한 단계의 부정적인 크로마토 그래피 정제

본 정제의 전반적인 목표는 di-ethyl amino-ethyl 이온 교환 수지를 이용한 음성 모드 배치 크로마토그래피를 통해, 기능적인 Helicobacter pylori Neutrophil-activating protein(HP-NAP)을 고순도 및 고수율의 천연 상태로 얻는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 HP-NAP를 단 한 단계만으로 고순도 및 고수율의 천연 상태로 정제할 수 있다는 점입니다. HP-NAP의 음성 정제는 박테리아 용해물로부터 얻은 가용성 단백질 분획을 DEAE 수지에 첨가하는 배치 결합 과정으로 시작됩니다.

혼합물을 배양하여 전체 단백질이 레진에 결합하도록 합니다. 그런 다음 중력 흐름 원심분리를 통해 결합되지 않은 분획에 존재하는 HP-NAP를 얻습니다. 이 기술의 함의는 10:1 예방 치료와 Helicobacter pylori 관련 질환의 예후 진단 및 암 치료에 있습니다.

HP-NAP의 면역원성 및 면역 조절 특성 때문입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 어려움을 겪을 수 있습니다. HP-NAP이 멸균 과정 중 쉽게 응집되기 때문입니다.

이 절차의 시연은 저희 실험실의 대학원생인 Zhi-Wei Hong이 진행하겠습니다. 4 °C에서, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 준비한 50 mL의 세포 펠릿을 프로테아제 억제제 혼합물이 포함된 pH 9.0의 저염 Tris-완충액 20 mL에 현탁합니다. 단백질 응집을 방지하기 위해 샘플을 4 °C로 유지하는 것이 매우 중요합니다.

4 °C에서 15,000 ~ 20,000 PSI 범위로 작동하는 고압 균질기를 통해 박테리아 현탁액을 7회 통과시켜 박테리아 세포를 파쇄합니다. 용해물이 생성되면 즉시 원심분리해야 합니다. 균질화된 시료를 원심분리 튜브로 옮깁니다.

초원심분리기를 사용하여 세포 용해물을 4°C에서 30,000 ×g로 1시간 동안 즉시 원심분리하여 수용성 단백질 분획과 불용성 단백질 분획을 분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 수용성 단백질 분획으로 비커에 옮깁니다. 제조사의 지침에 따라 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 표준물질로 사용하는 상용 키트를 이용하여 Bradford법으로 수용성 단백질 분획의 단백질 농도를 측정합니다.

그 후, 수용성 단백질 분획 20 milliliters에 1N HCl 177.6 microliters를 첨가하여 pH 값을 pH 9.0에서 pH 8.0으로 조정합니다. 단백질 용액에 20 millimeter Tris-HCl (pH 8.0)과 50 milliliter sodium chloride를 첨가하여 최종 단백질 농도가 0.5 milligrams per milliliter가 되도록 합니다. 15 milliliters의 DEAE resin을 준비하려면, 0.6 grams의 DEAE resin 건조 분말을 실온의 30 milliliters Tris-HCl buffer에 넣고 최소 하루 동안 현탁시킵니다.

레진을 4°C에서 10,000 ×g로 1분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하여 버립니다. 그 다음 15 mL의 Tris-HCl 완충액을 첨가합니다. 원심분리 및 재현탁 단계를 4회 더 반복한 후, 가라앉은 레진 15 mL를 4°C에서 보관하여 추후에 사용합니다.

4°C에서 작업하며, 준비된 가용성 단백질 45 mL를 수지에 추가하고 마그네틱 바가 들어 있는 100 mL 비커로 옮깁니다. 4°C에서 교반기를 사용하여 단백질 수지 슬러리를 1시간 동안 교반합니다. 그다음, 단백질 수지 슬러리를 스톱콕이 장착된 플라스틱 또는 유리 컬럼에 붓고 수지가 중력에 의해 침강하도록 둡니다.

단s의 액체 수위가 레진 바로 위에 올 때까지 스톱콕을 열어 단백질 용액이 중력 흐름에 의해 컬럼을 통과하도록 합니다. 정제된 neutrophil-activating protein이 포함된 비결합 분획으로서 통과액을 수집합니다. 15 milliliters의 ice-cold Tris-HCl 버퍼를 컬럼에 첨가합니다.

