Name: Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 배우세요 큰가시 고기과의 형질 전환 및 게놈 편집을 위한 미세 주입 기법을 통해 유전자와 인핸서 기능을 분석하는 방법을. 이 기술은 발달 및 진화 유전학 연구에 효율적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 NIH R01 # DE021475 (CTM), NIH Predoctoral 교육 그랜트 5T32GM007127 (PAE) 및 NSF 대학원 연구 활동 (NAE)에 의해 부분적으로 투자되었다. 우리는 주입 프로토콜에 대한 유용한 피드백을 CRISPR 생거 시퀀싱 데이터를 생성 BAC의 recombineering 및 주사, 닉 Donde을 수행하는 케빈 Schwalbach에 감사하고, 캐서린 리 파리.

<ol><li>Bell, M. A., Foster, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+MA+%22The+Evolutionary+Biology+of+the+Threespine+Stickleback%22">The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback</a>. , Oxford University Press. (1994).</li>
<li>Jones, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+basis+of+adaptive+evolution+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks.</a> Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).</li>
<li>Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+assembly+improvement+and+mapping+convergently+evolved+skeletal+traits+in+sticklebacks+with+Genotyping-by-Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing.</a> G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).</li>
<li>Miller, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+skeletal+evolution+in+sticklebacks+is+controlled+by+additive+and+clustered+quantitative+trait+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci.</a> Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).</li>
<li>Shapiro, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+developmental+basis+of+evolutionary+pelvic+reduction+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks.</a> Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).</li>
<li>Colosimo, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+parallel+evolution+in+sticklebacks+by+repeated+fixation+of+Ectodysplasin+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles.</a> Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).</li>
<li>Chan, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+pelvic+reduction+in+sticklebacks+by+recurrent+deletion+of+a+Pitx1+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer.</a> Science. 327 (5963), 302-305 (2010).</li>
<li>O'Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recurrent+regulatory+change+underlying+altered+expression+and+Wnt+response+of+the+stickleback+armor+plates+gene+EDA%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA.</a> eLife. , e05290(2015).</li>
<li>Cleves, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+tooth+gain+in+sticklebacks+is+associated+with+a+cis-regulatory+allele+of+Bmp6%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).</li>
<li>Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+developmentally+temporal+quantitative+trait+loci+underlie+convergent+evolution+of+increased+branchial+bone+length+in+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks.</a> Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822(2014).</li>
<li>Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+developmental+genetic+features+underlie+stickleback+gill+raker+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution.</a> EvoDevo. 5 (1), (2014).</li>
<li>Ellis, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+and+genetic+mechanisms+underlie+convergently+evolved+tooth+gain+in+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks.</a> Development. 142, 2442-2451 (2015).</li>
<li>Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+linkage+disequilibrium+and+parallel+adaptive+divergence+across+threespine+stickleback+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).</li>
<li>Hohenlohe, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+genomics+of+parallel+adaptation+in+threespine+stickleback+using+sequenced+RAD+tags%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags.</a> PLoS Genet. 6 (2), e1000862(2010).</li>
<li>McKinnon, J. S., Rundle, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+in+nature%3A+the+threespine+stickleback+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Ecol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Speciation in nature: the threespine stickleback model systems.</a> Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).</li>
<li>Shao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+feedback+effects+on+LH+and+FSH%2C+and+photoperiodic+control+of+reproduction+in+male+three-spined+sticklebacks%2C+Gasterosteus+aculeatus%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).</li>
<li>Katsiadaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-spined+stickleback%3A+an+emerging+model+in+environmental+endocrine+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Int.+J.+Environ.+Physiol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption.</a> Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).</li>
<li>Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+local+immunological+adaptation+of+two+stickleback+ecotypes+by+experimental+infection+and+transcriptome-wide+digital+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis.</a> Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).</li>
<li>Barber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sticklebacks+as+model+hosts+in+ecological+and+evolutionary+parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology.</a> Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).</li>
<li>Erickson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+190+base+pair%2C+TGF-%CE%B2+responsive+tooth+and+fin+enhancer+is+required+for+stickleback+Bmp6+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression.</a> Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).</li>
<li>Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+microinjection+protocol+for+making+transgenic+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Behaviour%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks.</a> Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evo-Devo+and+an+expanding+evolutionary+synthesis%3A+a+genetic+theory+of+morphological+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution.</a> Cell. 134 (1), 25-36 (2008).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
<li>Hindorff, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+etiologic+and+functional+implications+of+genome-wide+association+loci+for+human+diseases+and+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).</li>
<li>Fisher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+biological+relevance+of+putative+enhancers+using+Tol2+transposon-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).</li>
<li>Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+transposase+of+the+Tol2+element%2C+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish%2C+and+its+transposition+in+the+zebrafish+germ+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).</li>
<li>Kikuta, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+transgenesis+using+Tol2+transposon+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Moleculario+Biology%3A+Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors.</a> Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).</li>
<li>Halloran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).</li>
<li>Kingsley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+genomic+tools+for+molecular+studies+of+evolutionary+change+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Behaviour%22%5BJournal%5D)">New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks.</a> Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).</li>
<li>Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+approach+for+identifying+distant+regulatory+elements+applied+to+the+Gdf6+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene.</a> Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice.</a> BMC Genomics. 10 (1), 477(2009).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Talbot, J. C., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+CRISPR+pipeline+to+reliably+generate+zebrafish+frameshifting+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles.</a> Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).</li>
<li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transposon-Mediated+Gene+Trap+Approach+Identifies+Developmentally+Regulated+Genes+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).</li>
<li>Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+compatible+vectors+for+analysis+of+gene+function+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3-new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3-new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) </a>. , 5th Edition, University of Oregon. Press: Eugene, OR. (2007).</li>
<li>Dale, R. M., Topczewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+evolutionarily+conserved+regulatory+element+of+the+zebrafish+col2a1a%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a.</a> Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+Gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

