Name: RNA 정제는 세포 내에서 재배 리스테리아 식세포 세포에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 학습하세요 대식세포 내 Listeria monocytogenes에서 세균 RNA를 분리하는 방법을. 이 기술은 숙주 핵산 오염을 최소화하면서 세균 RNA를 풍부하게 얻어 감염 중 유전자 발현 연구에 활용됩니다.

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Herskovits 실험실의 연구는 335400 ERC 및 R01A/109048 NIH 보조금으로 지원됩니다.

주 : 전체 실험 동안, 대식 세포는 5 % CO 2 강제 공기 인큐베이터에서 37 ℃에서 인큐베이션 단지 클래스 II 생물학적 안전 캐비넷에서 수행되는 실험 조작을위한 인큐베이터 취출. L. 작업 모노 사이토 박테리아는 생물 안전 수준이 규정에 따라입니다. 1. 셀 준비 및 세균 감염 (주 1, 2) <ol><li> 1 일 <ol><li> 30 ml의 BMDM + 펜 연쇄상 구균 미디어 (표 2)에서 145mm 접시에 씨앗 2.0 × 10 (7) 골수 유래 대 식세포 세포 (BMDM). 각 균주에 대한 종자 3 판을 분석한다. 5 % CO 2 강제 공기 인큐베이터에서 37 ℃에서 밤새 인큐베이션. </li><li> 야생형 (WT) L.의 하룻밤 세균 배양을 시작합니다 표준 인큐베이터에서 30 ° C에서 뇌 심장 주입 (BHI) 배지 10ml에 변형 10403S 모노 사이토 겐. 지역 문화 튜브는 흔들림없이 경사. 노트:이러한 성장 조건은 효율적인 감염을 촉진 편모 유전자의 발현을 상향 조절한다. </li></ol></li><li> 2 일 <ol><li> 37 ° C에서 사전 따뜻한 BMDM의 (펜 연쇄상 구균의 항생제없이) 매체 (표 2)와 인산염 완충 생리 식염수 (PBS). </li><li> 항생제를 제거하기 위해 미리 예열 PBS의 25 ㎖로 두 번 대식 세포 단층을 씻으십시오. 30 ml의 신선한 BMDM 매체를 추가합니다. </li><li> 1 분&gt; 14,000 XG에 박테리아를 원심 분리 상층 액을 폐기하고, 피펫 팅에 의해 PBS 1.5 ㎖에 부드럽게 박테리아를 재현 탁하여 PBS에 밤새 박테리아 문화의 1.5 ml를 씻으십시오. 두 번 반복합니다. </li><li> 야생형 L.의 세척 하룻밤 문화의 0.5 ml의 각 식세포 판을 감염 모노 사이토. 여러 판을 사용하는 경우, 따로 따로 각 플레이트 15 분을 감염. 이 시간 간격은 감염​​의 끝에 개별적 플레이트를 수확있게된다. 참고 : 감염 다중도 (MOI)가 직렬 희석 도금에 의해 분석된다세균 배양의 37 ° C에서 플레이트의 24 시간 배양 후 BHI 한천 플레이트와 계산 집락 형성 단위 (CFU)의 감염에 사용됩니다. WT L. 0.5ml를 사용 모노 사이토는 ~ 100 MOI에서 10403S 결과 (대식 세포 당 100 세균 CFU)을 변형. 세포 성장 결함 세균의 돌연변이를 분석 할 때, 높은 MOI 고려되어야한다. </li><li> 37 ° C에서 0.5 시간 배양 후, 부착 균을 제거하고, PBS로 두 번 감염된 세포를 씻어, 30 ml의 미리 예열 BMDM 매체를 추가 할 수 있습니다. 첨부 박테리아는 다음 0.5 시간 동안 내면화한다. </li><li> 세포 외 박테리아를 죽일 : (50 μg / ML의 최종 농도에 도달하는 1000 1) 1 시간 후 감염에서, 겐타 마이신의 30 μl를 추가합니다. </li><li> 진공 배출구가있는 플라스크에 수집 액체 필터 헤드를 배치하여 필터 장치를 조립한다. 