동계 쥐 흑색 종 세포의 주입은 폐에서 그들의 전이성 잠재력을 확인하는 방법

이 절차의 전반적인 목표는 black six 마우스에서 전이성 종양을 생산하는 방법을 입증하는 것입니다. 이 방법은 연구제가 폐의 면역 반응에 어떤 영향을 미치는지와 같은 면역 요법 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 실험이 전이된다는 것입니다.

따라서 결과는 신뢰할 수 있고 비교적 일관성이 있습니다. 먼저 B16-BL6 흑색종 세포의 배양액을 약 70% 포화도에 있어야 하는 배양물을 멸균 후드에 넣습니다. 다음으로, 각 접시에 05%트립신 EDTA 1ml를 넣고 세포를 1분 동안 그대로 둡니다.

이 용액을 흡입한 후 모든 플레이트에 1ml의 트립신을 첨가한 다음 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 10분 후, 세포를 멸균 후드로 옮기고 각 플레이트에 4ml의 무혈청 RPMI 배지를 추가합니다. 그런 다음 멸균 전동 피펫으로 세포를 수집합니다.

배출 바늘을 막을 수 있는 덩어리를 분해하려면 피펫 끝을 플레이트 바닥에 대고 누르고 세포를 배출합니다. 이 과정을 여러 번 반복한 후 세포를 회수하여 15mm 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 세포 현탁액의 샘플을 제거하고 혈구계에 도입한 다음 세포 밀도를 측정합니다.

셀 현탁액을 4개의 15ml 튜브에 Equally로 할당합니다. 그런 다음 튜브를 원심 분리한 다음 상층액을 디캔팅합니다. 각 튜브에 서로 다른 세포 밀도(밀리리터당 0, 0.063, 0.125, 0.25 또는 0.50만 세포)로 레이블을 지정합니다.

그런 다음 각 원뿔형에 적절한 양의 무혈청 RPMI를 첨가하여 이러한 최종 농도를 생성합니다. 혈구계를 사용하여 원하는 세포 밀도를 확인합니다. 다음으로, 각 현탁액 500마이크로리터를 얼음 위에 놓인 라벨이 붙은 1.8밀리리터 튜브에 할당합니다.

모든 B16-BL6 세포 현탁액이 준비되면 마우스를 선택합니다. 꼬리를 잡고 동물의 뒷부분을 먼저 구속기로 안내합니다. 마우스의 몸통이 메인 챔버에 있고 꼬리가 장치 외부에 있을 때 동물을 구속기의 끝으로 당깁니다.

그런 다음 레스트레이너 플런저를 삽입하고 마우스가 고정될 때까지 플런저를 계속 누릅니다. 동물이 제자리에 놓이면 측면 꼬리 정맥 중 하나가 위쪽을 향하도록 마우스를 90도 회전합니다. 그런 다음 알코올 패드를 사용하여 정맥이 가장 잘 보이는 쥐의 꼬리 측면을 세게 청소합니다.

주입을 준비하려면 먼저 밀리리터당 50만 개의 현탁액 중 300마이크로리터를 주사기에 수집합니다. 그런 다음 주사기를 뒤집고 옆으로 튕기고 플런저를 밀어 주사기에서 기포를 배출합니다. 기포가 제거되면 세포 배양을 배출하여 주사기에서 최종 부피 250마이크로리터를 생성합니다.

주로 사용하지 않는 손으로 마우스 꼬리를 뻗습니다. 집게손가락이 꼬리의 근위부 끝을 들어 올리고 엄지손가락이 원위부를 누르도록 유지합니다. 주로 사용하는 손으로 바늘을 꼬리의 말단 끝을 향한 정맥에 미세한 아래쪽 각도로 삽입합니다.

그런 다음 바늘을 더 삽입하여 꼬리 정맥의 각도와 일치하도록 조정합니다. 바늘을 꼬리 정맥에 약 1cm 삽입한 후 주사기를 단단히 잡고 플런저를 밀기 시작합니다. 입구 부위에 거즈를 대고 출혈을 멈춥니다.

세포 현탁액이 배출되면 정맥에서 바늘을 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 구속기에서 플런저를 제거하고 마우스를 수용 케이지에 넣습니다. 이 프로토콜은 전이성 흑색종의 유용한 모델을 만들기 위해 주입할 B16-BL6 세포의 최적 수를 식별하는 것을 목표로 했습니다.

여기에 표시된 것은 5개의 서로 다른 세포 밀도를 주입한 후 2-3주 후에 폐에 형성된 화살표로 표시된 실험적 초점입니다. 밀리리터당 500, 000개의 세포를 주입했을 때, 병소는 폐를 완전히 덮었습니다. 여기에 표시된 예에서는 102개의 초점이 계산되었습니다.

대조적으로, 폐는 밀리리터당 62, 500 세포 또는 밀리리터 당 125, 000 세포를 주입했을 때 병소로 드문드문 덮여 있었습니다. 이러한 밀도는 각각 1과 17의 폐 병소 수를 초래했습니다. 이 방법을 사용하여, 주입하기 위하여 세포의 최적 농도가 밀리리터 당 250, 000개의 세포이었다는 것을 결정되었다.

이 밀도는 약 65개의 병소를 가진 폐를 낳았는데, 이 숫자는 장기가 완전히 덮여 있지도 않고 병소로 너무 드문드문 덮여 있지도 않습니다. 그래프로 표시했을 때 이러한 데이터의 추가 열거는 여기에 표시된 것처럼 밀리리터당 125, 000개 이상의 폐 병소와 세포 배양 밀도 사이의 대략적인 선형 관계를 보여줍니다. 일단 숙달되면 이 기술은 한 시간 이내에 수행할 수 있으며, 적절하게 수행되면 마우스 수에 따라 다릅니다.

절차를 시도하는 동안 마우스당 동일한 수의 셀을 주입하려고 시도하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 약물 전달과 같은 다른 방법을 수행하여 잠재적 치료법이 여러 결과 병소에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 암 연구자들이 블랙 식스 마우스의 흑색종에서 전이성 암의 구성 성분을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 B16-BL6 세포를 수집 및 준비하고, 마우스를 억제하고, 바늘을 준비하고, 각 꼬리 정맥에 동일한 수의 세포를 주입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 포유류 문화와 바늘을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로 바늘 찌르기를 피하고 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.