형질 전환 또는 게놈 편집 주입 한 세포 큰가시 고기의 배아는 세 가지 주요 과제를 제시한다. 첫째, 제브라 피쉬 배아를 기준으로는 큰가시 고기 배아 융모막은 힘든 종종 바늘을 깰 것입니다. 이 문제는 부분적으로 두껍고 강한 유리 마이크로 피펫을 사용하여 융모막에 수직 주입함으로써 극복 될 수있다 (프로토콜,도 2 참조). 가능한 것과 약간의 물을 확보하는 것은 배아에 추가됩니다 (다만 충분히 융모막이 팽창 멀리 세포에서 리프트를 유발하는 것은) 융모막 경도를 줄일 수 있습니다. 융모막은 시간이 지남에 따라 경화, 그래서 배아를 가습 후 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 그들이 건조하지 않도록 사전 주입 습도 챔버에서 배아를 유지하는 것도 중요하다. 일부 클러치, 심지어 개인 배아는 단순히 훨씬 두껍고 강하다 chorions있다; 때로는 다음 배아로 이동하거나 새 클러치 시도하는 가장 쉬운 솔루션입니다. 하나의 D를 건너 훨씬 쉽다<html> 손상된 바늘을 교체하는 것보다 ifficult 배아....

생물 다양성은 자연에서 진화 된 표현형 변화의 유전 개발 기지를 결정하는 발생 방법을 이해하는 하나의 기본 구성 요소입니다. 큰가시 고기 생선, Gasterosteus aculeatus는 진화의 유전 적 기초를 공부하는 우수한 모델로 떠오르고있다. 큰가시 고기과 해양 물고기가 북반구의 주위에 수많은 민물 환경을 식민지 것처럼 극적인 형태 학적, 생리 학적 결과, 많은 적응 진화 적 변화를 겪고, 그리고 한 행동 변화 1. 스물 한 큰가 집단에서 개인의 게놈 서열 조립 및 고밀도 링크 맵은 상기 조립체 2,3-을 개선하기 위해 생성되어왔다. 유전자 맵핑 실험은 진화 표현형 4 기본 게놈 영역을 식별 한 6 -, 몇 가지 경우에, 특정 후보 유전자의 기능적 역할 7,8 테스트 한. 형태 학적 변화를 기본 게놈 영역의 숫자는 유망한 후보 유전자로 확인되었다, 그러나이 후보는 아직 기능적으로 9 테스트되지 않은 - 12. 또한, 큰가시 고기과 인구 유전학 / 유전체학 (13, 14), 분화 (15), 행동 (1), 내분비학 (16), 생태 독성학 (17), 면역학 (18)와 기생충학 (19)의 연구를위한 일반적인 모델입니다. 각 필드에서의 앞으로의 연구는 큰가시 고기과의 기능 유전자 조작을 수행하는 능력에서 이익을한다. 이들 코딩 서열의 조작에 더하여, 후보 유전자의 역할은 시스 - 규정 시퀀스를 연구함으로써 기능적 증가 감소 또는 후보 유전자의 발현을 제거함으로써 평가 될 수있다. 큰가시 고기과에 미세 주입 및 형질 전환 방법은 잘 7,8,20를 설립하고 처음 사용하여 개발 하였다 meganuclease 매개방법 (21)는 첫 번째 송사리 (22)에 설명. 여기에 제시된 개질 미세 주입 방법은 모두 TOL2 매개 된 형질 전환에 최적화 최근 TALENs 및 CRISPRs 포함한 게놈 편집 시약을 개발되었다. 시스 규정하는 요소에 대한 변경 사항은 시스 규정하는 변화는 돌연변이 (23)를 코딩의 부정적인다면 발현 결과를 피할 수로, 형태 학적 진화에 중요한 것으로 생각된다. 따라서, 추정 시스 규정하는 순서를 테스트하고 비교하는 진화 연구의 증가의 중심 목표되고있다. 또한, 대부분의 인간 질병 변형 심하게 시스 규정하는 기능 소자 및 로직을 연구하는데 필요한 규제 변이체 24, 25 및 모델 척추 시스템이다. 많은 수의 외부에 자신의 배아를 비옥 물고기 시스 -regulation을 연구하는 강력한 척추 시스템을 제공합니다. 외국 ì되는 TOL2 트랜스포존 시스템게놈에 통합 할 GN DNA가 TOL2의 트랜스가 사이트와 바인딩에 의해 형벌되고, TOL2의 트랜스 mRNA의와 공동 주입 성공적으로 플라스미드 물고기 유전체 (26)에 구축 통합하는 높은 효율로 작동 - 28. 일반적으로 잠재적 인 증강은 TOL2 백본에서 (예 : hsp70l 29)를 기초 프로모터 및 형광 리포터 유전자 등 EGFP로 (강화 된 녹색 형광 단백질) 또는 mCherry의 상류 복제 및 트랜스의 mRNA (26) 주입된다. 형광 기자의 어느 주입 배아 또는 안정적으로 통합 된 형질 전환 유전자를 가진 자손의 표현의 관측은 추정 증강에 의해 구동 유전자 발현의 시공간 규제에 대한 정보를 제공합니다. 상기 실험에서 검증 증강은 관심 유전자의 조직 - 특이 과발현을 유도하는데 사용될 수있다. 큰 시스 규정하는 지역의 분석, 고품질의 대형 삽입 genom에 대한세균 인공 염색체 (BAC에)를 사용하여 IC 라이브러리는 모두 해양 및 담수 큰가시 고기과 (30)로 구성되어있다. 이들의 BAC는 큰 (1백50-2백킬로바이트)의 맥락에서 형광 리포터 유전자의 게놈 영역 (31)을 가진 유전자를 대체 recombineered 수있다. 는 BAC 내의 조절 서열에 의해 결정되는 형광 리포터이어서 시공간 패턴으로 표현된다. 물고기 연구 내용 TOL2 사이트 게놈 통합 (32,33)를 용이하게하기 BAC에 첨가 될 수있다. 