이어서 실린더 깔때기 다음 필터 헤드에 필터 (0.45 μm의)를 배치하고, 금속 코팅과 다른 부분을 확보램프. 얼음처럼 차가운의 RNase없는 물을 준비합니다. </li><li> 다음과 같이 감염된 세포에서 6 시간 후 감염, 수확 박테리아에서. 개별적으로 각각의 판을 취급합니다. 참고 : 일반적으로, L.를 모노 사이토는 대식 세포에서 감염 6 시간 동안 성장의 한 로그를 완료합니다. 짧은 배양 기간이 상당히 낮은 세균 부하를 초래할 수있는 동안 더 배양은 세균 증식 및 대 식세포의 세포 사망을 초래할 수 있습니다. MOI 및 감염 시간은 최적의 조건에 도달하기 위해 수정 될 수있다. <ol><li> 한 번 PBS에 감염된 세포를 씻으십시오. 대식 세포 용균 할 빙냉의 RNase가없는 물 20 ㎖를 추가한다. 셀 스크레이퍼를 사용하여, 신속하지만 신중 판 떨어져 세포를 긁어. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 용해 세포를 수집합니다. 30 초 동안 소용돌이. 4 ℃에서 3 분 800 XG에 원심 분리기. </li><li> 진공 시스템을 이용한 필터 장치를 통해 상청액을 통과한다. CONI ml의 필터를 출시하고 신속하게 (15)로 전송, 핀셋을 사용하여칼 튜브. 액체 질소의 필터 튜브를 스냅 동결. </li><li> 1.2.7에 설명 된 것처럼, 다음 샘플을 위해 새로운 필터로 여과 장치를 조립한다. </li><li> 다음날 -80 ° C에서 냉동 필터를 저장합니다. 대안 적으로, 핵산 추출 진행할. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 핵산 추출 (3 일) 참고 : 흄 후드에서 페놀과 클로로포름 솔루션으로 모든 조작을 수행합니다. <ol><li> 1 산성화 페놀의 혼합 : 클로로포름, 각 시료 400 ㎕의 1을 준비합니다. 별도의 튜브에 혼합 한 후 흡인에 의해 생성 된 수성 층을 철회. 10 % SDS 40 μl를 추가합니다. </li><li> 감기를 유지하기 위해 얼음에 필터 함유 튜브를 해동. 각 필터 함유 튜브에 아세테이트 - EDTA (AE) 버퍼 (표 2)의 650 μl를 추가합니다. </li><li> 가능한 빨리 다음 단계를 수행한다. <ol><li> 이렇게 적극적으로 필터를 포함하는 튜브를 와동상기 필터는 상기 튜브의 외주에 턴다 버퍼 완전 필터를 세척있다. 항상 얼음에 다시 배치하여 튜브 감기를 유지합니다. 참고 : 완전히 필터 떨어져 박테리아를 씻어 반전하면서 추가로 튜브를 와동하는 것이 필요할 수있다. </li><li> 모든 튜브에 대해 반복합니다. 이는 스핀 다운하는 짧게 현탁액 (120 XG에서 1 분) 프로세스의 마지막에 유용 할 수있다. </li></ol></li><li> SDS 및 (2.1 제조) 페놀 / 클로로포름 혼합물을 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 박테리아 - 함유 버퍼를 옮긴다. 모든 튜브에 대해 반복합니다. 이 필터에서 잔류 버퍼를 얻기 위해 다시 필터를 포함하는 튜브 (120 XG에 1 분) 회전 할 필요가있다. </li><li> 10 분 동안 전속력으로 모든 1.5 ml의 다중 튜브 소용돌이 장치의 튜브 및 소용돌이를 놓습니다. </li><li> 10 분 동안 65 ℃로 가열 블록에서 튜브 부화. 5 분 동안 최대 속도 (&gt; 14,000 XG)에서 원심 분리기. </li><li> 각 t로부터 수층 (약 400 μL)을 전송3M 아세트산 나트륨 (pH5.2) 및 1.0 ml의 100 % 에탄올 40 ㎕를 함유하는 1.5 ml의 새로운 튜브 우베. 철저하게 각 튜브를 소용돌이. 