스톱콕을 다시 열어 세척 버퍼가 중력 흐름에 의해 컬럼을 통과하여 액체 높이가 수지 바로 위까지 내려갈 때까지 흘려보냅니다. 통과액을 세척 분획으로 수집합니다. 얼음처럼 차가운 버퍼로 세척 과정을 4회 더 반복하여 추가 세척 분획을 수집합니다.

그런 다음 얼음처럼 차가운 20 millimeter Tris-HCl pH 8.0, 1 molar sodium chloride 15 milliliters를 컬럼에 넣습니다. 이전과 마찬가지로 통과액을 용출 분획으로 수집합니다. 용출 단계를 4회 더 반복하여 추가 용출 분획을 수집합니다.

E.coli 용해물 내 HP-NAP의 용해도에 미치는 pH의 영향이 여기에 나타나 있습니다. 이 가용성 분획에서 검출된 HP-NAP의 양은 pH 7.5에서 9.5 사이에서 현저히 증가했습니다. pH 9.0에서 세포 용해 시, 재조합 HP-NAP의 거의 대부분이 가용성 분획에서 회수되었습니다.

여기에서는 배치 모드에서 DEAE 레진을 이용한 E.coli 발현 재조합 HP-NAP의 음성 정제에 pH가 미치는 영향을 보여줍니다. pH 8.0에서 용출 분획에는 아주 적은 양의 HP-NAP만이 존재했습니다. 비결합 분획에 존재하는 HP-NAP의 양은 pH 8.0에서 가장 높았습니다.

E.coli로부터 불순물을 흡착하는 수지의 최대 용량을 달성하기 위해 DEAE 수지에 로딩하는 최적의 단백질 양은 수지 1 mL당 1.5 mg의 단백질입니다. pH 8.0에서 배치 모드의 DEAE 수지를 사용했을 때, 비결합 분획(unbound fraction)에서는 천연 상태의 HP-NAP 외의 단백질이 거의 회수되지 않았습니다. HP-NAP의 순도는 95% 이상이었습니다.

겔 여과 크로마토그램과 원거리 UV 원편광 이색성 스펙트럼 분석 결과, 정제된 HP-NAP는 알파-헬릭스 이차 구조를 가진 멀티머로 접힘이 확인되었습니다. 루미널 의존성 화학발광 분석을 통해 정제된 HP-NAP가 호중구에 의한 활성 산소종 생성을 유도할 수 있음을 확인하였습니다. 이 기술들을 숙달하면 적절히 수행했을 때 5시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 귀하는 DEAE 및 교환 수지를 이용한 음성 모드 배치 크로마토그래피를 통해 고수율 및 고순도로 천연 상태의 기능적 HP-NAP를 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 배치 크로마토그래피의 멸균 단계에서 적절한 pH의 버퍼를 사용하는 것이 중요함을 기억하십시오. 저희는 천연 상태의 HP-NAP를 정제하기 위해 여과 대신 다른 크로마토그래피 접근법을 적용하려 했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.

이 방법은 E.coli에서 발현된 재조합 HP-NAP를 통해 작용하도록 설계되었으나, per-sida sep-tidas와 같은 다른 박테리아 발현 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 측정법의 시각적 시연은 빠르게 진행됩니다.

또한 멸균 및 배치 크로마토그래피 단계는 학습하기가 어렵습니다. 이 단계들은 시간 지체 없이 4 °C에서 수행되어야 하기 때문입니다. 정제를 위해 설계된 단백질이 음전하 모드의 이온 교환 크로마토그래피에 적합하다면, 이 절차는 정제 공정 개발의 시작점으로 응용될 수 있습니다.

이 기술의 개발 이후, 임상 연구 분야의 연구자들은 암 치료뿐만 아니라 Helicobacter pylori 관련 질환의 백신, 약물 및 진단법 개발에 HP-NAP를 활용할 수 있는 가능성을 탐색할 수 있게 되었습니다.