개발의 후기 단계 계내 혼성화에 기술적 도전에서 BAC 형광 판독 큰가 뼈 형태 형성 단백질 6 (Bmp6) (20)에 대해 도시 된 바와 같이, 유전자 발현의 패턴을 연구하는데 사용될 수있다. 또한, 각각의 형광 발현 패턴 계내 혼성화에 달성 될 수없는 시간에 걸쳐 추적 될 수있다. BAC에 또한 additiona을 추가하는데 사용될 수있다게놈 영역의 L 사본은 관심의 유전자의 복용량을 증가시킵니다. 유전자 기능 연구를 위해, 게놈 편집 유기체 (34)의 다양한 게놈 서열을 타겟팅하는 변화를 생성하는 데 사용될 수 폭발적으로 확장 필드이다. 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs)는 원래 정확하게 선택의 게놈 시퀀스에 직접 결합하여 이중 가닥이 35, 36을 깰 생성하도록 설계 될 수있다 식물 병원균으로부터 분리 모듈, 순서 특정 뉴 클레아 있습니다. 클러스터 정기적 interspaced 짧은 상동 반복 (CRISPR)은 / CAS 시스템은 원래 세균에서 찾을 수 있으며, 상기 가이드 (37)에 상보적인 표적 DNA 서열의 틈을 발생하도록하는 가이드 RNA 및 Cas9 단백질을 사용 하였다. 종종 TALENs 및 CRISPRs 모두에 의해 생성 된 이중 가닥 나누기 후속 보수는 표적 서열의 기능을 방해 할 수있는 작은 삽입 또는 결실을 남겨35-37. 큰가시 고기과에서 TALENs는 인핸서 (20)를 대상으로 유전자 발현을 방해하는 데 사용되었으며, TALENs 및 CRISPRs 모두 성공적 서열 (미공개 데이터)를 코딩 돌연변이를 생산 하였다. 제브라에 사용 CRISPRs의 생성에 대한 상세한 프로토콜은 큰가시 고기과 38 CRISPRs을 개발하는 지침으로 이용 될 수있다. 형질 전환 및 게놈 편집 실험 새로 수정 된 하나의 배아 세포 내로의 핵산의 도입을 필요로한다. 초기 발달에서 유전자 또는 게놈 편집 툴을 도입함으로써, 배아 유 전적으로 조작 딸 세포의 수를 최대화한다. 주입 된 배아는 시각적으로 형광에 대한 검사 또는 분자 게놈 수정에 대한 상영된다. 항체 2.12.1fx에 기여하는 세포를 타겟으로하는 경우, 형질 전환 또는 돌연변이 포스트 분사 치사율이 높은 경우에도, 자식들의 서브 세트로 전달 될 수있다. 모자이크 물고기 outcrossed 할 수 있습니다 또는교차하고 그들의 자손은 돌연변이 대립 유전자 또는 관심의 안정적 통합 된 형질 전환 유전자를 복구하는 상영. 이 프로토콜은 하나의 셀 큰가시 고기의 배아에 유전자와 게놈 편집 시약을 도입하고 성공적으로 게놈 수정에 대한 모니터링하기위한 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>투과 조명이 있는 실체 현미경</td><td>Leica</td><td>S6e/ KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>수동 미세 조작기</td><td>응용 과학 계측</td><td>MM33</td><td>Marzhauser M33 미세 조작기</td></tr><tr><td>압력 주입 시스템</td><td>응용 과학 계측</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>배압 장치</td><td>응용 과학 계측</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 홀더 키트</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱베이스 홀더</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>마그네틱베이스</td><td></td></tr><tr><td>풋 스위치</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>철판 (마그네틱베이스)</td> <td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Flaming / Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>일회용 이송 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 페놀 레드 in DPBS</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P0290</td><td>주입 추적자</td></tr><tr><td>#5 펜치, 생물학 듀목셀&nbsp;</td><td>바늘 깨기를 위한</td> <td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td></tr><tr><td>마이크로피펫 저장 항아리</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td>은 <td>바늘을 6</td></tr><tr><td>", 인치당 6개의 이빨을 보관합니다. 