참고 글리코겐 침전 된 펠렛의 시각화를 향상시키기 위해이 단계에서 첨가 될 수있다. </li><li> 1 시간 동안 -80 ° C에서 샘플을 인큐베이션. 또한, C 하룻밤 -20 °에서 샘플을 품어. 그런 다음, 최대 속도 (&gt; 14,000 XG)에서 20 분 동안 4 ° C에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 각 튜브에서 에탄올 (상위 계층)을 대기음. 철저하게 각 샘플 및 와동 500 μL 차가운 70 % 에탄올을 추가합니다. 최대 속도 (&gt; 1 4,000 XG)에서 20 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 각 튜브에서 에탄올을 대기음. 전혀 열을 진공 증발기를 이용하여 약 2 분 동안 샘플을 건조. 샘플을 지나치게 건조하지 마십시오. </li><li> 각 샘플 25 μL의 RNA 분해 효소가없는 물을 추가합니다. 실온에서 20 분 동안 인큐베이션. 조심스럽게 소용돌이와 스핀 다운. </li><li> t에서 RNA의 농도를 측정microvolume UV - 마주 분광 광도계를 사용하여 그 샘플. 접시 당 핵산의 1 μg의 - 약 0.5를 추출 할 전망이다. 참고 기술 복제는이 단계에서 결합 될 수있다. </li></ol> 3. DNase의 치료 <ol><li> 의 microfuge 튜브 표 1에 따라 반응을 설정합니다. 45 분 동안 37 ° C에서 품어. 450 μL의 RNase없는 물과 최대 속도 (&gt; 14,000 XG)에서 2 분 동안 원심 분리하여 페놀 - 클로로포름-IAA 믹스 (표 2), 별도의 단계 500 μl를 추가합니다. </li><li> 새로운 튜브로 수층을 전송 및 최대 속도 (&gt; 14,000 XG)에서 2 분간 원심 분리하여 500 ㎕의 클로로포름을 IAA 혼합물 (표 2), 와류 분리 단계를 추가한다. </li><li> 새로운 튜브로 수층을 전송 및 에탄올 1 ㎖ 3 M 아세트산 나트륨 (PH 5.2)의 50 μL를 추가한다. 와동. 참고 글리코겐 침전 된 펠렛의 시각화를 향상시키기 위해이 단계에서 첨가 될 수있다. </li><l난&gt; -80 ° C에서 1 시간 동안 품어. 또한, C 하룻밤 -20 °에서 샘플을 품어. 최대 속도로 20 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 각 튜브에서 에탄올을 대기음. 철저하게 각 샘플 및 와동 500 μL 차가운 70 % 에탄올을 추가합니다. 최대 속도에서 20 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기. 조심스럽게 각 튜브에서 에탄올을 대기음. </li><li> 전혀 열을 진공 증발기를 이용하여 약 2 분 동안 샘플을 건조. 샘플을 지나치게 건조하지 마십시오. </li><li> 실내 온도, 소용돌이, 스핀 다운에서 2 분 동안 품어의 RNA 분해 효소가없는 물을 12 μl를 추가합니다. 샘플은, 정제 된 RNA를 포함 얼음에 보관하십시오. 대안 적으로, RNA에 용해 된 RNase가없는 H 2 O를 0.1 mM의 EDTA 또는 TE 완충액 (10 mM 트리스, 1 mM의 EDTA)와. </li><li> microvolume UV - 마주 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정한다. (기술 복제가 결합 된 경우) 샘플 당 RNA의 ~ 100 NG를 기대합니다. 참고 : RNA 추출이 프로토콜에 따른 FO 적합여러 기술에 의해 R 유전자 전사 분석. 우리는 일반적으로 L.을 연구하는 RT-qPCR에 분석을 사용 식세포 1-4 감염시 유전자 전사 모노 사이토 겐. </li></ol>

