젤 보조 재수를 사용하여 거대한 크기의 Polymersomes 형성

이 겔 보조 재수화 방법의 전반적인 목표는 소포 크기 분포를 쉽게 제어할 수 있는 온전한 단층 거대 고분자 소포를 견고하게 형성하는 것입니다. 이 방법은 고분자 소포 형성을 위한 강력한 대안을 제공하며, 이는 멤브레인의 물리적 특성을 조사한 다음 해당 소포를 생체 공학 응용 분야에 통합하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존 기술보다 훨씬 더 빠르고 노동 집약적인 방식으로 수백 개의 손상되지 않은 거대 고분자 소포를 쉽게 생산할 수 있다는 것입니다.

그래서 이에 대한 아이디어는 거대 지질 소포를 형성하기 위한 젤 보조 수분 보충 기술에 대해 배웠을 때 떠올랐습니다. 그러나 거대 폴리머솜을 형성하는 현재 방법은 까다롭고 수율이 낮은 경우가 많기 때문에 이 방법론을 대안 접근법으로 사용하기로 결정했습니다. 유리 바이알에 있는 클로로포름 1ml에 PEO-PBD 디블록 공중합체 5mg을 완전히 용해될 때까지 소용돌이쳐 고분자 용액 준비를 시작합니다.

폴리머와 클로로포름의 밀리리터당 5밀리그램 용액과 형광 표지된 지질 및 클로로포름 용액 밀리리터당 1밀리그램을 새 바이알에 첨가하여 최종 농도 99.5몰 퍼센트 폴리머와 0.5% 지질을 얻을 때까지 추가합니다. 증발을 최소화하려면 폴리머 용액을 클로로포름 내성 뚜껑이 있는 밀폐 바이알에 옮기고 나중에 사용할 수 있도록 섭씨 20도에서 보관하십시오. 아가로스 필름 준비를 시작하려면 250ml 삼각 플라스크에 물 50ml와 표준 아가로스 0.5g을 추가합니다.

전자레인지를 사용하여 1분 동안 끓입니다. 계속하기 전에 아가로스 용액을 섭씨 65도에서 75도 사이로 냉각하여 접착력이 떨어지거나 뭉치는 것을 방지하십시오. 다음으로, 1000 마이크로 리터 피펫 팁의 끝을 잘라 300 마이크로 리터의 아가로 스 용액을 25 밀리리터 정사각형 유리 커버 슬립에 피펫으로 만듭니다.

장갑을 낀 상태에서 커버 슬립의 가장자리를 잡고 다른 1000 마이크로 리터 피펫 팁의 긴 가장자리를 사용하여 전체 표면에 아가 로즈를 고르게 펴 바릅니다. 커버 슬립 아가로스 면이 위로 향하게 하여 파라필름에 놓고 섭씨 37도에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 계속해서 미리 준비된 폴리머 용액 30마이크로리터를 아가로스 필름 코팅 커버 슬립에 피펫팅합니다.

장갑을 낀 손가락으로 커버 슬립 가장자리를 잡고 18 게이지 바늘의 긴 가장자리를 사용하여 원을 그리며 아가로스 필름 위에 폴리머 용액을 펴 바릅니다. 진공 건조기 내부의 플라스틱 페트리 접시에 커버 슬립 폴리머 면이 위로 향하게 놓아 마무리합니다. 잔류 용매를 제거하기 위해 최소 1시간 동안 건조제를 배출하십시오.

폴리머솜을 형성하려면 먼저 단단한 밀봉이 형성될 때까지 부드럽게 눌러 코팅된 커버 슬립의 폴리머 면에 덮개를 잘 부착합니다. 그런 다음 200-500 마이크로 리터의 재수화 용액을 챔버에 첨가하십시오. 다음으로, 유리 페트리 접시의 내부 가장자리를 따라 습식 압연 실험실 물티슈를 놓아 습도 챔버를 형성합니다.

덮개가 부착된 덮개 슬립을 접시에 잘 넣고 뚜껑으로 덮습니다. 페트리 접시를 호일로 덮어 광 표백을 최소화 한 다음 섭씨 40도의 핫 플레이트에 30 분 이상 올려 놓고 폴리머솜 형성을 완료합니다. FRAP 이미징 프로세스를 시작하려면 접착된 덮개가 있는 커버 슬립을 조정 가능한 콘덴서가 장착된 도립 형광 현미경의 스테이지에 놓습니다.

