Name: 한 단계의 부정적인 크로마토 그래피 정제 헬리코박터 파이로리 호중구 - 활성화 단백질 과발현 대장균 배치 모드에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 배우세요 Helicobacter pylori 중성구 활성화 단백질(HP-NAP)을 DEAE 이온 교환 수지를 이용한 부정적 배치 크로마토그래피로 한 단계에서 고순도·고수율로 정제하는 방법을. 이 기술은 백신 및 약물 개발에 활용됩니다.

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대만 국립 칭화대학교(National Tsing Hua University)의 Chao-Sheng Cheng 박사에게 원이색성 측정을 수행해 주신 것에 감사드립니다. 또한, 미국 메이요 클리닉(Mayo Clinic)의 에반티아 갈라니스(Evanthia Galanis) 박사와 이안코 D. 이안코프(Ianko D. Iankov) 박사에게 항-HP-NAP 단클론 항체를 제공해 주신 데 대해 감사드립니다. IRB 신청에 대한 조언을 제공해 주신 대만 신주 Mackay Memorial Hospital의 Han-Wen Chang 박사와 Chung-Chu Chen 박사님, 대만 신주 Mackay Memorial Hospital의 Te-Lung Tsai 씨에게 고립된 호중구 분석을 감독해 주신 분, 대만 국립 칭화 대학교의 Ju-Chen Weng 씨에게 기술 지원을 주신 데 감사드립니다. 이 연구는 대만 과학기술부(MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 및 NSC98-2311-B-007-006-MY3), 국립 칭화 대학교와 맥케이 기념 병원의 공동 연구 프로그램(100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1) 및 국립 칭화 대학교의 연구 프로그램(104N2052E1)의 보조금으로 지원되었습니다.

