표현과 예방 접종에 대한 바이러스 입자의 정제

여기서는 배큘로 바이러스 또는 포유류 발현 시스템, 및 초 원심 정제를 사용하여 바이러스 입자의 합성을위한 프로토콜을 제시한다. 이것은 매우 최적화 방법은 안전하고 유연하게 타겟으로 백신 바이러스 항원을 확인하는 데 사용된다.

이 절차의 전반적인 목표는 포유류 또는 곤충 세포 발현 시스템에 의해 발현되고 분비되는 바이러스 유사 입자 또는 VLP를 정제하는 것입니다. 이 방법은 안전하고 유연한 방식으로 구조적으로 관련된 바이러스 항원을 발현하고 정제하는 방법과 같은 백신 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 단백질을 침전시키거나 VLP를 농축하기 위해 다중 밀도 층을 준비할 필요가 없다는 것입니다.

이 방법은 바이러스 항원을 백신 표적으로 식별하는 데 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, VLP는 질병 진단 및 혈청학을 위한 도구로도 사용할 수 있습니다. VLP 재현탁 단계에서 글리세롤 언더레이는 초보자가 적절한 기술을 연습하지 못할 수 있기 때문에 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. transvection 당일에는 제조업체의 권장 사항에 따라 리포좀 및 DNA 용액을 준비합니다.

HA to NA to Gag의 1 대 1 대 2의 DNA 구성과 T150 플라스크당 총 DNA 수량 40마이크로그램으로 DNA 세포를 형질전환 합니다. 이 단계를 반복하여 총 200ml 용량의 T150 플라스크 9개를 만듭니다. 다음으로, 항생제 없이 DNA와 리포좀 용액을 무혈청 형질주입 배지에서 희석하여 각 플라스크에 총 부피가 24ml가 포함되도록 합니다.

플라스크를 인큐베이터로 되돌리고 바이러스와 유사한 입자 또는 VLP가 수확되는 날까지 세포와 형질주입 배양 배지를 유지합니다. 상등액을 50ml 원추형 튜브로 옮겨 transvection 후 72-96시간 후에 세포에서 배양액을 수확합니다. 세포를 회전시켜 세포 파편을 펠릿으로 만듭니다.

상층액을 모아 0.22 미크론 주입 멤브레인을 통해 여과합니다. 배양은 이전에 다점 교반기 플레이트 시스템에서 130rpm으로 연속 교반하여 스피너 플라스크에 현탁액으로 spodoptera frugiperda 또는 Sf9 세포를 준비했습니다. 적절한 폭기를 위해 배양 부피를 스피너 플라스크 부피의 절반 이하로 유지하십시오.

다음으로, 스피너 플라스크에 있는 250ml의 Sf9 세포를 10밀리리터당 6개의 세포로 2배 밀도로 감염시켜 CHIK VLP를 발현하고 세포를 섭씨 28도의 인큐베이터로 되돌립니다. 트리판 블루 배제를 사용하여 세포 생존율이 70-80%로 감소했는지 확인합니다.확인 후 배양액을 현탁액에서 50ml 원추형 튜브로 직접 옮기고 세포를 스핀 다운합니다. 상층액을 수집하고 침강 전에 0.22 미크론 주입 멤브레인을 통해 여과합니다.

25mm x 89mm 개방형 초원심분리기 튜브 6개를 70% 에탄올로 살균합니다. 그런 다음 에탄올이 완전히 건조되었는지 확인하십시오. 깨끗한 튜브에 32ml의 상등액을 로드합니다.

다음으로, 3ml의 멸균 20% 글리세롤과 PBS를 상등액 밑에 조심스럽게 놓습니다. 글리세롤과 VLP 용액 사이의 얇은 밀도 층이 파괴되지 않도록 글리세롤을 천천히 밑에 깔아줍니다. 글리세롤을 너무 빨리 분주하면 글리세롤과 VLP 용액이 혼합되어 VLP 침전이 감소합니다.

튜브의 균형이 맞는지 확인한 다음 스핀을 시작하십시오. 4시간 후 원심분리기에서 튜브를 제거합니다. 튜브에서 펠릿이 제거되지 않도록 주의하면서 상등액을 흡인합니다.

멸균 PBS를 사용하여 튜브 바닥의 최소 100마이크로리터에 침전된 VLP를 부드럽고 천천히 위아래로 피펫팅하여 다시 부유시킵니다. VLP 펠릿의 재현탁은 피펫을 사용하여 PBS를 부드럽고 천천히 반복 흡인 및 배출하여 수행해야 합니다. VLP 손실을 제한하기 위해 기포를 생성하지 마십시오.

마지막으로, 재현탁된 VLP를 보관합니다. 기존 BCA 분석의 VLP 부피 및 총 단백질 수율은 다양한 SVP 및 VLP 구성물에서 얻었습니다. Sf9 세포의 CHIK SVP 수율은 상층액 1밀리리터당 총 단백질의 0.008 - 0.016 밀리그램 범위입니다.

포유류의 293 T 세포를 통한 생산은 단백질의 10배 감소를 가져온다. 이 전자 현미경 사진 이미지는 HA Gag 코어 인플루엔자 VLP가 VLP로 성공적으로 발현, 조립 및 정제되었음을 보여줍니다. 이 절차를 시도하면 건강하고 생존 가능한 세포 배양만 transvect 및 infecting해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이는 전반적인 단백질 발현 수준에 영향을 미치기 때문입니다.

이 절차에 따라 BCA, ELIZA 및 HA 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 총 단백질 함량, 특정 항원 함량 및 기능적 HA의 발현을 측정할 수 있습니다. 초원심분리기로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 튜브의 균형을 맞추고, 권장 로터와 속도만 사용하고, 새로운 실험실 직원에 대한 적절한 감독과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.