 사용; l/106 세포</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD73</td><td>R& D Systems</td><td>FAB4488P</td><td>10 &micro에서 사용합니다. l/106 세포</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD44</td><td>R& D Systems</td><td>MAB6127-SP</td><td>는 0.25 &마이크로에서 사용합니다. g/106 세포</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD45</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>5 &micro에서 사용; l/106 세포</td></tr><tr><td>안티-마우스 gp38</td><td>eBioscience</td><td>12-5381-80</td><td>10 &micro에서 사용; L/106 세포</td></tr><tr><td>&베타;-메르캅토에탄올&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>M6250&nbsp;</td><td>멸균 상태 유지</td></tr><tr><td>단백질 어레이</td><td>RayBiotech Inc.</td><td>AAM-BLM-1-2</td><td>미디어 조건(네거티브 컨트롤 포함)당 1개의 어레이를 3회 사용</td></tr></tbody></table>

유방암 전이성 행동에 장기 별 영향 유학을위한 장기 에어컨 미디어 및 응용 프로그램의 생성

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

유방암은 유방암 환자에서 림프절, 뼈, 폐, 뇌 및 간으로 우선적으로 전이됩니다. 이전의 연구 노력은 관찰된 이러한 전이성 패턴(장기 친화성이라고 함)을 유발하는 유방암 세포에 내재된 요인을 확인하는 데 중점을 두었지만, 이 과정에 기여하는 특정 장기 내에 존재하는 요인에 대해서는 알려진 바가 훨씬 적습니다. 이는 부분적으로는 장기 미세환경을 정확하게 재현하는 체외 모델 시스템이 부족하기 때문입니다. 이 문제를 해결하기 위해 다양한 장기 미세환경 내에 존재하는 용해성 인자를 연구할 수 있는 체외 모델 시스템이 구축되었습니다. 이 모델은 정상적인 흉선 누드 마우스에서 분리된 장기(림프절, 뼈, 폐 및 뇌)에서 조건화된 매체를 생성하는 것으로 구성됩니다. 모델 시스템은 서로 다른 유방암 세포주가 생체 내 전이 가능성에 해당하는 장기 조절 배지에 반응하여 세포주 특이적 및 장기 특이적 악성 행동을 나타낸다는 것을 입증함으로써 검증되었습니다. 이 모델 시스템은 성장, 이동, 줄기와 같은 행동 및 유전자 발현에 대한 영향뿐만 아니라 암에 대한 잠재적인 새로운 치료 표적의 식별을 포함하여 유방 및 기타 유형의 암 세포의 전이성 행동에 역할을 할 수 있는 특정 장기 유래 용해성 요인을 식별하고 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 장기 특이적 전이성 행동을 자세히 연구하고 암 전이 과정을 주도하는 특정 장기 유래 용해 인자의 역할을 평가하는 데 사용할 수 있는 최초의 생체 외 모델 시스템입니다.

장기 에어컨 미디어의 생성 장기 절연 및 조정 배지의 생성 방법의 개요도 / 개략도는도 2에 도시 된 절차를 나타내는 사진 영상과 함께,도 1에 나타나있다.이 프로토콜 처음 개발되었을 때, 간 포함되었음을 주목해야 분석에서 유방암 전이의 일반적인 위치이기 때문이다. 그러나, 제조 및간에 의해 분비되는 단백질 분해 효소의 대량, 이는 양질의 조정 배지를 생성하기에 충분히 오래 생존 간 유지하는 것은 매우 어렵다. 간 조정 배지 격리되면도 안정되지 않고, 같은 이유로 예상 단백질 침전물을 많이있을 쉽다. 따라서 간은 더 이상 분석에 포함되지 않았다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within 페이지 = &quot;1&quot...

이 원고는 생쥐의 림프절, 뼈, 폐 및 뇌에서 파생된 장기 조절 매체로 구성된 생체 외 모델 시스템을 설명합니다. 이 모델 시스템은 장기 유래 용해성 인자와 그 요인이 암세포의 장기 영양성 및 전이성 행동에 미치는 영향을 식별하고 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused ...