인간의 혈액은 국립 칭화 대학의 임상 시험 심사위원회, 신주, 대만의 사전 서면 동의 및 승인을 건강한 지원자에서 수집 하였다. E.에서 재조합 HP-NAP의 1 식 대장균 <ol><li> H.에서 HP-NAP의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 pET42a-NAP 준비 파이로리 26695 균주는 이전 16 설명했다. 설명 된 바와 같이 원하는 포인트 돌연변이 HP-NAP의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드를 준비 (프로토콜, 단계 8 참조). </li><li> E.에 상기 DNA 플라스미드 10 ng의 변형 대장균 BL21 (DE3) 42 ° C 45 초 동안 열 충격에 의해 유능한 세포, 행진 50 μg의 / ㎖ 카나마이신, 그리고 16 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어 포함 판 한천 원성 국물에 세포 (LB). </li><li> 50 μg의 / ㎖ 카나마이신과 LB 배지 5 ㎖를 포함하는 각각의 튜브에 단일 콜로니를 접종하고 3에서 precultures로 성장170 rpm으로 진탕 16 시간 동안 11 ° C를. </li><li> 1 L 플라스크를 50㎍ / ㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 배지 200 ㎖에 상기 예비 배양 세포를 2 ㎖를 접종한다. 대략적은 UV / VIS 분광 광도계에 의해 검출 0.4-0.5 도달 내지 600 nm에서의 흡광도까지 170 rpm으로 진탕하면서 2 시간 동안 37 ℃에서 접종 된 배양 플라스크를 인큐베이션. </li><li> HP-NAP의 발현을 유도하기 위하여 0.4 mM의 최종 농도로 상기 배양에 1 M 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)의 80 μL를 추가한다. 약 1.6-1.7에 도달 내지 600 nm에서의 흡광도 때까지 3 시간 동안 문화를 품어. </li><li> 원심 분리기에서 15 분 동안 4 ℃에서 6,000 XG에 세포 상층 액을 제거한다. 정화 될 때까지 -70 ℃에서 세포 펠렛을 저장합니다. </li></ol> HP-NAP를 포함하는 가용성 단백질 분획 2. 제조 참고 : 다음 단계는 모두 4 ℃에서 수행된다. <ol><li> 셀 (p)의 재현 탁 50 ㎖에서 프로토콜 단계 1.6에서 제조 ellet 20 20 mM 트리스 - 염산, pH가 9.0, 50 mM의 NaCl을 함유하는 0.13 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 0.03 mM의 N 알파 토실-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) 및 0.03 ml의 4 ° C에서 mM의 N-토실-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)는 이전과 같이 16을 설명했다. </li><li> 39 ° C에서 7 시간 15,000 20,000 PSI의 범위에서 작동되는 고압 균질화 통해 세균 현탁액을 전달하여 균체를 방해. </li><li> 원심 1 시간 동안 4 ℃에서 30,000 × g에서 파쇄를 초 원심 분리기를 사용하여 가용성 및 불용성 단백질 분획을 분리한다. 비커에 수용성 단백질 분획으로 뜨는을 전송합니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 표준으로 소 혈청 알부민 (BSA)과 상업용 키트를 사용하여 브래드 포드 (Bradford) 방법에 의해 가용성 단백질 분획의 단백질 농도를 측정한다. </li><li> 제 20 ㎖에 1 N 염산의 177.6 μl를 추가pH를 8.0으로 pH를 9.0의 pH 값을 조정 프로토콜 단계 2.3로부터 얻어지는 전자 수용성 단백질 분획. </li><li> 최종 단백질 농도가 0.5 ㎎ / ㎖가 될 수 있도록 상기 단백질 용액을 20 mM의 트리스 -HCl, pH가 8.0, 50 mM의 NaCl을 추가. </li></ol> E.에서 재조합 HP-NAP 3. 정제 DEAE 이온 교환 수지에 부정적인 모드 배치 크로마토 그래피에 의한 대장균 <ol><li> DEAE 수지 15 ml의를 준비합니다. <ol><li> DEAE 수지 중 0.6 g 건조 분말의 무게를 적어도 1 일 동안 실온에서 20 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 50 mM의 NaCl을 30 mL의에 중단. </li><li> 10,000 X에서 수지를 원심 분리기 1 분 4 ° C에서 g. </li><li> 제거하고 상층 액을 버린다. </li><li> 20 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 50 mM의 염화나트륨의 15 ML을 추가합니다. </li><li> 프로토콜 3.1.2 사 3.1.4에 번 단계를 반복합니다. </li><li> 15 ml의 후속 사용을 위해 4 ℃에서 수지 (30 ㎖ 트리스 완충액 중의 50 % 슬러리)을 정착 저장한다. 주 : 다음 단계의 모두의 4 ° C에서 수행된다. </li></ol></li><li> 수지의 15 ml의 프로토콜 단계 2.6에서 제조 된 수용성 단백질의 45 ML을 추가하고 1 시간 동안 4 ° C에서 자석 교반기와 단백질 / 수지 슬러리를 교반한다. </li><li> 스톱 콕이 장착 된 플라스틱 또는 유리 컬럼에 단백질 / 수지 슬러리를 따르십시오. 수지가 중력 정착하도록 허용합니다. </li><li> 칼럼 내의 액체 레벨이 단지 수지 위에까지 단백질 용액이 중력 흐름에 의해 열을 실행할 수 있도록하는 콕을 열고. 플로우를 통해 정제 된 HP-NAP를 포함하는 언 바운드 분수 등을 수집합니다. </li><li> 컬럼에 얼음처럼 차가운 20 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 50 mM의 NaCl을 15 ML을 추가합니다. </li><li> 칼럼 내의 액체 레벨이 아니라 수지를 초과 할 때까지 세척 완충액이 중력 흐름에 의해 열을 통해 실행할 수 있도록 스톱 콕을 열고. 플로우 스루 세척 분획으로서 수집. </li><li> 의정서는 추가 세척 분수를 수집하기 위해 3.5 네 3​​.6 번 단계를 반복합니다. </li><li> 컬럼에 얼음처럼 차가운 20 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 1 M NaCl을 15 ML을 추가합니다. </li><li> 칼럼 내의 액체 레벨이 단지 수지 위에까지 용출 완충제는 중력 유동에 의해 열을 통해 실행할 수 있도록 스톱 콕을 열고. 