Name: 표현과 예방 접종에 대한 바이러스 입자의 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 배우세요 포유동물 및 곤충 세포 시스템에서 바이러스 유사 입자(VLP)를 정제하는 방법을. 초원심분리를 활용하여 백신 타겟으로서 바이러스 항원을 안전하게 식별할 수 있습니다.

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인플루엔자 H3N2 VLP의 생성 1.​​ 포유 동물 발현 시스템 <ol><li> 이러한 서브 클론 전술 pTR600 진핵 발현 벡터 내로 구조적 바이러스 당 단백질 헤 마글 루티 닌 (HA), 뉴 라미니다 제 (NA), 및 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 개그 P55. 7 </li><li> 화학적 능력 대장균 (예 DH5α)에서 DNA를 증폭하고 제조자의 지시에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 형질 급 플라스미드를 분리. DNA의 양 수율 및 사용자의 필요에 따라 달라집니다. </li><li> 가습 인큐베이터에서 5 % CO 2, 37 ℃에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 성장 배지에서 포유 동물 세포주 293T를 유지한다. </li><li> 은 T-150 조직 배양 플라스크 플라스크 다음 하루 전체 세포 부착 및 85-95% 세포 포화 상태를 취득하도록 플라스크 당 45-75 × 10 6 세포를 포함하도록 세포를 성장. 원하는 conflu에 대한 현미경으로 세포를 검사ency. 참고 : 높은 세포 밀도는 전형적 그러나 과도한 컨 플루 세포 부산물 폐기물의 축적의 결과 및 세포 생존을 감소 상업적 형질 전환 시약을 사용하는 경우 최소한의 세포 독성을 최적 단백질 발현을 생성 할 것을 권장한다. </li><li> NA : 1 : HA의 두 형질의 날 (1)의 DNA 조성물 DNA 세포를 제조자의 권장 사항에 따라 리포솜과 DNA 혼합물을 제조 및 형질 개그 T-150 플라스크 당 40 μg의 총 DNA 양으로. 각각의 플라스크를 20 내지 30 ml의 총 부피가 포함되도록 항생제없이 무 혈청 배지에서 형질 전환 DNA와 리포좀 용액을 희석. 참고 : 유전자 구조의 비율은 사용자 최적화가 필요할 수 있습니다. : 1 비율 여기서 증명되지 않았지만, 유사한 형질 전환 절차는 1에서 호흡기 합 포체 바이러스 (RSV) F 및 HIV 개그 수행되었다. DENV 및 CHIKV 하나의 발현 플라스미드, T-150 플라스크 당 DNA의 20 μg의 총 최적의 전자에 사용되는xpression. DNA : 형질 전환 시약 비율은 사용자에 최적화되어 있습니다. 사용은 형질 전환 방법에 기초하여 형질 매체 추천 즉, 다가 양이온 지질 형질 따라서 미디어 성장 호르몬 보충 될 수 감소 또는 소 태아 혈청의 부재를 추천 및 혈청의 부재하에 성장을 지원하기 위해 미량 원소. </li><li> 5 % CO 2 배양기에 37 ° C로 플라스크를 돌려줍니다. 200 ML의 볼륨의 경우, 9 T-150 플라스크를 사용합니다. 세포는 VLP 수확의 날까지 형질 전환 배양 배지에서 유지됩니다. </li><li> 72-96 시간 포스트 형질이 항원에 따라, 또는 현미경 검사를 통해서 추정으로 세포 생존율이 70 ~ 80 %로 감소 할 때 후 세포에서 수확 배양 상청. 전송 50 ML 원뿔 튜브에 뜨는 및 세포 파편 펠렛 4 ° C에서 5 분 동안 500 × g에서 세포를 스핀 다운. 참고 : yiel 것이다 부착 세포에 신선한 사전 예열, 무 혈청 형질 미디어 3 일 뜨는 교체와 비슷하거나 약간 감소 수율 VLP를의 다 두 번째 많은 사용자가 최적화되어야한다. </li><li> 초 원심 분리를 통해 침전 전에 0.22 μm의 기공 멤브레인을 통해 풀 뜨는 및 필터. </li><li> 0.8 % 칠면조 또는 포유류의 적혈구를 사용하여 표준 혈구 응집 분석 (14)에 의해 HA-표현 VLP를의 혈구 응집 활성을 테스트 또는 항원 특이 적 ELISA를 진행합니다. 대표적인 결과 그림 2를 참조하십시오. </li></ol> 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템을 사용하여 2 CHIK의 VLP 식 <ol><li> 상업적 배큘로 바이러스 발현 시스템을 이용하여 S-27 균주 chikungunya 바이러스 캡시드 및 외피 단백질 (C-E3-E2-6K-E1)를 발현하는 재조합 배큘로 바이러스를 생성한다. </li><li> 28 ° C에서 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 혈청 인 Sf9 성장 배지에서 배양 스포 도프 테라 프 루기 페르 Sf9 세포. suspens에 대한 스피너 플라스크 배양을 시작하는 데 3 ~ 5 × 10 5 C / ㎖를 사용하여이온 세포 증식. 