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여기에 설명 된 프로토콜은 L.에서 세균 RNA의 분리를위한 최적의 방법을 나타냅니다 대식 세포에서 세포 내 성장 세균 모노 사이토 겐. 이 프로토콜은 세포 용해 차분에 기초하여 세균 RNA의 농축을위한 두 가지 주요 단계를 포함한다 : 원심 분리 및 여과에 의해 박테리아의 신속한 수집을 사용하여 대 식세포 핵 침강. 이 단계는 표준 RNA 추출 과정 뒤 따른다. 이 프로토콜은 listerial RNA의 정제를 설명하지만, 쉽게 다른 세균성 병원체에 변형 될 수있다. 이 방법은 전사 분석을 위해 RNA 정제에 초점을 맞추고 있지만, 호스트로부터 세포 내에서 성장하는 박테리아를 분리하는데 사용되는 원칙은 등 DNA, 단백질, 세포 벽 같은 유전체와 같은 다른 박테리아 성분의 정제에 적용 할 수있다 생화학 적 분석은 세포 내 병원체에 대한 이해 및 특성화를 제공 할감염의 과정 동안 라이프 사이클. 총 세균 RNA의 ~ 100 NG의...

세포 내 세균 병원체 ─ 전염병 성장과 인간의 호스트의 내부 세포를 재생할 수있는 원인이 박테리아는 ─ 전세계 주요 건강 문제 5입니다. 침입 포유 동물 세포 내에서 복제하는 세포 내 병원체는 병원성 정교한 메커니즘 요인을 취득했다. 이러한 메커니즘은 질병을 일으킬 수있는 능력에 기초하지만, 우리는 그들의 규제와 역학에 대해 조금 알고있다. 액체 배지에서 자란 균의 유전자 발현 프로파일을 숙주 세포 내에서 실제 환경을 반영하지 않기 때문에, 이들의 세포 내 틈새에서 자란 균 사체 분석에 대한 필요가 커지고있다. 이러한 분석은 호스트에 의해 트리거 특정 세균 적응의 해독을 가능하게 할 것이다 및 치료 설계를위한 새로운 목표를 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 포유 동물의 RNA가에 의한 세균의 RNA를 능가하기 때문에 세포 내 성장 세균의 사체 분석은 매우 도전최소 10 배. 이 논문에서 우리는 쥐의 대 식세포의 세포 안에 성장 리스테리아 박테리아에서 세균의 RNA를 분리하는 실험 방법을 설명합니다. 추출 된 RNA는 세포 적응 및 RT-PCR, RNA-SEQ 마이크로 어레이 혼성화 및 다른 기반 기술로서 전사 분석의 다양한 기술에 의해 병원균의 독성 기전을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 리스테리아 모노 사이토 겐은 인간의 리스테리아 증의 원인이되는 에이전트, 주로 면역 개인, 노인과 임산부 (6)를 대상으로 임상 증상을 가진 질환이다. 이것 7 연구 호스트 병원체 상호 작용 모델로서 수십 년 동안 사용 된 포유 동물 세포의 다양한 침입 그람 양성 통성 세포 내 병원체이다. 침입하면, 그것은 t로 탈출 해야하는에서 액포 또는 (식세포의 경우) phagosome, 초기에 상주그는 복제하기 위해 세포의 세포질을 호스팅합니다. 여러 병원성 인자는 이스케이프 프로세스 주로 조공 용혈,리스 테리 오라 O (LLO) 및 포스 포 개의 추가 8을 중재하는 것으로 밝혀진 바있다. 세포질에서 박테리아 (그림 1) 세포 내에서 액틴 필라멘트에 자신을 추진 세포에 세포에서 확산 호스트 액틴의 중합 기계를 사용합니다. L.의 모든 주요 독성 요인 침략, 세포 생존과 복제에 관여하는 모노 사이토는, 마스터 독성 전사 조절에 의해 PRFA. 8-10 활성화됩니다. 지난 10 년 동안 여러 연구는 우리가 수행 등을 성공적으로 숙주 세포 2,11-15 내부 세포 내 성장 세균의 사체 분석 방법을 적용했습니다. diffe에 의한 세균의 RNA의 1) 선택적 농축 및 2) RNA 분리 : 두 가지 주요 접근 방식을 기반으로 호스트 RNA에서 세균의 RNA를 분리하는 데 사용됩니다rential 세포 용해. 첫 번째 방법은 (시판 키트를 사용하여 예를 들어) 포유 동물의 RNA 분자에 총 RNA 추출물의 감산 하이브리드 또는 박테리아 전사 시퀀스 (SCOTS) (11)의 선택적 캡처에 의존합니다. 두 번째 방법은 균체 그대로 유지하면서 숙주 세포가 용해되어있는 박테리아 숙주 세포의 용해 차분에 의존한다. 세균 세포는 일반적으로 원심 분리에 의해, 숙주 세포 용 해물로부터 분리되고, RNA는 표준 기술을 이용하여 추출 하였다. 이 방법을 사용하는 가장 큰 문제는 그 본래의 박테리아가 숙주 세포의 핵은 또한 분리되어 함께, 따라서 RNA 제제가 여전히 포유류 RNA를 포함한다. 이러한 문제를 극복하는 한가지 방법은이 절차는 일반적으로 추출 동안 유전자 발현 프로파일의 변화의 관계를 상승 시간이 필요하지만, 차등 원심 분리를 이용하여 숙주 세포 핵에서 그대로 박테리아를 분리하는 것이다. 본 논문에서는 개선 및 신속한 바 제시셀 차동 용해 방식에 기초 cteria RNA 추출 프로토콜. 첫째, L. 대식 세포를 감염 모노 사이토 겐을 냉수로 용해된다. 다음으로, 대식 세포 핵에 대한 간단한 원심 분리하여 제거하고 그대로 박테리아가 빠르게하는 RNA에서 세균의 핵산의 뜨거운 페놀 SDS 추출을 사용하여 격리, 필터에 수집됩니다.