플로우 스루 용출 분획으로서 수집. </li><li> 프로토콜이 추가​​ 용출 분수를 수집하기 위해 3.8 네 3.9 번 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 버퍼 Exchange 및 DEAE 수지와 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피로 정제하여 HP-NAP의 독소 제거 참고 : 정제 된 HP-NAP는 E. 표현 대장균 교환 및 호중구를 자극하기 전 독소 제거 버퍼링 실시 할 필요가있다. <ol><li> 이전 24 바와 같이 14 kDa의 분자량 컷오프 투석 튜빙을 사용하여 4 ℃에서, 둘 베코 인산 완충 생리 식염수 (D-PBS), pH를 7.2로 정제 HP-NAP의 버퍼를 변경 투석을 수행한다. </li><li> syring를 통해 투석 HP-NAP 필터독소를 제거하기 위해 4 ℃에서 2.5 내지 4 ㎖ / 분 범위의 유속으로 20 ㎖의 일회용 주사기에 부착 된 양으로 하전 된 친수성 ​​막과 E 필터. </li></ol> 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE), 웨스턴 블로 팅, 기본-PAGE, 젤 여과 크로마토 그래피하고, 원 편광 이색 분광학에 의해 정제 된 재조합 HP-NAP의 분자 특성 5. 특성 <ol><li> 마우스 단일 클론 항체 단클론 항체 16F4 (25)를 포함하는 하이 브리 도마 배양 상층 액과 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로 팅에 의해 정제 된 재조합 HP-NAP 분석으로 이전 24 설명했다. </li><li> 이전 26 바와 같이 올리고머의 상태를 검사하는 네이티브-PAGE 겔 여과 크로마토 그래피에 의해 정제하여 HP-NAP 분석. </li><li> 이전 26 설명 된 바와 같이 그 차 구조를 조사하기 위해 원 편광 이색 분광기에 의해 정제 된 재조합 HP-NAP를 분석합니다. </li></ol> SDS-PAGE 젤의 실버 염색하여 HP-NAP의 순도 6. 평가 <ol><li> 실버 염색 키트 제조업체의 지시에 따라, 용액은 용액, 현상액 민감 정착 용액을 조제 액을 정지하고, 세정 용액. </li><li> 실버 염색 키트 제조업체의 지침에 따라 SDS-PAGE 젤은 염색을 수행합니다. </li><li> 촬상 시스템 겔의 화상을 취득. </li></ol> HP-NAP에 의해 유도 된 호중구에서 ROS 생산 7. 측정 <ol><li> 이전 24 바와 같은 밀도 구배 원심 분리하여 인간 덱스 트란 침강 헤파린 혈액으로부터 인간 호중구를 분리. </li><li> 호중구에서 ROS 생성의 측정은 루미놀 의존 화학 발광 분석을 사용하여 HP-NAP 자극. <ol><li> 접시 리더의 전원을 켜고 37 ° C의 온도를 설정합니다. 배치그것은 37 ° C로 예열 할 수 있도록 플레이트 리더 챔버 내부의 빈 평평한 바닥 96 웰 흰색 접시. </li><li> 유무와 0.9 mM의 CaCl2를 0.5 밀리미터의 MgCl 2, 13.3 μM 5- 아미노 -2,3- 디 히드로 -1,4- phthalazinedione (루미놀)를 포함하는 상기 D-PBS, pH를 7.2에서 부양 혼합물을 준비 프로토콜 단계 4.2에서 준비 0.67 μm의 독소를 제거 HP-NAP의. </li><li> 5 mM의 포도당을 함유하는 D-PBS, pH를 7.2에서 7.1 × 106 내지 2 세포 / ㎖, 프로토콜 단계에서 제조 된 인간 호중구의 농도를 조정한다. </li><li> 96 웰 동안 플레이트의 각 웰에 호중구 현탁액의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 웰 당 5 초 간격으로 웰에 호중구 함유 프로토콜 단계 7.2.2에서 제조 한 자극의 혼합물 150 μl를 추가한다. </li><li> 플레이트 판독기를 사용하여 한 3 시간에 걸쳐 웰 당 5 초 동안 화학 발광의 발광을 측정한다. </li></ol></li></ol> 8.중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 DNA 플라스미드 숨겨 HP-NAP 돌연변이의 건설 사이트에 직접 돌연변이 유발을 기반 참고 : &quot;침묵&quot;제한 부위가 부위 특이 적 변이 (SDM) -assist 소프트웨어 (28)에 의해 돌연변이 유발 프라이머에 도입 된 것을 제외하고 이전 27 설명 된대로 PCR 기반의 사이트에 직접 돌연변이는 기본적으로 생성되었습니다. <ol><li> PCR 반응을 수행합니다. <ol><li> 최종주는 플라스미드 pET42a-NAP 10ng의 표 1에 열거 된 돌연변이 유발 성 프라이머 쌍을 1 μM, 뉴 클레오 시드 트리 포스페이트 (dNTPs를), 및 탈 이온수를 함유하는 PCR 튜브에 고성능 PCR 효소 믹스 3 유닛 200 μM 추가 25 μL의 볼륨. </li><li> 95에서 PCR 사이클을 시작 10 분 동안 ° C가 주형 DNA를 변성하고, 1 분 동안 95 ° C에서 12 증폭 사이클에 따라, T는 1 분 C ° -5 더 m이없고, 6 분 72 입출력 C. </li><li> 하여 PCR 사이클을 완료1 분의 T m PP -5 ℃로 어닐링 단계와 30 분 동안 72 ℃에서 연장 단계. </li></ol></li><li> 2 시간 동안 37 ° C에서 DPN I 제한 효소 0.4 μL와 PCR 생성물의 15 μl를 처리 한 후 아가 로스 겔 전기 영동으로 처리 DPN I-PCR 생성물의 2 μL를 분석한다. </li><li> 화면 돌연변이. <ol><li> E.으로 PCR 생성물의 2 μL 변환 42 ° C에서 45 초 동안 열 충격에 의해 대장균 DH5α 유능한 세포. </li><li> 를 50㎍ / ㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 플레이트 상에 형질 전환 된 세포를 확산하고 16 시간 동안 37 ℃에서 플레이트 배양한다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 알칼리 용해 키트를 이용한 박테리아 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 원하는 침묵 돌연변이의 존재를 확인하기를 XhoI 제한 효소로 프로토콜 단계 8.3.3에서 격리 플라스미드 DNA를 처리한다. </li><li> 시퀀스플라스미드 DNA는 제조자의 프로토콜에 따라 HP-NAP 돌연변이 체의 코딩 서열의 보정을 확인하기 위해 T7 프로모터 프라이머 프로토콜 단계 8.3.4로 확인 하였다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