다음으로, 사용된 형광 지질을 기반으로 필터 세트를 선택하고 100X 오일 대물렌즈를 사용하여 커버 슬립의 상단 표면에 있는 폴리머솜을 이미지화합니다. FRAP를 사용하여 멤브레인 유동성을 특성화하려면 먼저 폴리머솜에 초점을 맞춘 다음 현미경 콘덴서를 작은 조리개로 닫고 폴리머솜의 가장자리가 이미지 필드 내에 있는지 확인합니다. 그런 다음 카메라 노출을 늘리고 모든 중성 밀도 필터를 제거한 다음 관심 영역이 30-60초 동안 사진 표백제를 사용하도록 합니다.

마지막으로 램프를 끄고 콘덴서를 완전히 엽니다. 시작 설정으로 노출을 줄이고 3분 동안 30초마다 이미지를 캡처합니다. 현미경의 컴퓨터에서 이미지 분석 소프트웨어를 열고 폴리머솜의 획득된 이미지를 로드합니다.

Analyze(분석) 드롭다운 메뉴를 열고 Set Scale(스케일 설정) 옵션을 선택하여 측정 스케일을 설정합니다. 거리(픽셀), 알려진 거리 및 길이 단위에 대한 적절한 보정 단위를 입력한 다음 확인을 선택합니다. 다음으로, line toolbox를 사용하여 선택한 폴리머솜의 직경에 걸쳐 있는 선을 그립니다.

Analyze 드롭다운 메뉴를 열고 Measure를 선택하여 중합체의 직경을 측정합니다. 분석을 돕기 위해 control plus D를 사용하여 다음 폴리머솜으로 이동하기 전에 이미지에 측정 선을 인쇄합니다. 위의 절차를 사용하여 폴리머솜 측정을 계속하고 완료될 때까지 각 측정을 데이터 창에 추가합니다.

마지막으로 파일(File) 및 다른 이름으로 저장(Save As)을 클릭하여 데이터를 저장합니다.열리는 창에서 저장(Save)을 클릭한 다음 결과 파일을 스프레드시트로 열어 데이터를 분석합니다. 다양한 완충액으로 재수화된 PEO-PBD 폴리머 필름으로 형성된 폴리머솜을 형광 현미경을 사용하여 이미지화했습니다. 이미지는 폴리머솜이 일반적으로 직경이 10마이크로미터 미만인 다양한 재수화 조건에서 크기가 비균질임을 보여줍니다.

서로 다른 온도에서 물에서 형성된 폴리머솜의 에피형광 이미지는 재수화 온도가 증가함에 따라 더 큰 폴리머솜이 형성됨을 보여줍니다. 상이한 재수화 온도에서 물에서 형성된 100개 이상의 폴리머솜에 대한 평균 직경을 계산했습니다. 섭씨 24도에서 평균 직경은 2.93마이크로미터였으며 섭씨 70도에서 14.04마이크로미터까지 증가했습니다.

이 기술을 숙달하면 올바르게 수행하면 약 1시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 항상 용액에 폴리머솜을 유지하는 것이 중요합니다. 재수화 용액의 누출 및 폴리머솜의 건조를 방지하기 위해 커버 웰이 커버 슬립에 단단히 부착되어 있는지 확인하십시오.

이 절차에 따라 전자 현미경과 같은 방법을 사용하여 폴리머솜의 추가 구조적 특성을 이해할 수 있습니다. 이 기술은 합성 생물학 및 생명 공학 연구에서 연구 및 비생물-생체 인터페이스, 약물 전달 연구 및 원세포 시스템을 위한 지질막에 대한 견고하고 화학적으로 맞춤화된 대안으로 폴리머솜을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 겔 보조 수화를 사용하여 거대 폴리머솜을 견고하게 형성하고, 소포의 전체 크기를 조정하고, 막 무결성을 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

클로로포름이나 아가로스 및 바늘로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이러한 절차를 수행하는 동안 세심한 주의를 기울이십시오. 흄 후드에서 작업하는 등의 예방 조치를 취하고 항상 고글과 장갑을 사용하십시오.