<table><tbody><tr><td>Listeria monocytogenes 10403S</td><td></td><td></td><td>20</td></tr><tr><td>C57B/6 암컷 마우스</td><td></td><td></td>에서 제조한 골수 유래 대식세포<td>21</td></tr><tr><td>H2O, RNAse free</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977-015</td><td>DEPC 처리수를</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>글루타민 사용 가능</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Gibco</td><td>11360-088</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-메르캅토에탄올</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>펜/스트렙</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수-PBS</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>뇌 심장 주입 (BHI)</td><td>머크밀리포어</td><td>1104930500</td><td></td></tr><tr><td>페놀 포화 pH 4.3</td><td>피셔</td><td>BP1751I-400</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>피셔</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>이소아밀 알코올</td><td>시그마-알드리치</td><td>W205702</td><td></td></tr><tr><td>아세트산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td>W302406</tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마 알드리치</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>발효</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>SDS 10 %</td> <td>시그마 알드리치</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 절대</td><td>머크 밀리 포어</td><td>1070174000</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C, 5% CO2 강제 공기 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>모델 3111</td><td></td></tr><tr><td>셀 스크래퍼</td><td>Nunc</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>Kontes 유리 홀더 45 mm 필터용</td><td>Fisher</td><td>K953755-0045</td><td></td></tr><tr><td>MF-Millipore 필터 45&nbsp; mm, 0.45&nbsp; &마이크로; m</td><td>Merck Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac 시스템</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>Model G560E</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>145 mm 세포 배양 접시</td><td>Greiner</td><td>639 160</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml 튜브, RNase-free</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>30 > C 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>65 &deg; C 열 블록</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C 테이블 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>멸균 피펫, 25 ml</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 튜브, 50 ml</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rna 정제는 세포 내에서 재배<em&gt; 리스테리아</em&gt; 식세포 세포에

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

포유류 감염 중 박테리아 병원체의 전사체 분석은 감염을 매개하는 유전자와 요인을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 그러나 감염된 세포나 조직에서 박테리아 RNA를 분리하는 것은 포유류 RNA가 대부분 감염된 세포의 용해물을 지배하기 때문에 어려운 작업입니다. 여기에서는 골수 유래 대식세포 내에서 자라는 리스테리아 모노사이토제네스 박테리아의 RNA 분리를 위한 최적화된 방법을 설명합니다. 감염 시 세포는 약하게 용해되고 빠르게 여과되어 대부분의 숙주 단백질과 RNA를 버리고 온전한 박테리아는 유지합니다. 다음으로, 고온 페놀-SDS 추출 후 DNase 처리를 사용하여 박테리아 RNA를 분리합니다. 추출된 RNA는 여러 기술에 의한 유전자 전사 분석에 적합합니다. 이 방법은 대식세포 감염 중 리스테리아 모노사이토제네스 유전자 조절에 대한 연구에서 성공적으로 채택되었습니다 1-4. 이 프로토콜은 다른 박테리아 병원체 및 세포 유형을 연구하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다.