HWF와 YCY는 헬리코박터 파일로리 호중구 활성화 단백질의 원스텝 정제 방법에 대한 특허 TW I 432579 및 US 8,673,312의 발명자이다. 원고에 설명된 모든 자료는 연구 목적으로 사용할 수 있습니다. 저자는 이것이 데이터 및 자료 공유에 대한 JoVE의 모든 정책 준수를 변경하지 않음을 확인합니다.

여기서 제시 DEAE 음이온 교환 수지와 네가티브 모드 배치 크로마토 그래피 E 대장균 과발현 재조합 HP-NAP의 정제에 적합하다. 세포 용해 및 정제의 단계에서 사용 된 완충액의 pH 값은 E.에서 HP-NAP의 용해도를 보장하기 위해 매우 중요 대장균 해물 각각 숙주 세포 불순물 재조합 HP-NAP를 효율적으로 분리. 균체을 pH 9.0에 용해되어야하고, 음의 정제는 높은 수율 및 고순도 HP-NAP를 획득하여 pH 8.0에서 수행되어야한다. HP-NAP의 전형적인 복구 90 %이고, 통상 95 % 순도는 24이다. HP-NAP가 결합되지 않은 부분에 존재하기 때문에, 상기 수지의 최소하지만 충분한 양의 불순물을 흡수하고 그것의 최대 용량을 달성하기 위해 사용되어야한다. 우리의 경우에는, 최대 부하 용량 E.에서 가용성 단백질의 1.5 mg을 밀리리터 수지 당 대장균 해물. <p class="jove_content"...