통로 일상적 이들은 2-4 × 106 C / ㎖ (3-4 일마다)의 세포 밀도에 도달했을 때. </li><li> 지점 교반기 플레이트 시스템에서 130 rpm으로 교반와 스피너 플라스크에서 서스펜션 문화 인 Sf9 세포. 적절한 통기를 들어, 스피너 플라스크없이 절반 이상 볼륨에서 문화 볼륨을 유지한다. </li><li> CHIK VLP를 발현를 들어, 1의 복수개 감염으로 재조합 바쿠 바이러스로 2 × 106 세포 / ml의 밀도로 Sf9 세포를 감염 28 ° C의 배양기로 복귀. 통상적으로, 250 ㎖의 Sf9 세포를 함유하는 하나 또는 두 개의 스피너 플라스크, 감염. 참고 : 우리는이 방법을 사용하지 않지만, Sf9 세포가 통 플랫폼을 사용하여 28 ℃에서 진탕 플라스크에서 배양 할 수있다. </li><li> 세포 생존율이 70~80%로 감소되었을 때 수확 문화는 72-96 시간 게시물 감염 후 또는 제조사의 프로토콜에 따라 트리 판 블루 배제에 의해 결정. 참고 : 세포가 감염된 상태에서 증식을 계속하고있다삼일 후 감염 수 (dpi)에 재조합 CHIK VLP의 배큘로 바이러스에 감염된 인 Sf9 문화의 ~ 80 %의 생존. 배큘로 바이러스에 감염된 세포는 모양이 크다. 형태는 직사각형에 둥근에서 변경 될 수 있습니다. 바큘로 바이러스 감염의 후기 단계에서, 세포를 용해시키기 시작했다. </li><li> 직접 현탁 배양에서 50 ML 원뿔 튜브에 넣고 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에서 세포를 스핀 다운 전송 문화. </li><li> 상층 액을 수집하고 초 원심 분리를 통해 침전하기 전에 0.22 μm의 기공 막을 통해 필터링합니다. </li></ol> VLP / SVPs 3. 침전 / 정제 <ol><li> 바이오 안전성 후드 70 % 에탄올로 25mm X 89mm 열린 정상 초원 심 분리기 튜브를 소독. 에탄올을 사용하기 전에 오프 마른 확인합니다. </li><li> 깨끗한 튜브에 뜨는 32 ml의 최대로드합니다. 25 ㎖의 최소한의 볼륨이 붕괴하고 부적절하게 작성 초원 심 분리기 튜브의 손상을 방지하는 것이 좋습니다. </li><li> 조심스럽게 상층 액 재치를 밑받침PBS의 시간 멸균 3 ㎖의 20 % 글리세롤 (v / v)로. 확인 튜브가 균형을 확인합니다. </li><li> 4 ° C에서 4 시간 동안 135,000 XG에 스핀. </li><li> 대기음 뜨는은 펠렛을 보장하는 것은 관에서 꺼 내려하지 않습니다. </li><li> 재현 탁 적극적로 pipetting 아래로 멸균 PBS로 튜브의 하단에 VLP를을 침전. PBS의 양은 VLP를가 VLP 총 단백질 수율 및 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 다릅니다 재현 탁 할 필요가 있었다. 통상적으로, 적어도 100 ㎕를 각각 VLP 펠렛을 재현 탁. </li><li> 샘플을 저장 장기 저장 단기 저장 및 -80 ° C에 보관 4 ° C. </li></ol> 4. 단백질 수율 및 특이 항원 (PSA)의 금리 결정 <ol><li> 같은 제조사의 프로토콜에 따라, BCA 분석과 같은 상업용 단백질 정량 방법을 사용하여 총 단백질 함량을 측정. </li><li> 특정 항원 함량을 평가하기 위해, 표준 항원 2-5의 희석액을 직접 도포하여 효소 면역 분석법 (ELISA)을 수행1; ELISA 96 웰 평평한 바닥 플레이트에 총 단백질 시료의 g. <ol><li> 플레이트의 항원의 존재를 조사하고 마이크로 플레이트 리더 검출 흡광도를 생성하기 위해 종래의 ELISA 개발 기판을 사용하여 항원 - 특이 적 항체에 따른다. VLP를 HA가 발현 샘플에 대한 HA 및 ELISA 분석의 대표적인 결과는 그림 2를 참조하십시오; HA와 NA의 많은 조합이 가능하지만 수익률은 HA-NA 호환성 (15)에 따라 다를 수 있습니다. 참고 : 항원 특이 항체는 변수 친 화성을 가지고 있고 항체의 엔드 포인트 희석 적정는 VLP 정량을 수행하기 전에 결정하는 것이 좋습니다. 상업적인 항체를 ELISA에 사용하기 위해 제안 된 농도 또는 희석 범위뿐만 아니라 제안 된 프로토콜을 가질 것이다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

