방사성 표지 된 기판에서 이산화탄소 생산에서의 측정 노랑 초파리

이 프로토콜의 전반적인 목표는 팔미트산 또는 포도당과 같은 방사선 표지된 기질을 설정하고 손상되지 않은 초파리에서 생성되는 이산화탄소를 측정하는 것입니다. 이 방법은 주어진 돌연변이가 에너지 대사에 영향을 미칠 수 있는지 여부와 같은 초파리 연구자의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 적은 수의 초파리에서 연료 산화를 정량적이고 민감하며 재현 가능한 측정이 가능하다는 것입니다.

플라이 포드 조립 단계에서는 파리가 마취에서 회복하기 전에 실험 장치의 적절한 구성을 보장하기 위해 작은 부품을 빠르게 조작해야 하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 탄소-14는 저에너지 베타 방출체이며 공기 중 범위가 짧지만, 방사성 표지된 분자가 유출되거나 실험자가 우발적으로 섭취하지 않도록 주의해야 합니다. 1-2개의 마이크로퀴리 방사성 표지 기질을 15마이크로리터의 FD&C Number One 파란색 식품 염료 및 물과 혼합하여 총 25마이크로리터의 부피를 얻습니다.

방사성 표지된 모든 기질과 파란색 염료 혼합물을 빈 파리 식품 바이알의 바닥에 파이프로 고정합니다. 플라이 푸드 바이알은 쉽게 넘어지므로 기울어지지 않도록 용기에 보관하십시오. 음식이 액화될 때까지 전자레인지에 표준 파리 음식을 가열합니다.

높은 출력 수준에서 15-20초는 일반적으로 10ml의 식품이 들어 있는 바이알 하나에 충분합니다. 975마이크로리터의 용융 식품을 방사성 표지된 기질과 파란색 염료 혼합물에 첨가하고 파란색의 균일성을 모니터링하면서 빠르게 소용돌이치면서 완전한 혼합을 보장합니다. 파이프 헤드 팁은 가위로 절단하여 좁은 끝을 넓혀야 할 수 있으므로 점성 용융 식품의 정확한 파이프 방향을 알 수 있습니다.

음식을 식히고 실온에서 20-30분 동안 완전히 굳히도록 합니다. 아크릴 베이스에 융합된 다공성 폴리에틸렌으로 구성되고 압력 조절기가 있는 이산화탄소 탱크에 연결된 이산화탄소 마취 장치는 성충 파리를 마취하는 데 사용됩니다. 분당 5리터의 속도로 마취 장치로 이산화탄소를 흘려보냅니다.

마취된 파리를 방사선 표지된 파란색 염색 식품이 들어 있는 바이알로 옮깁니다. 각 바이알에 폼 스토퍼로 캡을 씌우고 파리가 깨어날 때까지 수평으로 놓습니다. 바이알을 뚜껑이 있는 아크릴 용기에 옮깁니다.

단기 먹이를 주기 위해 굶주린 파리는 방사선 표지된 음식으로 옮기기 전에 18-24시간 동안 굶주린 파리를 2-3시간 먹이는 단계에서 먹을 수 있도록 합니다. 5일에서 7일 동안 장기간 먹이를 주기 위해 파리를 굶겨 죽일 필요는 없지만, 실험자는 바이알에 있는 방사성 표지된 식품의 수분 함량을 모니터링하고 바늘과 주사기를 사용하여 건조 식품이 담긴 바이알에 물을 추가해야 합니다. 방사성 표지된 기질 먹이 기간이 끝나면 파리를 새 바이알에 두드려 표지가 없는 식품으로 옮깁니다.

2-4시간의 초기 추적 기간을 통해 파리는 표피에서 방사성 표지된 음식 입자를 청소할 수 있고 장에 남아 있는 방사성 표지 음식물을 소화할 수 있습니다. 푸른 복부를 찾기 위해 파리를 육안으로 검사하여 내장을 통해 음식의 진행 상황을 모니터링합니다. 그런 다음 파리를 다른 음식 유형 또는 주변 온도로 옮깁니다.

이 추적 기간의 길이는 수행되는 실험에 따라 달라집니다. 이산화탄소 포집 장치를 만들기 전에 C-14 포도당 또는 C-14 팔미트산으로 표시된 파리를 포함하고 대기에 개방된 상태로 유지되는 메쉬 덮개가 있는 튜브인 파리 포드를 구성하기 위한 재료를 조립합니다. 면도날을 지혈기로 고정하고 분젠 버너의 불꽃에서 빨갛게 뜨거워질 때까지 가열한 다음 가열된 칼날을 사용하여 12mm x 75mm 폴리프로필렌 튜브의 상단 50mm를 잘라내고 25mm 길이의 둥근 바닥 튜브를 남깁니다.

35mm x 35mm 정사각형의 130 미크론 나일론 메쉬를 준비합니다. 1인치 반에서 2인치 길이의 투명 테이프 조각을 여러 개 자릅니다. 다음으로, 이산화탄소 포집 장치에 필요한 재료를 조립합니다.