플라스터 건조벽 톱</td><td>Lenox</td><td>20571 (S636RP)은</td> <td>주입용 달걀을</td></tr><tr><td>13cm x 13cm 유리 접시</td>로 보관하며, <td>어떤 철물점</td><td>에서든지-</td><td></td></tr><tr><td>보로실리케이트 유리 모세혈관, 1.0 mm OD/0.58 mm ID&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-F4</td><td>*제브라피쉬 주입 모세관보다 단단한 유리</td></tr><tr><td>150 x 15mm 페트리 접시</td><td>Fisher</td><td>FB0875714</td><td>Raise stickleback 배아</td></tr><tr><td>35mm x 10mm 페트리 접시</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td>저장 계란 사전 주입</td></tr><tr><td>인스턴트 오션 소금</td><td>인스턴트 오션</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>트리카인 메탄설포네이트/MS-222</td><td>웨스턴 케미컬 Inc</td><td>MS222</td><td>어류 마취/안락사</td></tr><tr><td>Sp6 전사 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>TALEN 및 트랜스포사제 mRNA</td></tr><tr><td>RNeasy 클린업 키트</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>정제 트랜스포사제 또는 TALEN RNA</td></tr><tr><td>QiaQuick PCR 클린업 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>클린업 플라스미드 주사</td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 K 20 mg/ml</td> DNA <td>준비를 위한</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td></tr><tr><td>Nucleobond BAC 100 키트</td><td>BAC DNA 준비를 위한</td><td>Clontech</td><td>740579</td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 중합효소</td><td>Fisher</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen PlasmidPlus Midi kit</td><td>Qiagen</td><td>12943</td><td>에는 내독소 린스 버퍼가 포함되어 있습니다</td></tr>.<tr><td>QIAQuick 젤 추출</td><td>Qiagen</td><td>28704&nbsp;</td><td>유도된 돌연변이의 염기서열분석(sequencing)</td></tr><tr><td>페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올</td><td>시그마</td><td>P2069-100ML</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>시그마</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 (분자 생물학 등급)</td> <td>시그마</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>아가로 스</td><td>시그마</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>50x 트리스 - 아세테이트 -EDTA 버퍼</td><td>ThermoFisher</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>0.5-10 Kb RNA 사다리</td><td>ThermoFisher</td><td>15623-200</td><td></td></tr><tr><td>나노드롭&nbsp; 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1kb 플러스 DNA 래더</td><td>ThermoFisher</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>시그마</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>시그마</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>트리스 pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>12-스트립 PCR 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1113</td><td></td></tr></tbody></table>

threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

큰가시 고기 생선은 형태 학적, 생리의 다양한 유전 적 기초를 공부하는 강력한 시스템, 행동 표현형로 ​​떠오르고있다. 해양 및 민물 형태를 교차 할 수있는 능력과 결합 해양 인구 수많은 담수 환경에 적응로 진화 현저 다양한 표현형은 유전자가 형질 발전 제어하는​​ 게놈 영역을 매핑하는데 사용될 수있는 드문 척추 시스템을 제공한다. 우수 게놈 자원 진화 변화의 분자 유전 학적 해부을 용이하게 사용할 수 있습니다. 맵핑 실험 흥미 후보 유전자의리스트를 생성하지만, 기능적 유전자 조작은 유전자의 역할을 테스트하도록 요구된다. 유전자 조절은 TOL2 트랜스의 시스템을 이용하여 게놈에 통합 된 트랜스 제닉 리포터 플라스미드와 함께 BAC에 조사 할 수있다. 특정 후보 유전자 및 시스 - 규정 요소의 기능은 타겟 유도함으로써 평가할 수있다TALEN 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집 시약 돌연변이. 모든 방법은 수정 된 하나의 셀 큰가시 고기의 배아로 핵산을 도입 필요, 작업이 큰가시 고기 배아의 두께 융모막과 상대적으로 작고 얇은 할구로 도전했다. 여기서, 큰가 배아 내로 핵산 마이크로 인젝션에 대한 상세한 프로토콜은 트랜스 제닉 게놈 편집 유전자의 발현 및 기능을 연구하는 응용뿐 아니라 형질 전환의 성공 여부를 평가하고 안정한 선을 복구하는 방법에 대해 설명한다.

인핸서 활성을 갖는 리포터 유전자 형질 전환 유전자를 들어, 성공적으로 주입 트랜스 (도 4A, 4C)의 특정 세포 발현을 초래할 것이다. 주입 후 물고기 안정 라인 (도 4b에 도시 된 BAC 안정 선의 예)를 제조하는 outcrossed 수있다. 큰가시 고기의 배아에 DNA를 주입하는 것은 일반적으로 혼자 RNA보다 훨씬 높은 치사율을 초래한다. 그것은 50 %까지 볼 전형적인 (때로는 이상) 치사율 또는 기형 (그림 4D 참조 - F, 4I)를 TOL2 기자를 주입 한 후에는 (유사 이전에 설명 meganuclease 방법 21) 구성한다. 그러나, 그 결과는 광범위 특정 구조 배아 형태 및 기술 수​​준에 따라 달라질. 활성 강화제를 들어, 배아 40-50 %가 ...

트랜스 제닉 조작 게놈 편집 기능적 유전자 및 시스 - 규정 요소의 역할을 테스트하기 위해 중요하다. 여기에 (TOL2 매개 형광 리포터 유전자 구조, TALENs 및 CRISPRs 포함) 유전자 변형의 발생에 대한 자세한 미세 주입 프로토콜은 긴급 모델 물고기의 큰가시 고기에 대한 표시됩니다.

Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

이 미세주입 기술의 전반적인 목표는 유전자 및 인핸서 기능을 테스트하기 위해 형질전환 및 게놈 편집 가시치물을 생성하는 것입니다. 이 방법은 유전자와 인핸서가 신체 패턴을 생성하기 위해 어떻게 작동하는지와 같은 발생 및 진화 유전학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기능적 유전 분석을 위한 형질전환 어류를 효율적으로 생성한다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 따라 두 종류의 플라스미드와 mRNA를 준비한 후, 붕규산 유리에서 마이크로피펫 니들을 최소 4개 뽑아냅니다. 뾰족한 끝부분이 아래로 향하도록 모세관 보관 병에 수직으로 보관하십시오. 최대 100개의 가시납치고기 알을 수정시키려면, 정자 용액 50 µL를 첨가하고 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 저어 모든 알이 수정되도록 합니다.얼음 위에서 작업하는 동안, 피펫으로 0.5 µL의 주입 용액을 바늘의 뭉툭한 끝부분에 넣고 흘려보내는 방식으로 최소 3개의 바늘을 역충전합니다. 그동안 해부 현미경의 투과 조명을 켜고, 현미경 조명 베이스 위에 13 cm² 유리판을 놓은 뒤 그 위에 15 cm 석고 톱날을 올립니다. 톱날의 홈이 바늘 홀더를 향하도록 주입 장치와 수직이 되게 배치한 다음, 컨트롤 박스를 켜고 압력이 약 175 kPa로 설정되었는지 확인합니다.주입 시간을 180 milliseconds로 설정하십시오. 다음으로 니들 홀더를 푼 다음, 고무 홀더의 저항이 느껴질 때까지 충전된 니들을 홀더에 삽입하고 니들 홀더를 손가락으로 조일 수 있는 만큼 조이십시오. 그런 다음 니들 각도를 약 45도로 조정하십시오.마이크로매니퓰레이터 컨트롤을 사용하여 바늘 끝이 시야 중심에 오도록 조절하십시오. 약 40배율로 확대한 후 바늘 끝에 초점을 맞추되, 바늘 끝이 아래쪽 유리에 닿지 않아야 합니다. 시계 수리용 핀셋으로 바늘 끝에서 핀셋 너비의 2~3배 떨어진 지점을 잡고, 60도 각도로 끝부분을 조심스럽게 꺾어 절단하십시오.그 다음, 주입 풋 페달을 여러 번 눌러 바늘이 끊어지지 않았는지 테스트합니다. 몇 번 누르면 끝부분에서 작은 붉은 방울들이 나오기 시작해야 합니다. 일회용 전이 피펫을 사용하여 유리 플레이트 위에 가시납치고기 물을 몇 방울 떨어뜨립니다.바늘을 물속으로 천천히 내린 다음, 바늘 끝에서 분홍색 액체가 가늘게 흘러나올 때까지 배압을 높입니다. 배아를 준비하는 동안 바늘이 손상되지 않도록 바늘을 가능한 한 최대한 뒤로 뺍니다. 수정 후 약 25분이 지나면, 10 µL 피펫 팁 두 개를 사용하여 한 무리의 배아 중 5~10개를 꺼내 유리 플레이트로 옮깁니다.피펫 팁을 사용하여 배아가 뚫리지 않도록 주의하며 톱날의 개별 홈으로 배아를 조심스럽게 분리합니다. 다음으로 전송 피펫을 사용하여 배아가 잠길 만큼의 가시납치고기(stickleback) 물을 추가합니다. 그 후 3~5초 뒤에, 각 배아를 덮는 소량의 물만 남기고 대부분의 물을 제거합니다.가장 멀리 있는 배아부터 시작하여, 유리 플레이트를 슬라이드하고 배아가 시야의 약 25%를 채우도록 확대합니다. 바늘을 시야로 내린 다음, 10 µL 피펫 팁을 사용하여 배아를 조심스럽게 회전시켜 난황 상단에 알갱이 형태의 약간 노란색으로 솟아오른 세포질 덩어리인 할구(blastomere)를 확인합니다. 할구가 바늘 끝과 정확히 수직이 되도록 배아를 회전시킵니다.바늘을 천천히 그리고 균일하게 압력을 가하며 내려 코리온(corion)을 뚫고, 바늘이 그 아래의 난황을 관통하지 않도록 주의하며 세포질 속으로 삽입합니다. 풋 페달을 3~4회 눌러 주입하며, 이때 가장자리가 약간 퍼진 붉은색 볼루스가 세포질 직경의 약 1/8을 채우도록 합니다. 바늘이 날카롭고 코리온과 수직을 이루면 이 단계가 더 수월해집니다.첨가하는 물의 양을 제한하면 코리온을 부드럽게 유지하는 데 도움이 됩니다. 