우리는 성공적으로 SVPs 다양한 병원균에 대해 여러 구조 단백질로 구성 VLP를 표현하고 정화 위에서 설명한 기술을 사용했다. 일반적으로, 우리는 VLPs를 생성하는 포유류 발현 시스템을 사용한다. 그러나, 우리의 손에, 포유 동물 세포는 CHIK의 VLP 수익률이 낮았다 산출했다. 재조합 배큘로 바이러스 곤충 세포 시스템을 사용하는 경우 CHIK VLP의 수율은보다 강력했다. 일반적으로, 배큘로 바이러스 곤충 세포 시스템은 동안 제어하에, 또한 때문에 외래 유전자의 발현 수준에서 높은 수준의 조직 배양 플라스크 대 스피너 플라스크에서 배양 될 수있는 더 높은 세포 밀도에서 발생할 수 재조합 단백질의 더 많은 양을 수득 바큘로 바이러스 폴리 헤드린 프로모터. 16 그러나, 배큘로 바이러스를 사용하는 단점은 보조적 활성을 갖는 VLP 제제에서 배큘 매우 존재하고 백신 스큐 면역 결과 우리는 인플루엔자 V의 수율에 변화가 발견 17 연구이며사용 된 HA와 NA의 조합에 따라 LP의; H3N...