이 절차의 전반적인 목적은 마우스의 림프절, 뼈, 폐 및 뇌를 사용하여 조건 배지를 생성함으로써 장기 유래 수용성 인자를 식별 및 연구하고, 이러한 인자들이 암세포의 전이 행동에 미치는 영향을 분석하는 것입니다. 이 방법은 장기 특이적 인자들이 암세포의 성장, 이동 및 유전자 발현에 어떻게 영향을 미치는가와 같은 전이 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 기술은 암세포의 표현형과 행동에 영향을 주는 장기 특이적 in vivo 수용성 인자를 대표하는 간편한 ex vivo 플랫폼을 제공합니다.림프절을 분리하려면, 먼저 6~12주령의 마우스를 멸균 조직 배양 후드 내의 폴리스티렌 폼 패드 위에 놓고, 사지를 뻗은 상태로 고정합니다. 다음으로, 핀셋과 가위를 사용하여 생식기부터 입까지 복부 피부의 중앙선을 따라 절개합니다. 그런 다음, 복근에서 피부를 부드럽게 들어 올려 해부 패드에 핀으로 고정합니다.가위를 사용하여 피부, 지방 및 혈관에서 림프절을 조심스럽게 제거하고, 채취하는 즉시 30 mL의 얼음처럼 차가운 PBS에 넣습니다. 모든 림프절을 수집한 후, 포셉과 가위를 사용하여 노출된 복벽을 흉골 방향으로 위쪽으로 조심스럽게 절개하여 흉강을 노출시킵니다. 횡격막을 절개합니다.폐를 아래쪽에서 들어 올리고, 기관 방향으로 하부 조직을 절단합니다. 그런 다음, 폐를 얼음처럼 차가운 PBS가 담긴 새 용기로 옮깁니다. 심장은 이 단계에서 또는 장기 무게 측정 전에 폐에서 제거할 수 있습니다.다리뼈를 채취하려면 마우스를 복와위로 배치하고, 옆구리에서 옆구리까지 허리 하단부의 피부를 절개합니다. 다음으로 멸균 거즈를 사용하여 몸통과 다리 및 발 위의 피부를 잡습니다. 동일한 거즈를 사용하여 하퇴부를 잡은 상태에서 한쪽 발의 발목 관절을 조심스럽게 분리하고, 관절 위쪽의 피부를 무릎 방향으로 근위부로 벗겨냅니다.그 다음 가위로 무릎 관절에서 경골을 제거하고 다리뼈를 얼음처럼 차가운 PBS에 넣습니다. 두 번째 경골을 채취한 후, 핀셋으로 대퇴골을 고정한 상태에서 가위로 주변 근육 조직을 잘라냅니다. 그런 다음 다리뼈를 얼음처럼 차가운 PBS에 넣습니다.뇌를 적출하려면, 멸균 거즈를 사용하여 머리를 잡고 가위와 핀셋으로 피부를 조심스럽게 제거하여 두개골을 노출시킵니다. 다음으로, 가위를 사용하여 두개골 상단 중앙에서 후두골을 직선으로 아래 방향으로 조심스럽게 절개하여 뇌 후방부를 노출시킵니다. 그런 다음, 두개골 앞쪽을 향해 조직 아래쪽을 긁어내듯 뇌 전체를 얼음처럼 차가운 PBS로 옮깁니다.폐 조건화 배지를 생성하려면, 폐 조직이 담긴 튜브를 세 번 뒤집어 장기에 남아 있는 잔류 혈액을 제거합니다. 그다음, 세척액을 신선하고 차가운 PBS로 교체하고 식염수에 혈액이 더 이상 보이지 않을 때까지 이 과정을 반복합니다. 이어서, 마우스 한 마리당 하나의 60 square millimeter 유리 페트리 접시에 폐를 옮기고, 두 개의 멸균 메스 날을 사용하여 조직을 앞뒤로 반복해서 썰어 잘게 다집니다.조직 조각의 크기가 약 1mm³가 되면, 항생제가 첨가된 적절한 부피의 DMEM:F12 배지에 조각들을 다시 현탁하고, 6웰 플레이트의 각 웰에 생쥐당 하나씩 조직을 넣어 37°C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 24시간 후, 각 웰의 전체 내용물을 개별 50mL 원심분리 튜브로 옮기고, 튜브당 3배 부피의 신선한 DMEM:F12 배지를 넣어 조건화 배지를 희석합니다. 튜브를 원심분리하여 큰 조직 파편을 제거합니다.그 후, 컨디셔닝된 배지를 0.22 micron 시린지 스트레이너를 통해 단일 50 milliliter 원심 분리관에 모읍니다. 골수 컨디셔닝 배지를 제조하려면, 무균 조직 배양 후드 아래로 뼈를 옮기고 뼈에서 불필요한 조직을 제거합니다. 가위를 사용하여 골단(epiphyses)을 제거합니다.그 다음, 27.5게이지 바늘을 사용하여 각 뼈의 골수강을 통해 1 mL의 PBS를 신선한 PBS가 담긴 튜브로 세척하여 밀어냅니다. 