헬리코박터 파이로리 (H. pylori의)는 위염 및 소화성 궤양의 주요 원인이다. 이 박테리아는 또한 암, 세계 보건기구 (WHO)의 일부 연구에 대한 국제기구에 의해 인간 발암 물질로 분류되어, 1994 년에 그것은 추정되었음을 H.의 보급 pylori 감염은 개발 도상국의 70 %와 선진국 (1) 30 ~ 40 %이다. 비록 H.의 감염률 파이로리는 산업화 된 국가에서 H.의 감염률을 감소 개발 도상국에서 파이로리는 여전히이 높다. 표준 치료는 H.을 근절하기 pylori 감염은 프로톤 펌프 억제제, PPI, 2 개의 항생제, 클라리스로 마이신 플러스 아목시실린 또는 메트로니다졸 (3)의 관리로 구성되어 있습니다. H. 항생제 내성 그러나, 상승 파이로리는 궤양 치료 O 방지하는 새로운 전략의 개발을 촉구 - 관련R 감염을 치료. H.에 대한 예방 및 / 또는 치료 백신 개발 H. 파이로리를 제어하는 대안적인 방법을 제공 할 수있다 pylori 감염. 헬리코박터 파일로리 호중구 - 활성화 단백질 (HP-NAP), H 파일로리의 주요 독성 요인은 첫째 H.의 물 추출물에서 확인되었다 내피 세포 및 활성 산소 종 (ROS) (4)를 생성하기 위해 접착 호중구 활성화하는 능력 파이로리. H.에서 발견 된 위 점막의 호중구 침윤 pylori- 활성 위염에 감염 환자는 위장의 염증과 조직 손상 될 수 있습니다. 따라서, HP-NAP는 상기 궤양 H. 발생 위장 염증을 유도 호중구 활성화에 의해 병리학적인 역할을 할 수있다 파이로리는 위 질병을 -associated. 그럼에도 불구하고, HP-NAP 임상 응용 5,6에 대한 잠재적 인 후보입니다. 때문에 면역 원성 및 면역 프로에HP-NAP의 perties이 단백질은 백신, 치료제 및 진단 도구 개발하는데 사용될 수있다. 임상 실험은 H. 대 단백질 백신의 성분의 하나로서, 재조합 HP-NAP를 사용해 수행 한 파이로리. 이 백신은 수산화 알루미늄 제형 재조합 HP-NAP, 세포 독소 - 관련 유전자 A (cagA 유전자) 및 vacuolating 세포 독소의 A (바카) 단백질로 구성되며 상기 안전하고 인체 7 원성 것으로 입증되었다. 또한, HP-NAP는 암 치료 (8)에 대한 면역 반응을 -polarized 아래로 알레르기 반응 및 기생충 감염 9,10에 의해 유발 TH2 매개 면역 반응을 조절하는 (받은 Th1) T 도우미 타입 1을 트리거 강력한 면역 조절제 역할을합니다. 진단 같이, 재조합 HP-NAP 기반 ELISA는 H.에서 HP-NAP 대해 혈청 항체를 검출하기 위해 적용되어왔다 pylori 감염 환자 11 -infected. 한 연구는 보여 주었다 H.에서 혈청에서 HP-NAP 특정 항체의 수준 평로리는 위암 환자가 만성 위염 (12)을 가진 환자에서보다 유의하게 높았다 -infected. 또 다른 연구는 또한 HP-NAP에 대한 혈청 항체가 비 문부 위암 (13)의 존재와 연관된 것으로 나타났다. 따라서, 재조합 HP-NAP 기반 ELISA는 H.에서 위암의 예후에 대한 HP-NAP에 대한 혈청 항체를 검출하기 위해 적용 할 수있다 균은 환자 -infected. 함께 찍은, 정제 된 HP-NAP는 더욱 예방, 치료에 활용하고, H.의 예후 수 파일로리 질병뿐만 아니라 암 치료 -associated. 재조합 HP-NAP의 정화에 사용하는 여러 방법 중에서 네이티브 형태의 대장균 (대장균)에서 발현 두번째 정제 단계를 포함하는 겔 여과 크로마토 그래피는 고순도 HP-NAP 14-16 얻기 위해 필요한, 지금까지보고 . 여기서, 마이너스 모드 배치 크로마토 그래피를 사용하는 방법디 에틸 아미노 에틸 (DEAE) 이온 교환 수지는 E. 과발현 HP-NAP 정화용 설명 고 수율 및 고순도 대장균. 이러한 정제 기술은 숙주 세포 단백질 및 / 또는 수지 HP-NAP 이외의 불순물의 결합에 기초한다. pH가 8.0에서 HP-NAP를 제외하고 거의 다른 단백질이 결합되지 않은 부분에서 발견된다. 네거티브 모드에서 DEAE 이온 교환 크로마토 그래피를 사용하여이 정제 방법은 간단하고 시간 미 결합 분획의 수집을 한 단계 크로마토 재조합 HP-NAP의 정화를 허용함으로써 절약된다. (17) 면역 글로불린 G (IgG의) 18, 헤모글로빈 19 단백질 포스파타제 (20) 및 독성 인자 편모 21 바이러스와 같은, 또한 음극에 이온 교환 크로마토 그래피에 의해 정제하는 것으로보고 된 예 HP-NAP 여러 다른 생체 분자 이외에 방법. 불순물이 미량 인 경우 음의 모드는 이온 교환 크로마토 그래피 바람직대상 시료에 존재하는 구성 요소 (22)를 정제 할 수있다. 천연 또는 재조합 생체 분자의 정제에 부정적인 크로마토 그래피의 응용 프로그램은 최근에 23을 검토하고있다. 본 보고서는 E.에서 재조합 HP-NAP의 발현을위한 단계 프로토콜에 의해 단계를 제공합니다 콜라이, DEAE 이온 교환 수지와 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피를 이용하여 HP-NAP의 세포 용해 및 정제. 정제 목적 단백질이 네거티브 모드에서 이온 교환 크로마토 그래피에 적합한 경우, 설명 된 프로토콜은 또한 정제 공정의 개발을위한 출발점으로 구성 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET42a-NAP&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td><td>Refernce 15&nbsp의 보충 데이터에 설명된 대로 작성된 N/A; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Inc C6000-03</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Amresco</td><td>25389-94-0</td><td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td></tr><tr><td>이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)</td><td>MD Biomedical Inc</td><td>101-367-93-1</td><td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20</td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)</td><td>시그마-알드리치</td><td>10837091001</td><td>프로테아제 억제제 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>N-알파-토실-L-리시닐-클로로메틸케톤(TLCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7254</td><td>프로테아제 억제제 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>N-토실-L-페닐알라닌-클로로메틸케톤(TPCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4376</td><td>프로테아제 억제제 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>단백질 표준(소 혈청 알부민)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5619&nbsp;</td><td>Bio-Rad 단백질 분석을 위한 표준 단백질 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>DEAE&ndash; 세파덱스 &nbsp; A-25 염화물 형태</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Spectrum/Por 투석 튜브</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132720</td>, <td>분자량 컷오프 14kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;</td></tr><tr><td>Acrodisc&reg; Mustang&reg가 있는 유닛; </td> 내독소 제거를 위한 E membrane <td>Pall</td><td>MSTG25E3</td>; Refernce 23에 기술된 바와 같이 H. pylori 균주 NCTC 11637의 정제된 HP-NAP에 대해 제기된 1 <td>내지 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td></tr><tr><td>마우스 단클론 항체 MAb 16F4</td><td>N/A</td><td>N/A</td> 범위의 유속으로 작동<td>; &nbsp; 미국 메이요 클리닉의 에반티아 갈라니스(Evanthia Galanis) 박사와 이안코 D. 이안코프(Ianko D. Iankov) 박사의 선물 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28989335</td><td>for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td></tr><tr><td>PlusOne silver staining kit,</td><td>protein GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1150-01</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1440-02</td><td>인간 호중구 정제를 위한 밀도 구배 원심분리 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002</td></tr><tr><td>평평한 바닥 96웰 흰색 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>236108</td><td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>빛으로부터 보호 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>확장하다 &nbsp; 긴 템플렛 PCR 체계</td><td>시그마-알드리</td><td>11681834001</td><td>고충실도 PCR 효소 mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Dpn I</td><td>뉴잉글랜드 Biolabs</td><td>R0176S</td><td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>뉴잉글랜드 Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoiE. 대장균 DH5&alpha;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>18265-017</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>제품 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td> &nbsp;</td></tr><tr><td>U-2800 더블 빔 UV/VIS 분광 광도계</td><td>Hitachi&nbsp;</td><td>N/A</td><td>는 시장에서 벗어나 새 모델로 업그레이드 http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C3 고압 균질화기</td><td>Avestin Inc</td><td>C315320</td><td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td></tr><tr><td>히타치 코키 히맥 CP80WX 일반 울트라 원심분리기</td><td>히타치 코키 90106401</td><td></td><td>E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html&Auml에서 가용성 및 불용성 단백질 분획의 분리</td></tr><tr><td>를 위해; KTA FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1900-26</td><td>for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td></tr><tr><td>Aviv 모델 62ADS CD 분광 광도계</td><td>Aviv Biomedical</td><td>N/A</td><td>시판 중단 및 새 모델로 업그레이드</td></tr><tr><td>http://www.avivbiomedical.com/circular.php LAS-3000 이미징 시스템</td><td>Fujifilm</td><td>N/A</td><td>단종 및 교체 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td></tr><tr><td>화학발광 검출용</td> <td>Wallac 1420(Victor2) 다중 라벨 카운터</td><td>Perkin-Elmer</td><td>1420-018</td> http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</tr></tbody></table>