바이러스 유사 입자 (VLP를)은 인간의 예방 접종에 대한 승인 된 기술입니다. 실제로, 인간 유두종 바이러스 (HPV) 및 간염 Β 포함한 더 현대적 허가 백신의 일부 (HepΒ) 백신이 방법을 사용한다. VLP를이 자기 ​​조립이 가능한 구조 단백질로부터 형성된다. 조립 된 입자는 바이러스 모폴로지을 모방하지만, 감염 또는 바이러스 성 게놈이 부족하기 때문에 복제 할 수 없습니다. VLP를가 표현 원핵 생물과 진핵 생물 시스템의 수와 정제 할 수있다. - 28 %, 효모 - 20 %, 식물 - 9 %, 곤충 - 28 %, 그리고 포유류 - 15 % 1 박테리아 : 문헌의 검토는 서로 다른 발현 시스템은 다음과 같은 비율로 사용되는 것으로 나타났습니다. 참고로, L1 캡시드 단백질을 기반으로 HPV 백신은 효모 (가다실) 또는 곤충 전지 시스템 (서바릭스)이 생산됩니다. HepΒ 백신, 및 Recombivax Engerix-Β 또한 효모에서 생산 한 HepΒ 표면 항원 (3)로 구성되는4. 우리는 여러 조립 구조 단백질의 공동 발현을 요구하는 VLPs를 생성하는 포유 동물 및 곤충 세포 발현 시스템을 사용한다. 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 뎅기열 바이러스 (DENV), 및 chikungunya 바이러스 (CHIKV) : 우리의 작업은 인간의 병원균에 대한 설계, 생산 및 정화 VLP 기반 백신에 초점을 맞추고 있습니다. 우리의 방법은 다수의 발현 플라스미드의 다중 구조 단백질의 공동 발현 또는 단일 발현 플라스미드 (도 1)을 허용 할 정도로 유연하다. 이전에는 제조 및 정제 H5N1 VLPs를 인간 배아 신장 293T 세포 5,6-에서 인플루엔자 헤 마글 루티 닌 (HA), 뉴 라미니다 제 (NA), 매트릭스 (M1)을 코딩하는 플라스미드의 공동 발현 조립. 유전자는 포유 동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화 pTR600, transc을 개시 사이토 메갈로 바이러스의 즉시 초기 프로모터 플러스 인트론을 포함하는 진핵 세포 발현 벡터에 클로닝진핵 삽입의 ription 및 전사 (7)의 종료에 대한 소 성장 호르몬 폴리아 데 닐화 신호. HA, NA (도 1A) 및 다른 바이러스의 매트릭스 단백질, HIV 개그 P55,의 3 플라스미드의 공동 발현을 사용하여 유사한 접근 방식이 연구에서 인간 계절 인플루엔자 아형 H3N2 VLPs를 생성을 위해 사용하고, 생성하는 것으로 나타났다 인플루엔자 입자 (8)과 비슷한 크기의 VLP를. 인플루엔자 백신은 주로 항 HA 항체를 유도하지만, 인플루엔자 뉴 라미니다 제를 첨가하는 형질 세포 (9)와 같은 본 추가 면역 원성 표적에서 신진 VLP 있도록 시알 리다 아제 활성을 매개한다. RSV VLP를 생산하기 위해, 우리는 또한 이전에 기술과 전자 현미경 6,10 특징으로 추가, HIV 개그를 사용하여 VLP 형성의 유연성을 보여주기 위해 독점적 RSV 표면 당 단백질을 제시 원형 백신을 설계하는 HIV 개그의 관련이없는 코어를 선택했다. 기타이전 즉 RSV 당 단백질 뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV) (11), 및 인플루엔자 매트릭스 (12)로부터 각종 바이러스 요소를 사용하여 조립 될 수 제시 VLPs를 보여 주었다. 전체 길이 표면 당 단백질 서열은 효소 면역 분석법 (ELISA)을 통해 기능성 수용체 결합 및 항체 인식의 분석에 대한 필요가있을 수있다 천연 배좌를 유지 본 연구에 이용 하였다. 입자를 생성하는 하나의 플라스미드 발현 시스템의 사용에 대한 우리의 예는 DENV 및 CHIKV 있습니다. DENV의 경우에, 우리는 PRM / E 구조 유전자 발현 카세트 (13)를 함유 한 플라스미드를 293T 세포 없음 캡시드와 서브 바이러스 레 입자 (SVPs)를 생산할 수있다. 용어 SVP가 바이러스 구조 단백질의 조립에서 코어 또는 캡시드 단백질의 부재를 나타 내기 위해 사용된다. CHIK VLP를도 CHIKV 구조 유전자 카세트 부호화 캡시드 및 외피 단백질을 함유 한 플라스미드를 사용하여 제조 될 수 있고, 또는 I의재조합 배큘로 바이러스 곤충 세포 발현 (- C도 1b)을 위해 최적화 동일한 구조 유전자 카세트를 인코딩 감염시켜 세포 nsect. 상술 된 접근법 식의 최종 결과는 20 % 글리세롤 쿠션을 초 원심 분리를 통해 정제 할 수있는 세포 배양 배지에 VLP를 릴리스한다. 이 보고서에서 우리는 표현과 포유 동물 및 곤충 세포 시스템에서 이러한 VLP를 정화하는 방법을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>플라스미드 맥시 키트</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Life Technologies</td><td>L3000075</td><td>Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus 발현 시스템</td><td>Life Technologies</td><td>10359-016</td><td></td></tr><tr><td>Cimarec I 6 다중점 교반기 플레이트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>Polyclear 초원심분리기 튜브</td><td>Seton</td><td>7025</td><td>초원심분리기 및 버킷 크기에 적합한 튜브 확인</td></tr><tr><td>Micro BCA 단백질 분석 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>인산염 구연산염 완충액</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드&nbsp;</td><td>시그마</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>0.22 & m 진공 필터 상단 (500 ml)</td> <td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma</td><td>339741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SF-900 II SFM</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>10902-096</td><td></td></tr></tbody></table>