마지막으로, 세포질을 타겟팅하면 형질전환 동물을 얻을 가능성이 높아집니다. 마이크로매니퓰레이터 컨트롤을 사용하여 바늘을 후퇴시키고, 배아가 바늘에 달라붙을 경우 10 µL 피펫 팁으로 배아를 눌러 고정하십시오.바늘을 뺀 후, 유리 플레이트를 밀어 다음 배아가 바늘과 일직선이 되도록 맞추고 주입 과정을 반복합니다. 모든 배아에 주입이 완료되면, 끝부분을 잘라낸 전이 피펫을 사용하여 플레이트에 물을 추가합니다. 그런 다음 전이 피펫으로 배아를 수집하여 가시납치고기(stickleback) 물이 채워진 150 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다.배아를 18°C에서 배양합니다. 주입 하루 후, 가시납줄새 물을 조심스럽게 따라내고 신선한 물로 교체합니다. 사멸하거나 기형인 배아가 있는지 확인하고, 오염을 방지하기 위해 이를 제거합니다.여기에 나타낸 바와 같이, 인핸서 활성을 가진 트랜스진의 경우, 주입에 성공하면 특정 세포에서 트랜스진이 발현됩니다. 예를 들어, 가슴지느러미, 중앙지느러미 및 척삭에서 발현됩니다. 주입된 물고기를 역교배시켜 수정 후 4일째의 배아 심장에서 GFP 발현을 유도하는 이와 같은 안정적인 라인과 같은 안정적인 라인을 생성할 수 있습니다.활성 인핸서의 경우, 배아의 40~50%에서 조직 특이적 트랜스진 발현이 나타나며, 예를 들어 중앙 핀과 가슴 핀에서 관찰됩니다. toll two 플라스미드 트랜스진을 발현하는 GFP 양성 F0 물고기의 최대 100%가 트랜스제닉 자손을 생성합니다. 하지만 트랜스진을 보유한 자손의 비율은 1% 미만에서 72%까지 매우 다양하게 나타납니다.일반적으로 GFP 양성인 주입 배아만을 선별하여 보관하면 전달 효율이 증가합니다. F0 재주입 가시송사리 배아 중 예상 조직에서 형광을 나타내는 비율은 최대 10%에 불과합니다. 또한, 재주입(backs)의 전달률은 플라스미드 제작물(plasmid constructs)의 전달률보다 낮습니다.스크리닝된 가시볼락의 최대 14%만이 백트랜스제네시스(back transgenesis)를 전달했습니다. 백트랜스제네시스의 낮은 효율과 대조적으로, 탈론(talons)을 주입한 물고기의 70~100%에서 모자이크 병변이 나타났습니다. 여기에서 주입된 각 배아의 uncut PCR 증폭 산물은 각 배아의 일부 세포가 표적 유전자좌(target locus)에 병변을 가지고 있음을 나타냅니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 배아 100개를 한 그룹으로 묶어 1시간 남짓한 시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 기술을 향상시키고 배아 생존율을 높이기 위해서는 연습과 인내가 필요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 공초점 현미경법과 같은 다른 방법들을 사용하여 인핸서 발현의 세부 패턴에 관한 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다.또한, 유도된 돌연변이로 인한 표현형을 연구하기 위해 게놈 편집된 물고기를 교배하여 키울 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 진화 및 발달 유전학 분야의 연구자들은 가시볼락의 유전자 조절과 기능을 연구할 수 있는 길이 열렸습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 형질전환 및 게놈 편집을 위해 가시볼락 배아에 주입하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Microinjection은 수정된 zebrafish의 배아에 이물질을 소개하는 잘 설립하고 효과적인 방법입니다. 여기, 우리는 강력한 mRNA의 overexpression을 수행하기위한 microinjection 기술 및 zebrafish에서 morpholino의 oligonucleotide 유전자 최저 연구를 보여줍니다.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