한 단계의 부정적인 크로마토 그래피 정제<em&gt; 헬리코박터 파이로리</em&gt; 호중구 - 활성화 단백질 과발현<em&gt; 대장균</em&gt; 배치 모드에서

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

헬리코박터 파이로리 호중구 - 활성화 단백질 (HP-NAP)은 헬리코박터 파이로리 (H. 파이로리)의 주요 독성 요소이다. 또한 H.에 중요한 역할을 파이로리는 호중구, 단핵구 및 비만 세포를 포함한 여러 선천성 백혈구 활성화에 의해 유도 된 위장 염증. HP-NAP의 면역 원성 및 면역 속성은 H.에 대한 잠재적 인 진단 및 백신 후보 확인 유문 및 암 치료 용 신약 후보. 임상 적 용도에 사용 그래피 HP-NAP 상당량을 얻기 위해서 효율적인 방법은 높은 수율과 순도의 단백질이 확립되어야 정제한다. 이러한 프로토콜에서는, 디 에틸 아미노 에틸 (DEAE) 이온 교환 수지를 이용하여 대장균 (E. 콜라이)에서 과발현 재조합 HP-NAP의 일 단계 제외 크로마토 그래피 정제 방법을 기술 하였다 (예., 세파 덱스)를 난n 개의 배치 모드. 재조합 HP-NAP는 E. 총 단백질의 약 70 %를 구성한다 대장균과 거의 완전히 pH를 9.0에서 세포 용해시의 가용성 분획에서 회수된다. pH가 8.0에서 최적의 조건에서, HP-NAP의 대부분은 언 바운드 분획에서 회수되는 반면, E.에서 내인성 단백질 대장균 효율적으로 수지에 의해 제거된다. DEAE 이온 교환 수지와 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피를 사용하여이 정제 방법은 E.에서 기능적 HP-NAP를 얻을 높은 수율 및 순도의 기본 형태로 대장균. 정제 된 HP-NAP는 더욱 예방, 치료에 활용하고, H.의 예후 수 파일로리 질병뿐만 아니라 암 치료 -associated.

재조합 HP-NAP의 부정적인 정제의 실험 절차의 개략도는 E. 표현 배치 모드에서 DEAE 이온 교환 수지를 사용하여 대장균은도 1에 도시된다. 이러한 정제 기술은 숙주 세포 단백질 및 / 또는 수지 HP-NAP 이외의 불순물의 결합에 기초한다. pH가 8.0에서 네이티브 형태의 HP-NAP를 제외하고 거의 다른 단백질이 결합되지 않은 부분 (그림 2A와 B)에서 발견된다. 언 바운드 분획 정제 된 HP-NAP는 HP-NAP (그림 2C)에 대한 항체 immunodetected하고, 실버 염색 (그림 2D)에 의해 확인 된 순도 높은 97 % 이상이었다. 네이티브-PAGE (도 2B) 및 겔 여과 크로마토 그래피 (도 3a)에...

재조합 헬리코박터의 원스텝 제외 정제 고 수율 방법에 대하여 설명한다 배치 모드에서 디 에틸 아미노 에틸 수지를 이용하여 대장균에서 과발현 호중구 - 활성화 단백질 (HP-NAP) 파이로리. 이 방법에 의해 정제 HP-NAP는 H. 백신, 약물, 또는 진단의 발전을 위해 도움이됩니다 파이로리는 질병을 -associated.