표현과 예방 접종에 대한 바이러스 입자의 정제

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

바이러스 유사 입자 (VLP를) 및 서브 바이러스 레 입자 (SVPs)은 살아있는 병원체의 사용을 통해 증대 바이오 안정성의 이점을 제공하는 바이러스 백신 디자인에 대한 대체 방법이다. 비 감염성 및자가 조립 VLPs를 살아있는 병원체 또는 항원 전달을위한 재조합 바이러스 벡터의 필요성을 우회 면역원으로 구조 단백질을 제공하는 데 사용된다. 이 글에서, 우리는 전임상 동물 실험에서 미래의 애플리케이션을위한 VLP 설계 및 개발의 여러 단계를 보여줍니다. 절차는 다음 단계를 포함 항원 투여에 대한 항원의 선택, 선택의 세포주, VLP를 / SVPs의 정제 항원의 발현 및 정량화. 우리는 우리의 항원의 발현 모두 포유 동물 및 곤충 세포 라인의 사용을 설명하고 방법은 수율이 다른 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 병원체의 종류에 적용 할 수있는 면역 원성 항원 STR로 대체함으로써 달성 될 수있다관심 사용자 미생물 uctural 단백질. VLP를하고 SVPs는 항원의 특성과 최고의 백신 후보의 선택에 도움이됩니다.

VLP 수익률은 바이러스 항원 구조 설계에 의한 변수했다. 이 프로토콜에서는, 우리는 초 원심 분리하여 상층 액의 SVP 또는 VLP를 생산 및 정제를위한 곤충과 포유 동물 세포의 사용을 증명하고있다. DENV PRM / E 구조 유전자 발현 카세트의 네 아형 표 1 (1-4으로 경계가) DENV SVPs의 버전을 구성하고 0.6 ml의 양으로 총 단백질 mg을 1.1-2.6의 범위를 보여주기 위해 사용되었다. HA에 대한 2 : 1 : 세 개의 유전자 구조가 필요 VLPs를 들어, 우리는 (1)의 최적화 된 DNA를 형질 전환 비율을 발견 NA : 개그 각각 인플루엔자 VLPs를 합성하는 단계; 대조적으로, 다중 chikungunya 바이러스 단백질을 발현하는 하나의 플라스미드를 재조합 배큘로 바이러스 및 포유류 CHIK VLP의 생성에 적합 하였다. 또한, 듀얼 플라스미드 형질 전환 절차는 형질 1 RSV F 및 개그와 같은 포유 동물...

여기서는 배큘로 바이러스 또는 포유류 발현 시스템, 및 초 원심 정제를 사용하여 바이러스 입자의 합성을위한 프로토콜을 제시한다. 이것은 매우 최적화 방법은 안전하고 유연하게 타겟으로 백신 바이러스 항원을 확인하는 데 사용된다.