모델 시스템은도 1에 도시 L. 감염 대 식세포를 포함 대 식세포의 세포질에서 복제 박테리아, 모노 사이토 겐. (2) 실험 방식을 나타내는 그림. 그림 3은 WT L. 동안 독성 유전자의 예 RT-qPCR에 분석의 전형적인 결과를 나타냅니다 풍부한 실험실 매체 BHI의 성장에 비해 식세포의 성장 모노 사이토 겐. 결과는 L. 두 주요 독성 인자의 전사 수준을 보여준다 모노 사이토; hly LLO 독소를 코딩하고 ACTA는 견고 식세포 감염시 유도 조립체 액틴 단백질을 코딩. <img alt="그림 1" src="/...

여기에서는 쥐 대식세포 내에서 자라는 리스테리아 모노사이토제네스 박테리아로부터 박테리아 RNA를 분리하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 다른 세포 내 병원체 및 포유류 숙주 세포와 함께 사용할 수 있습니다.

RNA 정제는 세포 내에서 재배<em&gt; 리스테리아</em&gt; 식세포 세포에

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 대식세포 내에서 세포 내 성장한 박테리아로부터 RNA를 추출하는 것입니다. 이 방법은 박테리아가 감염을 매개하기 위해 활성화하는 유전자 인자는 무엇인가와 같이 박테리아 병원성 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 숙주 핵산의 오염을 최소화하면서 박테리아 RNA를 유의미하게 농축할 수 있다는 점입니다.시연을 맡은 분은 저희 실험실의 박사 과정 학생인 Anna Pasechneck입니다. 세균 감염을 위해 세포를 준비하려면, 1일 차에 145 mm 디쉬를 사용하여 Pen/Strep이 첨가된 30 mL의 BMDM 배지에 2×10⁷개의 골수 유래 대식세포(BMDM 세포)를 분주합니다. 강제 공기 순환 인큐베이터에서 37 °C, 5% CO₂ 조건으로 하룻밤 동안 배양합니다.야생형 L.monocytogenes 세균 배양액을 10 mL의 뇌심장 침지 배지(brain heart infusion, BHI)에 접종합니다. 튜브를 인큐베이터에 기울인 상태로 넣고 30 °C에서 진탕 없이 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 항생제가 포함되지 않은 BMDM 배지와 PBS를 37 °C로 예열합니다.그 다음, 따뜻한 PBS 25 milliliters를 사용하여 대식세포 단층을 두 번 세척하여 항생제를 제거한 후, 세포에 신선한 BMDM 배지 30 milliliters를 추가합니다. 다음으로, 1.5 milliliters의 박테리아를 원심 분리하여 하룻밤 동안 배양한 L.monocytogenes 배양물을 세척합니다. 그 후, PBS 1.5 milliliters를 사용하여 펠렛을 재현탁합니다.그 다음, 세척된 박테리아 현탁액 0.5 milliliters를 사용하여 각 대식세포 플레이트에 감염시킵니다. 여러 개의 플레이트를 사용하는 경우, 감염 종료 후 각 플레이트를 개별적으로 수확할 수 있도록 감염 간격을 15분씩 둡니다. 37 degrees Celsius에서 30분 동안 배양한 후, PBS를 사용하여 감염된 세포를 두 번 세척하여 부착되지 않은 박테리아를 제거하고, 미리 데워둔 BMDM 배지 30 milliliters를 첨가합니다.박테리아가 세포 내로 진입할 수 있도록 30분 동안 배양합니다. 감염 1시간 후, 남아 있는 세포 외 박테리아를 제거하기 위해 gentamicin을 최종 농도 50 µg/mL가 되도록 첨가합니다. 진공 배출구가 있는 액체 수집 플라스크

rna-purification-from-intracellularly-grown-listeria-monocytogenes

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 문서 그대로의 고립과 정화하는 방법을...

병원체 Vacuoles의 정제에서<em&gt; Legionella</em&gt; - 감염된 Phagocytes

출처: Jung, A. L. et. al., Legionella pneumophila 외막 소포: 대식세포에 대한 전염증 가능성의 분리 및 분석. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 박테리아 복제에 미치는 영향을 조사하기 위해 Legionella pneumophila 외막 소포(OMV)로 대식세포를 전처리하는 방법을 보여줍니다. 숙주 면역 신호를 변경함으로써 OMV는 대식세포를 감염에 더 쉽게 만듭니다. 처리되지 않은 세포에 비해 처리된 세포에서 더 높은 콜로니 수는 OMV가 대식세포 내부의 L. pneumophila 복제를 촉진한다는 것을 나타냅니다.