모든 골수 기질 세포가 수집되면, 세포를 PBS로 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 골 기질 세포 성장 배지 20 mL에 펠렛을 재부유시키고, T75 플라스크당 10 mL의 세포를 분주합니다.세포의 밀도가 약 70% confluency에 도달하면, 3 mL의 PBS로 배양물을 2회 세척합니다. 그 다음, 0.025% trypsin/EDTA 용액 3 mL를 사용하여 세포를 분리하며, 이때 trypsin이 플라스크 표면 전체를 덮도록 주의합니다. 2~3분 후, 3 mL의 골기질세포 성장 배지를 첨가하여 효소 반응을 중단시키고, 세포를 50 mL 튜브에 모읍니다.세포를 원심 분리하여 가라앉힙니다. 그 다음, 펠렛을 10 milliliters의 신선한 배지로 다시 현탁합니다. 이제 세포가 70%confluency에 도달할 때까지 1:5 비율로 세 개의 새로운 T75 플라스크에 나누어 배양합니다.그런 다음, 방금 시연한 것과 같이 PBS로 세포를 3회 세척하고, 미토젠과 항생제가 첨가된 혈청 무첨가 골기질 세포 수집 배지를 넣어 72시간 동안 배양합니다. 배양 3일 후, 0.22 micron 스트레이너를 통해 배지를 모읍니다. 기질 세포는 배양 접시에 부착되어야 하며, 림프절 기질 세포 배양에서는 길쭉한 섬유아세포 모양이 관찰되고, 골수 기질 세포 배양에서는 더 작고 둥근 모양이 나타납니다.유세포 분석을 통해 림프절 기질 세포가 대부분 CD45 음성 및 gp38 양성임을 확인합니다. 골수 기질 세포는 CD-44와 CD-29에 대해 양성, CD-105와 Sca-1에 대해 약양성, 그리고 CD-73에 대해 음성 반응을 보여야 합니다. 유전적 배경이 다양한 인간 유방암 세포는 특정 장기 조건에 따라 서로 다른 이동 및 성장 패턴을 나타냅니다.예를 들어, 이 대표적인 실험에서 뼈 친화성 231-BoM 변이체는 뇌 및 폐 조건화 배지보다 골수 조건화 배지로 우선적으로 이동합니다. 마찬가지로, 폐 친화성 231-LM2 변이체는 골수 및 뇌 조건화 배지보다 폐 조건화 배지로 우선적으로 이동합니다. 또한, RT qPCR 분석 결과, 모세포인 MDA-MB-231 유방암 세포를 뼈 또는 폐 조건화 배지에 노출시키면 생체 내에서 유방암 세포의 뼈 또는 폐 특이적 전이와 관련된 유전자들의 발현이 상향 조절됨이 나타납니다.숙련된 경우, 적절하게 수행한다면 조직 채취 및 조건배지 준비는 2~3시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이후 며칠 동안 진행되는 계대 배양 단계는 하루에 15~30분 정도 소요됩니다. 이러한 절차를 수행할 때 모든 과정을 멸균 상태로 유지하는 것이 중요합니다.조건화 배지 생성 후, 암세포 행동에 미치는 장기 특이적 인자의 영향에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 단백질 어레이, 세포 성장 및 이동 분석, 종양구 형성, RT-PCR 등의 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 유방암 연구 분야의 연구자들은 ex vivo 모델 시스템에서 장기 특이적 전이 행동을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 생쥐의 뼈, 폐, 뇌를 사용하여 조건화 배지를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.날카로운 해부 도구를 사용하는 것은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 정밀하고 주의 깊은 해부 기술을 사용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 쥐의 간에서 유래한 장기 조절 배지를 생성하는 방법을 설명합니다. 이 모델 시스템은 장기 유래 용해성 인자와 그 요인이 암세포의 장기 영양성 및 전이성 행동에 미치는 영향을 식별하고 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