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

이 절차의 전반적인 목표는 포유류 또는 곤충 세포 발현 시스템에 의해 발현 및 분비된 바이러스 유사 입자(virus-like particles, VLP)를 정제하는 것입니다. 이 방법은 안전하고 유연한 방식으로 구조적으로 유의미한 바이러스 항원을 발현하고 정제하는 방법과 같은 백신학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 폴리에틸렌 글리콜을 이용한 단백질 침전이나 VLP를 농축하기 위한 다중 밀도 층의 준비가 필요하지 않다는 점입니다.이 방법은 백신 표적으로서의 바이러스 항원 식별에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, VLP는 질병 진단 및 혈청학적 도구로도 활용될 수 있습니다. VLP 재현탁 단계에서 글리세롤 하층을 형성하는 과정은 초보자가 적절한 기술을 익히지 못할 수 있어 어려움이 따르므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 형질전환 당일에 제조사의 권장 사항에 따라 리포좀과 DNA 용액을 준비하십시오.HA, NA, Gag의 비율이 1:1~2가 되도록 DNA 조성을 맞추어 T150 플라스크당 총 40 µg의 DNA 양으로 세포를 형질전환합니다. 이 단계를 반복하여 총 200 mL 부피의 T150 플라스크 9개를 준비합니다. 다음으로, 각 플라스크의 총 부피가 24 mL가 되도록 항생제가 없는 무혈청 형질전환 배지에 DNA와 리포좀 용액을 희석합니다.플라스크를 인큐베이터로 되돌리고, 바이러스 유사 입자(virus-like particle, VLP)를 수확하는 날까지 세포와 트랜스펙션 배양 배지를 유지합니다. 트랜스펙션 후 72~96시간 후에 상층액을 50 milliliter 원추형 튜브로 옮겨 세포로부터 배양물을 수확합니다. 세포를 원심 분리하여 세포 잔해를 펠렛으로 가라앉힙니다.상층액을 수집하고 0.22 micron 포어 막으로 여과합니다. 이전에 준비한 spodoptera frugiperda 또는 Sf9 세포를 멀티 포인트 교반기 플레이트 시스템에서 130 rpm으로 지속적으로 교반하며 스피너 플라스크에서 부유 배양합니다. 적절한 통기를 위해 배양 부피를 스피너 플라스크 부피의 절반 이하로 유지하십시오.다음으로, 스피너 플라스크에서 2x10⁶ cells/mL 밀도로 배양된 250 mL의 Sf9 세포에 이전에 준비한 재조합 바큘로바이러스를 감염시켜 CHIK VLP를 발현시키고, 세포를 28 °C 인큐베이터로 옮깁니다. trypan blue 배제법을 사용하여 세포 생존율이 70~80%로 감소했는지 확인합니다. 확인 후, 배양액을 현탁액 상태 그대로 50 mL 원심분리관으로 옮겨 세포를 침전시킵니다. 상층액을 수집하고 침전 전 0.22 µm pour membrane으로 여과합니다.70% ethanol을 사용하여 25 mm x 89 mm 오픈 톱 초원심분리 튜브 6개를 멸균합니다. 그 다음, ethanol이 완전히 건조되었는지 확인합니다. 깨끗한 튜브에 상층액 32 mL를 넣습니다.다음으로, 3 mL의 멸균된 20% glycerol과 PBS를 상층액 아래에 조심스럽게 층을 쌓습니다. glycerol과 VLP 용액 사이의 얇은 밀도층이 파괴되지 않도록 glycerol을 천천히 넣으십시오. glycerol을 너무 빠르게 분주하면 glycerol과 VLP 용액이 섞여 VLP 침전 효율이 떨어질 수 있습니다.튜브의 균형을 맞춘 후 원심분리를 시작하십시오. 4시간 후, 원심분리기에서 튜브를 꺼냅니다. 튜브에서 펠렛이 떨어지지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거하십시오.멸균된 PBS를 사용하여 튜브 바닥에 침전된 VLP를 최소 100 µL의 용량으로 천천히 그리고 부드럽게 피펫팅하여 재현탁합니다. VLP 펠릿의 재현탁은 피펫을 이용하여 PBS를 천천히, 부드럽게 반복적으로 흡입 및 배출하며 수행해야 합니다. VLP 손실을 최소화하기 위해 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.마지막으로, 재부유시킨 VLP를 보관하십시오. 다양한 SVP 및 VLP 구조체로부터 VLP 부피와 일반적인 BCA 분석을 통한 총 단백질 수율을 얻었습니다. Sf9 세포로부터의 CHIK SVP 수율은 상층액 부피 1mL당 총 단백질 0.008에서 0.016mg 사이입니다.포유류 293 T-세포를 통한 생산은 단백질 수율이 10배 감소합니다. 본 전자현미경 이미지는 HA Gag 코어 인플루엔자 VLP가 VLP로서 성공적으로 발현, 조립 및 정제되었음을 보여줍니다. 이 절차를 시도할 때는 건강하고 생존 가능한 세포 배양물만을 형질전환 및 감염시키는 것이 중요하며, 이는 전반적인 단백질 발현 수준에 영향을 미치기 때문입니다.이 절차 이후, 총 단백질 함량, 특정 항원 함량 및 기능적 HA의 발현을 측정하기 위해 BCA, ELIZA, HA 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 초원심분리기를 사용하는 것은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 튜브의 균형 맞추기, 권장 로터 및 속도만 사용하기, 신입 실험실 인원에 대한 적절한 감독과 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

이 비디오는 포유류 시스템에서 인플루엔자 바이러스 유사 입자(VLP)의 생성을 보여줍니다. 적절한 포유류 숙주 세포에서 서로 다른 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 3개의 진핵생물 발현 벡터를 발현하면 발현된 바이러스 단백질은 숙주 원형질막에서 VLP로 자가 조립되고 세포 표면에서 발아를 통해 방출됩니다.