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

본 정제의 전반적인 목표는 di-ethyl amino-ethyl 이온 교환 수지를 이용한 음성 모드 배치 크로마토그래피를 통해, 기능적인 Helicobacter pylori Neutrophil-activating protein(HP-NAP)을 고순도 및 고수율의 천연 상태로 얻는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 HP-NAP를 단 한 단계만으로 고순도 및 고수율의 천연 상태로 정제할 수 있다는 점입니다. HP-NAP의 음성 정제는 박테리아 용해물로부터 얻은 가용성 단백질 분획을 DEAE 수지에 첨가하는 배치 결합 과정으로 시작됩니다.혼합물을 배양하여 전체 단백질이 레진에 결합하도록 합니다. 그런 다음 중력 흐름 원심분리를 통해 결합되지 않은 분획에 존재하는 HP-NAP를 얻습니다. 이 기술의 함의는 10:1 예방 치료와 Helicobacter pylori 관련 질환의 예후 진단 및 암 치료에 있습니다.HP-NAP의 면역원성 및 면역 조절 특성 때문입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 어려움을 겪을 수 있습니다. HP-NAP이 멸균 과정 중 쉽게 응집되기 때문입니다.이 절차의 시연은 저희 실험실의 대학원생인 Zhi-Wei Hong이 진행하겠습니다. 4 °C에서, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 준비한 50 mL의 세포 펠릿을 프로테아제 억제제 혼합물이 포함된 pH 9.0의 저염 Tris-완충액 20 mL에 현탁합니다. 단백질 응집을 방지하기 위해 샘플을 4 °C로 유지하는 것이 매우 중요합니다.4 °C에서 15,000 ~ 20,000 PSI 범위로 작동하는 고압 균질기를 통해 박테리아 현탁액을 7회 통과시켜 박테리아 세포를 파쇄합니다. 용해물이 생성되면 즉시 원심분리해야 합니다. 균질화된 시료를 원심분리 튜브로 옮깁니다.초원심분리기를 사용하여 세포 용해물을 4°C에서 30,000 ×g로 1시간 동안 즉시 원심분리하여 수용성 단백질 분획과 불용성 단백질 분획을 분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 수용성 단백질 분획으로 비커에 옮깁니다. 제조사의 지침에 따라 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 표준물질로 사용하는 상용 키트를 이용하여 Bradford법으로 수용성 단백질 분획의 단백질 농도를 측정합니다.그 후, 수용성 단백질 분획 20 milliliters에 1N HCl 177.6 microliters를 첨가하여 pH 값을 pH 9.0에서 pH 8.0으로 조정합니다. 단백질 용액에 20 millimeter Tris-HCl (pH 8.0)과 50 milliliter sodium chloride를 첨가하여 최종 단백질 농도가 0.5 milligrams per milliliter가 되도록 합니다. 15 milliliters의 DEAE resin을 준비하려면, 0.6 grams의 DEAE resin 건조 분말을 실온의 30 milliliters Tris-HCl buffer에 넣고 최소 하루 동안 현탁시킵니다.레진을 4°C에서 10,000 ×g로 1분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하여 버립니다. 그 다음 15 mL의 Tris-HCl 완충액을 첨가합니다. 원심분리 및 재현탁 단계를 4회 더 반복한 후, 가라앉은 레진 15 mL를 4°C에서 보관하여 추후에 사용합니다.4°C에서 작업하며, 준비된 가용성 단백질 45 mL를 수지에 추가하고 마그네틱 바가 들어 있는 100 mL 비커로 옮깁니다. 4°C에서 교반기를 사용하여 단백질 수지 슬러리를 1시간 동안 교반합니다. 그다음, 단백질 수지 슬러리를 스톱콕이 장착된 플라스틱 또는 유리 컬럼에 붓고 수지가 중력에 의해 침강하도록 둡니다.단s의 액체 수위가 레진 바로 위에 올 때까지 스톱콕을 열어 단백질 용액이 중력 흐름에 의해 컬럼을 통과하도록 합니다. 정제된 neutrophil-activating protein이 포함된 비결합 분획으로서 통과액을 수집합니다. 15 milliliters의 ice-cold Tris-HCl 버퍼를 컬럼에 첨가합니다.스톱콕을 다시 열어 세척 버퍼가 중력 흐름에 의해 컬럼을 통과하여 액체 높이가 수지 바로 위까지 내려갈 때까지 흘려보냅니다. 통과액을 세척 분획으로 수집합니다. 얼음처럼 차가운 버퍼로 세척 과정을 4회 더 반복하여 추가 세척 분획을 수집합니다.그런 다음 얼음처럼 차가운 20 millimeter Tris-HCl pH 8.0, 1 molar sodium chloride 15 milliliters를 컬럼에 넣습니다. 이전과 마찬가지로 통과액을 용출 분획으로 수집합니다. 용출 단계를 4회 더 반복하여 추가 용출 분획을 수집합니다.E.coli 용해물 내 HP-NAP의 용해도에 미치는 pH의 영향이 여기에 나타나 있습니다. 이 가용성 분획에서 검출된 HP-NAP의 양은 pH 7.5에서 9.5 사이에서 현저히 증가했습니다. pH 9.0에서 세포 용해 시, 재조합 HP-NAP의 거의 대부분이 가용성 분획에서 회수되었습니다.여기에서는 배치 모드에서 DEAE 레진을 이용한 E.coli 발현 재조합 HP-NAP의 음성 정제에 pH가 미치는 영향을 보여줍니다. pH 8.0에서 용출 분획에는 아주 적은 양의 HP-NAP만이 존재했습니다. 비결합 분획에 존재하는 HP-NAP의 양은 pH 8.0에서 가장 높았습니다.E.coli로부터 불순물을 흡착하는 수지의 최대 용량을 달성하기 위해 DEAE 수지에 로딩하는 최적의 단백질 양은 수지 1 mL당 1.5 mg의 단백질입니다. pH 8.0에서 배치 모드의 DEAE 수지를 사용했을 때, 비결합 분획(unbound fraction)에서는 천연 상태의 HP-NAP 외의 단백질이 거의 회수되지 않았습니다. HP-NAP의 순도는 95% 이상이었습니다.겔 여과 크로마토그램과 원거리 UV 원편광 이색성 스펙트럼 분석 결과, 정제된 HP-NAP는 알파-헬릭스 이차 구조를 가진 멀티머로 접힘이 확인되었습니다. 루미널 의존성 화학발광 분석을 통해 정제된 HP-NAP가 호중구에 의한 활성 산소종 생성을 유도할 수 있음을 확인하였습니다. 이 기술들을 숙달하면 적절히 수행했을 때 5시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 귀하는 DEAE 및 교환 수지를 이용한 음성 모드 배치 크로마토그래피를 통해 고수율 및 고순도로 천연 상태의 기능적 HP-NAP를 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 배치 크로마토그래피의 멸균 단계에서 적절한 pH의 버퍼를 사용하는 것이 중요함을 기억하십시오. 저희는 천연 상태의 HP-NAP를 정제하기 위해 여과 대신 다른 크로마토그래피 접근법을 적용하려 했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.이 방법은 E.coli에서 발현된 재조합 HP-NAP를 통해 작용하도록 설계되었으나, per-sida sep-tidas와 같은 다른 박테리아 발현 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 측정법의 시각적 시연은 빠르게 진행됩니다.또한 멸균 및 배치 크로마토그래피 단계는 학습하기가 어렵습니다. 이 단계들은 시간 지체 없이 4 °C에서 수행되어야 하기 때문입니다. 정제를 위해 설계된 단백질이 음전하 모드의 이온 교환 크로마토그래피에 적합하다면, 이 절차는 정제 공정 개발의 시작점으로 응용될 수 있습니다.이 기술의 개발 이후, 임상 연구 분야의 연구자들은 암 치료뿐만 아니라 Helicobacter pylori 관련 질환의 백신, 약물 및 진단법 개발에 HP-NAP를 활용할 수 있는 가능성을 탐색할 수 있게 되었습니다.

one-step-negative-chromatographic-purification-helicobacter-pylori

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를...