외막 소포로 전처리된 대식세포에서 Legionella pneumophila 복제 분석

출처: 시갈, N. 외. 대식세포에서 세포 내 배양된 리스테리아 모노사이토제네스에서 RNA 정제.  J. Vis. 경험 (2016).이 영상은 감염된 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 내화된 병원성 박테리아를 분리하는 과정을 보여줍니다. 박테리아는 숙주 세포에 부착하도록 허용되고, 붙지 않은 박테리아는 씻겨 나갑니다. 내화된 후에는 내화되지 않은 박테리아를 제거하기 위해 항생제를 첨가합니다. 숙주 세포를 용해하여 원심분리한 후, 상원액을 여과하여 박테리아를 필터 페이퍼에 포집하고, 이를 급속 냉동하여 보관하여 추가 사용을 위해 사용합니다.

감염된 숙주 세포로부터 세포내 병원성 박테리아 분리

출처: 시갈, N. 외. 대식세포에서 세포 내 배양된 리스테리아 모노사이토제네스 에서 RNA 정제. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 감염된 쥐 대식세포에서 분리된 리스테리아 모노사이토제네스 에서 RNA 추출을 시연합니다. 프로토콜은 RNA를 보존하고, 페놀-클로로포름과 열을 이용해 세포를 용해하며, 원심분리로 RNA를 분리합니다. 소금과 에탄올, 그리고 냉 부양은 RNA 침전을 촉진합니다. 생성된 RNA는 숙주가 유도한 유전자 발현을 포착하여 박테리아의 병원성과 적응 전략을 드러냅니다.

감염된 쥐 대식세포에서 채취한 리스테리아 모노사이토제네스 에서 RNA 추출

이 비디오에서는 유세포 분석을 사용하여 배양된 대식세포의 in vitro 감염에 따라 세포 내 및 세포 외 병원성 박테리아인 Listeria monocytogenes를 정량화합니다.

In vitro에서 Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes의 유세포 분석

이 논문은 사용하는 마우스의 경구 감염에 대한 새로운 방법을...

경구 전송<em&gt; 리스테리아</em&gt; 오염 된 음식의 섭취를 통해 마우스의

대 식세포는 긴 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 구성 요소로 인식되고있다. 대식 세포와 미생물 사이의 상호 작용의 진화 유전 적, 생화학 적 측면에 관한 지식의 최근의 폭발은 대 식세포에 과학적인 관심을 갱신했다. 이 문서에서는 마우스 골수에서 대식 세포를 구별하는 방법을 설명합니다.

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

리스테리아 균은 자주 세포 내 기생의 연구를위한 주요 모델로 사용되는 그람 양성 세균 병원체이다. 후반 L. 이미징 소 간섭 RNA 화면의 문맥 내 감염 단계 모노 사이토 겐은 표적 숙주 세포의 세균 감염에 필요한 세포 경로의 글로벌 학습을 허용한다.

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징<em&gt; 리스테리아</em

이 프로토콜에서는 Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System을 사용하여 쥐 대식세포 세포주를 siRNA로 효율적으로 transfection하고, 지질다당류로 대식세포를 자극하고, 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

여기서는 레지오넬라 뉴모 필라 (L. 뉴모) 액체 배양에서 외막 소체 (OMV)의 정제를 기술한다. 이러한 정제 소포 그들의 프로 - 염증 가능성을 분석하는 대 식세포의 치료에 사용된다.

레지오넬라 뉴모 필라 외부 막 소포 : 분리 및 대 식세포에 그들의 프로 - 염증 가능성 분석

우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 감염 분석 호스트 인코딩 요인의 활동을 분석 하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다.

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

학습하세요 대식세포 내 Listeria monocytogenes에서 세균 RNA를 분리하는 방법을. 이 기술은 숙주 핵산 오염을 최소화하면서 세균 RNA를 풍부하게 얻어 감염 중 유전자 발현 연구에 활용됩니다.

RNA 정제는 세포 내에서 재배

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