포유류 시스템을 통한 인플루엔자 바이러스 유사 입자 생성 기술

이 비디오는 치쿤구니야 바이러스 유전자 카세트를 운반하는 재조합 바큘로바이러스로 곤충 세포를 감염시켜 바이러스와 유사한 입자인 VLP가 어떻게 생성되는지 보여줍니다. 재조합 바이러스는 세포를 감염시켜 VLP를 형성, 조립 및 배양 배지로 방출하여 백신 생산에 잠재적으로 사용할 수 있습니다.

곤충 세포에서 Baculovirus 발현 시스템을 이용한 Chikungunya 바이러스 유사 입자 생성

과도 우세 선택 방법을 이용하여 동시에 형광 태그단백질을 발현하는 재조합 암시니아 바이러스의 생성을 위한 신속하고 모듈식 프로토콜이 여기에 설명되어 있다.

형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

여기서는 원리 증명 가의 아데노 바이러스 타입 5 (의 Ad5) 벡터를 생성하는 프로토콜을 제시의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS HVR5-6-그의 항원 캡시드 혼입 전략을 이용하여. 이 벡터는 성적 체력을 나타내는 것으로 입증되었다, 기능은 통합 항원의 Ad5 양성 시험관 내에서 혈청 및 항원뿐만 아니라 면역 원성을 탈출.

아데노 바이러스 혈청 형 5 된 벡터 백신 접근 방법의 개발을위한 항원 캡시드-설립 전략을 활용

백시 니아 바이러스 (VV)가 널리 생물 의학 연구 및 인간 건강의 개선에 이용되고있다. 이 문서에서는 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 VV 게놈을 편집 할 수있는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다.

간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

백신 개발에 사용하기 위한 자가 조립 단백질 나노입자(SAPN)의 정제, 재접이식 및 특성화를 설명하는 상세한 방법이 여기에 제공된다.

삼중 에피토프 프리젠 테이션을 필요로하는 백신을위한 대장균- 발현 자가 조립 단백질 나노 입자의 생산

여기서, 폴리(베타 아미노에스) 폴리머를 기반으로 mRNA 나노입자를 제조하기 위한 간단한 프로토콜이 제시되고, 캡슐화된 mRNA를 변경하여 맞춤화되기 쉽다. 중합체, 나노입자 및 체외 필수 특성화를 합성하기 위한 워크플로우도 설명되어 있습니다. 예방 접종에 관한 개념 증명도 추가됩니다.

mRNA로 로드된 폴리(베타 아미노에스) 나노입자의 합성 및 특성화

여기서는 항원 표시 바이러스 유사 입자(VLP)에서 중화 에피토프를 검출하는 프로토콜을 제시한다. 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-유래 VLP의 면역 침전은 단백질 G-컨쥬게이트 자기 비드에 결합된 봉투 당단백질 특이적 단일 클론 항체를 사용하여 수행된다. 포획된 VLP는 이후 바이러스 성 코어 단백질 개그 특이적 항체를 사용하는 SDS-PAGE 및 서양 블롯 분석을 받게 된다.

포획 분석기를 사용하여 바이러스와 같은 입자(VLP) 기반 백신에 표시되는 항원에서 중화에 민감한 에피토프 검출

본 프로토콜은 외막 소포의 생명공학을 생산, 정제, 생체접합 및 특성화를 포함하는 "플러그 앤 디스플레이" 백신 플랫폼으로 설명합니다.

SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인을 표시하는 외막 소포를 기반으로 하는 "플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼

배우세요 포유동물 및 곤충 세포 시스템에서 바이러스 유사 입자(VLP)를 정제하는 방법을. 초원심분리를 활용하여 백신 타겟으로서 바이러스 항원을 안전하게 식별할 수 있습니다.

표현과 예방 접종에 대한 바이러스 입자의 정제

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