출처: Chen, S., et al., 신생아 마우스 뇌의 선조체 세포에서 유전자 조작을 위한 정위 수술. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 Cre 재조합효소와 녹색 형광 단백질 또는 GFP를 암호화하는 바이러스 벡터를 유전자 변형 마우스 새끼의 선조체에 정위 주입하여 loxP 측면 STOP 카세트를 절제하여 적색 형광 단백질 또는 RFP를 리포터로 활성화하여 유전자 조작을 달성하는 방법을 보여줍니다.

마우스 새끼 선조체에서 유전자 조작을 위한 바이러스 벡터의 정위 미세 주입

유전자 돌연변이는 유전자 타겟팅 편집 기법을 사용하여 유기체의 광범위한 이제 가능하다. 여기, 우리는 아 스티 아낙 스 mexicanus, 표면 물고기와 cavefish를 포함 물고기의 종 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs) 등의 전사 활성을 이용하여 표적 유전자의 돌연변이 유발을위한 프로토콜을 보여줍니다.

의 게놈 편집<em&gt; 아 스티 아낙 스의 mexicanus</em&gt; 사용 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs)

마우스 oocytes의 microinjection는 일반적인 transgenesis ( 즉, transgenes의 무작위 통합) 및 CRISPR 매개 유전자 타겟팅 모두에 일반적으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 품질 관리 및 유전자 타이핑 전략에 중점을두고 마이크로 인젝션의 최신 개발 상황을 검토합니다.

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

CRISPR/Cas9 시스템을 사용 하 여 채널 메기 배아에서 유전자 편집에 대 한 간단 하 고 효율적인 microinjection 프로토콜 제공 됩니다. 이 프로토콜에서 RNAs 가이드 및 Cas9 단백질 1 셀 배아의 노 른 자에 microinjected 했다. 이 프로토콜은 두 채널 메기 면역 관련 유전자를 노크 하 여 검증 되었습니다 않았습니다.

CRISPR/Cas9 단백질의 유전자 편집에 대 한 채널 메기, Ictalurus punctatus, 배아로 microinjection

Microinjection Nasonia vitripennis 배아의 생성 상속 게놈 수정 하기 위한 필수적인 방법입니다. 여기에 설명 된 microinjection 그리고이 유기 체에서 미래 게놈 조작에 크게 용이 하 게 한다 Nasonia vitripennis 배아의 이식에 대 한 자세한 절차가입니다.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

이 프로토콜은 DNA/DOTAP 혼합물을 1일 된 제노푸스 라에비스 배아의 안구에 미세 주입하는 방법과 지각 중뇌에서 광학 축색 아버를 발현하는 개별 녹색 형광 단백질(GFP)을 이미지화하고 재구성하는 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 그대로, 살아있는 제노푸스 올챙이.

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

여기서, CRISPR/Cas9 게놈 녹아웃 전기 물고기를 생산하고 후방에 프로토콜이 제시된다. 상세히 설명된 것은 체육관 및 모르미리드 모두에 필요한 분자 생물학, 사육 및 축산 요구 사항, 및 Cas9-유도 인델 F0 애벌레를 생산하는 주입 기술이다.

불꽃을 침묵 : 약한 전기 물고기에서 CRISPR / Cas9 게놈 편집

본 프로토콜은 진드기 배아를 주입하는 방법을 기술한다. 배아 주입은 유전자 조작을 위해 트랜스제닉 라인을 생성하는 데 선호되는 기술입니다.

검은다리진드기의 유전자 편집을 위한 배아 주입 기술, Ixodes 견갑골

현재 프로토콜은 유전자 카세트 knock-in 및 floxed 마우스를 효율적으로 생산하기 위한 CRISPR-Cas9 및 기증자 DNA의 접합체 미세주입을 설명합니다.

생쥐에서 유전자 카세트 knock-in 및 Flox 대립 유전자를 생성하기위한 접합체 미세 주입

배우세요 큰가시 고기과의 형질 전환 및 게놈 편집을 위한 미세 주입 기법을 통해 유전자와 인핸서 기능을 분석하는 방법을. 이 기술은 발달 및 진화 유전학 연구에 효율적인 도구를 제공합니다.

Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

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