각 플라이 포드에 대해 20ml 유리 섬광 바이알, 중심에서 벗어난 구멍이 있는 고무 뚜껑 마개, 중앙 웰 및 등급 GFB 유리 극세사 여과지를 조립합니다. 상단 스토퍼의 구멍을 통해 중앙을 잘 삽입합니다. 사용 당일 5%수산화칼륨을 신선하게 준비하십시오.

플라이 포드로 옮기기 위해 파리를 마취하기 직전에 원형 GFB 여과지를 접어서 고무 상단 마개의 구멍을 통해 끼워진 중앙 웰에 넣고 100마이크로리터의 5% 수산화칼륨으로 포화시킵니다. 마취된 파리를 파리 포드로 옮기는 것은 이 프로토콜에서 가장 어려운 단계입니다. 성공을 보장하려면 필요한 모든 재료를 가까운 곳에 두고 파리가 이산화탄소에 노출되는 것을 제한하고 메쉬가 튜브에 단단히 고정되기 전에 파리가 깨어나 탈출하는 것을 방지하기 위해 신속하게 작업하십시오.

라벨이 지정되지 않은 배지에서 배양 후 이산화탄소로 파리를 마취합니다. 마취된 파리를 절단된 폴리프로필렌 튜브에 솔질하고 나일론 메쉬로 덮고 투명 테이프를 사용하여 메쉬를 튜브에 부착합니다. 특정 실험을 위해 각 파리 포드에 동일한 수의 파리를 사용해야 합니다.

파리 떼 당 10-20 마리의 파리는 섬광 계수로 측정하기에 충분한 방사선 표지 된 이산화탄소를 생성합니다. 플라이 포드를 20ml 유리 섬광 바이알에 옮깁니다. 유리 바이알에 고무 뚜껑을 씌운 마개를 씌우고 수산화칼륨 포화 GFB 여과지가 들어 있는 중앙 우물을 잡습니다.

고무 뚜껑을 얹은 마개의 넓은 상단을 유리 섬광 바이알의 가장자리 위로 접습니다. 파리가 들어있는 유리병을 뚜껑이 있는 아크릴 용기에 넣고 다양한 기간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 유리 바이알의 뚜껑을 풀고 수산화칼륨 포화 GFB 여과지를 4ml의 섬광 칵테일이 들어 있는 6ml 플라스틱 섬광 바이알로 옮깁니다.

추가 섬광 바이알을 준비하는데, 하나는 백그라운드로 사용할 사용하지 않은 GFB 여과지가 들어 있고, 다른 하나는 0.1 - 0.5 마이크로큐리 방사성 표지 기질이 들어 있는 다른 두 개의 바이알을 준비하여 마이크로큐리당 분당 개수를 계산합니다. 섬광 계수기를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 각 샘플에 대한 분당 계수를 측정합니다. 그런 다음 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 총 이산화탄소 생산량을 계산합니다.

파리에게 18시간 동안 금식시킨 후 2시간 동안 방사성 표지된 팔미트산을 먹인 다음 12마리 또는 25마리의 그룹으로 3시간 또는 6시간 동안 부화하여 방사성 표지된 이산화탄소 생성 여부를 테스트했습니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이 25마리의 파리가 배출하는 이산화탄소의 양은 12마리의 파리가 배출하는 양의 거의 두 배였으며, 배양 시간을 3시간에서 6시간으로 늘렸을 때 각 그룹의 양은 두 배로 증가했습니다. 피코몰라(picomolar) 방사성 표지된 시간당 플라이당 이산화탄소는 각 그룹에서 거의 동일했습니다.

단식은 베타 산화에 의한 지방산 분해를 자극하기 때문에, 지방산 산화로 인한 이산화탄소 생성은 공복 동물에서 사료를 먹은 동물에 비해 증가해야 합니다. 이를 테스트하기 위해 18시간 동안 단식한 파리에게 방사선 표지된 팔미트산을 2시간 동안 먹이고 두 그룹으로 나누어 표지가 없는 파리 사료 또는 1%한천으로 옮겼습니다. 두 개의 별도 실험에서, 한천을 쫓은 파리는 음식을 쫓은 파리보다 훨씬 더 많은 방사성 표지된 이산화탄소를 생성했는데, 이는 단식 동물에서 베타 산화가 증가했음을 나타냅니다.

이 절차에 따라 총 이산화탄소 생산량 측정, 총 산소 소비량 측정, 호흡 교환 비율 계산과 같은 보완적인 방법을 수행하여 선호하는 연료 공급원이 무엇인지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이 프로토콜을 사용하여 특정 연료를 에너지원으로 사용하는 능력에 대한 주어진 돌연변이 또는 실험적 조작의 영향을 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 방사능으로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑, 실험복, 고글을 착용하고 적절한 차폐를 사용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.