장기 조절 배지: 전이성 암 연구를 위해 수확된 장기 세포에서 배지 생성

손상 조직을 사용 organoids 차 세포 배양은 다세포 생체 내 미세 환경을 모방 모델 시스템을 제공한다. 우리는 효소 조직을 중단하지 않고 형태를 차별화 혼합 세포 배양 계통 및 전시회를 영속 무 혈청 차 유방 상피 조직 배양 모델을 개발했다. 유방 organoids&gt;는 6 개월 가능한 남아있다.

비 효소, Mammospheres의 자연 발생에 대한 사전 침습 유방 병변의 혈청이없는 조직 문화

프로토콜 인간 뼈 조직 이식편 모델 시스템에서 유방암 세포의 이동, 증식 및 집락 공부 설명된다.

배양 인간의 대퇴골 조직 외식하는 방법은 전이성 틈새의 유방암 세포 집락을 연구하기 위해

마우스 유 방 땀 샘에서 개발 된 소기관을 조사 하 고 면역 세포와의 상피 특성과 상호 작용을 평가 하는 것을 특징으로 한다. 조사 된 유기 체는 조사 된 정상 조직에서 종양 세포 모집을 유도할 수 있는 세포-세포 상호작용을 더 잘 평가 하기 위해 사용 될 수 있다.

유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체의 성장과 특성화

우리는 전립선 종양 해부에 초점을 맞춘 마우스 전립선 암 모델의 부검 및 해부를위한 방법을 보여줍니다. 마우스 전립선 종양 오르가노이드의 생성을 위한 단계별 프로토콜도 제시된다.

전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성

상피 및 기질 세포로 구성되는 인간 1 차 자궁내막 오르가노이드를 생성하고 네이티브 자궁내막 조직의 특성을 유지하는 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 자궁 조직 획득에서 자궁 내막 오르가노이드의 조직학적 처리에 이르는 방법을 설명합니다.

다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성

유방 동맥은 외부 근상피 및 내부 발광 상피 세포를 포함하는 이중 층 구조입니다. 제시된 것은 차동 트립시니화를 이용하여 오르가노이드를 준비하는 프로토콜이다. 이 효율적인 방법은 연구원이 별도로 유선 양식 및 기능에 있는 그들의 역할에 관하여 질문을 탐구하기 위하여 이 2개의 세포 모형을 조작하는 것을 허용합니다.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

이 원고는 전이성 캐스케이드의 모든 단계에서 개입할 수 있는 orthotopically 주입된 유방 종양의 자발적 폐 전이의 확립 및 종단 성장 모니터링을 위한 방법론을 설명합니다.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

이 프로토콜은 차등 원심분리를 통해 원발성 정상 및 종양 유방 조직에서 상피 오가노이드를 생성하는 접근 방식에 대해 논의합니다. 또한 3차원 배양 및 포매된 오가노이드의 면역형광 이미징에 대한 지침이 포함되어 있습니다.

계대증 없이 정상 및 종양 유방 조직에서 마우스 및 인간 상피 오가노이드 생성 및 이미징

환자 유래 유방 종양 절제술 또는 정상 유방 조직에서 인간 유방 오가노이드를 확립하기 위한 자세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 이 프로토콜은 인간 환자 유래 유방 오가노이드의 배양, 동결 및 해동에 대한 포괄적인 단계별 지침을 제공합니다.

환자 유래 유방 오가노이드의 확립 및 배양

학습하세요 생쥐 림프절, 뼈, 폐, 뇌에서 장기 조건배양액을 생성하여 암세포 전이 행동에 미치는 장기 특이적 용해성 인자를 연구하는 방법을. 이 기술은 암 연구에 중요한 ex vivo 플랫폼을 제공합니다.

유방암 전이성 행동에 장기 별 영향 유학을위한 장기 에어컨 미디어 및 응용 프로그램의 생성

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