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

출처: Kuo, T., et al. 배치 모드에서 대장균에서 과발현된 헬리코박터 파일로리 호중구 활성화 단백질의 1단계 음성 크로마토그래피 정제. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 박테리아 용해물에서 독성 관련 단백질을 정제하는 음성 크로마토그래피 기술을 보여줍니다. 완충 용액에 양전하를 띤 수지를 사용함으로써 숙주 세포 단백질은 선택적으로 유지되는 반면, 중성에 가까운 표적 단백질은 결합되지 않은 상태로 유지되어 플로우 스루에 수집됩니다. 이 방법을 사용하면 다운스트림 응용 분야를 위한 표적 단백질을 효율적으로 분리하고 회수할 수 있습니다.

음의 이온 교환 크로마토그래피에 의한 박테리아 단백질의 선택적 정제

출처: Becker, B. 외 효모에서 리신 독소 A 사슬(RTA) 수송에 필요한 세포 구성 요소를 규명하기 위한 간단한 형광 기반 리포터 검사법. J. Vis. 경험 (2017).이 영상은 니켈 기반 친화성 크로마토그래피를 이용해 폴리히스티딘 표지된 재조합 단백질을 정제하는 과정을 보여줍니다. 이 연구는 초음파 검사를 통한 박테리아 용해, 용해액의 정화 및 여과, 그리고 이미다졸을 이용한 표적 단백질의 선택적 결합 및 용출 등 주요 단계를 설명합니다.

 재조합 박테리아 단백질 정제를 위한 친화 크로마토그래피 기법

이 비디오는 친화성 액체 크로마토그래피를 사용하여 히스티딘 태그가 지정된 자체 조립 단백질 나노 입자 또는 SAPN의 정제를 보여줍니다. 그 결과 정제된 SAPN 분획은 백신 개발에 적합하며 잠재적인 면역 치료 응용 분야에 대한 가능성을 가지고 있습니다.

Affinity Chromatography를 사용한 자체 조립 단백질 나노 입자의 정제

엘라스틴 같은 폴리펩티드는 재조합 단백질 정제의 약물 전달에 이르기까지 다양한 응용 프로그램과 자극 - 반응 생물 고분자 물질이다. 이 프로토콜은 크로마토 그래피를 간단한 대안으로 그들의 낮은 임계 용액 온도 상전이 거동을 이용하여 대장균에서 엘라스틴 같은 폴리펩티드 및 그 펩티드 또는 단백질 융합체의 정제 및 특성을 설명한다.

에서 펩타이드 및 단백질과 재조합 엘라스틴 같은 폴리 펩타이드 및 그 융해의 비 크로마토 그래피 정제<em&gt; 대장균</em

여기, 히스티딘 태그 pyrophosphokinase 효소 정화 및 radiolabelled 기질 그리고 효소 활동 체 외에 대 한 분석 결과를 제품의 얇은 층 크로마토그래피를 이용 하는 방법을 설명 합니다. 효소 활동 분석 결과 모든 키, 뉴클레오티드 있고, 또는 인광 체 전송 반응의 메커니즘 포함 뉴클레오티드 3 인산 염 가수분해에 광범위 하 게 적용 됩니다.

정화 및 체 외에서 활동 분석 결과 (p) ppGpp Clostridium 남과 어울리지 않 는에서 합성에 대 한

백신 개발에 사용하기 위한 자가 조립 단백질 나노입자(SAPN)의 정제, 재접이식 및 특성화를 설명하는 상세한 방법이 여기에 제공된다.

삼중 에피토프 프리젠 테이션을 필요로하는 백신을위한 대장균- 발현 자가 조립 단백질 나노 입자의 생산

다중 컬럼 플레이트 어댑터를 사용하면 크롬노그래피 컬럼을 병렬 친화성 또는 이온 교환 정제를 위한 다중 웰 컬렉션 플레이트와 인터페이스하여 경제적인 높은 처리량 단백질 정제 방법을 제공합니다. 그것은 중력 또는 진공 산출 밀리 그램 양의 단백질을 통해 저렴 한 계측을 통해 사용할 수 있습니다.

다중 컬럼 플레이트 어댑터를 사용하는 경제적이고 다재다능한 고처리량 단백질 정화 시스템

본 연구에서는 헬리코박터 파일로리균에 감염된 대변 항원을 신속하게 검출할 수 있도록 이중 항체를 기반으로 한 샌드위치 검출 기법을 개발하였다.

Double Antibody Sandwich Detection 기술을 기반으로 Helicobacter pylori 감염의 대변 항원을 신속하게 검출

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대장균에서 독성 뉴클레아제를 과발현 및 정제

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유기 용매 기반 추출 및 침전법을 이용한 대 장균 에서 엘라스틴 유사 폴리펩타이드(ELP)의 효율적 정제

배우세요 Helicobacter pylori 중성구 활성화 단백질(HP-NAP)을 DEAE 이온 교환 수지를 이용한 부정적 배치 크로마토그래피로 한 단계에서 고순도·고수율로 정제하는 방법을. 이 기술은 백신 및 약물 개발에 활용됩니다.

한 단계의 부정적인 크로마토 그래피 정제

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