Name: 해부와 큰가시 고기 아가미 해골의 평면 장착 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 배우세요 큰가시 고기 아가미 해골의 해부 및 평면 장착 방법을 통해 발달과 진화 생물학에서 중요한 영양 형질을 시각화하는 기술을. 이 프로토콜은 다양한 어류 종에 적용 가능합니다.

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이 연구는 NIH R01 #DE021475 to CTM과 NSF Graduate Research Fellowship에 의해 부분적으로 자금을 지원받았습니다. 이미징에 도움을 준 Miles Johnson과 원고를 비판적으로 읽어준 Priscilla Erickson에게 감사드립니다.

모든 물고기 작품은 캘리포니아 버클리 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 번호 R330)에 의해 승인되었다. 안락사 0.1 % 중탄산 나트륨 39 % 완충 0.025 Tricaine-S에 침지하여 수행 하였다. 모든 단계는 실온에서 수행된다. 1. 준비 참고 : 단단히 밀봉 할 수 있고 수평으로 배치 할 원뿔 튜브 또는 섬광 유리 병에 단계 1.1-1.5를 수행합니다. 물고기는 지속적으로 동요 될 필요가 조심스럽게 반전 또는 염색 액에 물고기의 모든면을 노출하고 얼룩이 균등하게 조직을 통과 할 수 있도록 튜브 또는 튜브의 랙을 흔들어 가능한 한 자주 솔루션을 혼합하려고하지 않습니다. 액체의 무거운 무게가 통을 깰 것 같은 플랫폼 통에 물고기의 큰 배치를 두지 마십시오. <ol><li> 하룻밤 10 % 중성 완충 포르말린 (NBF)와 에탄올에 저장하거나 갓 안락사 생선이나 생선을 수정합니다. 대안 적으로, 4 % 파라 포름을 사용1X PBS 용액 대신에 10 % NBF에서 알데히드. 주 : DNA를 추출하는 경우에는 에탄올에 고정 및 저장 전에 꼬리 지느러미 또는 가슴의 일부를 클립. </li><li> 2 시간 동안 (즉, ~의 pH 7.0) 화학 후드에서 제대로 수정 폐기 및 수돗물로 교체합니다. 종종 산성 수 있으며 뼈 석회 수있는 탈 이온수를 사용하지 마십시오. </li><li> 24 시간 동안 물에 1 % KOH에 0.008 % 알리자린 레드 S 물과 얼룩 물고기를 제거합니다. 물고기보다 20mm 표준 길이를 들면, 0.004 % 알리자린 레드 S.는 (다음 희석 될 수있다 알리자린 레드 S의 100 배 (0.8 %) 원액을 확인)를 사용합니다. </li><li> 몇 시간 동안 수돗물에 얼룩 (후드에서 적절한 폐기 용기에 넣어)과 장소 물고기를 제거합니다. 물 린스는 대부분 깨끗해질 때까지 필요에 따라 물을 변경합니다. </li><li> 50 % 글리세롤, 가벼운 청소 및 후속 해부 0.25 %의 KOH에 물과 장소 물고기를 제거합니다. 참고 :이 염색 프로토콜은 앞서 설명한 방법 40, 41에서 수정됩니다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. 해부 참고 : 관련 머리 골격 형태의 검토를 위해 그림 1을 참조하십시오. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig1.jpg" /> 그림 1 :. 큰가 머리 골격 형태 알리자린 레드는 로다 민 B 필터 세트에서 형광 이미징 큰가시 고기의 머리를 염색. 유용한 형태는 표지 할 것 : 연산 = opercle, Subop = subopercle, BSRs = branchiostegal 광선, 수술 전 = preopercle, Infraorb 1-3 = 눈꺼풀 1-3 (또한 circumorbitals 또는 suborbitals), 덴트는 = 치골, Premax = premaxilla, 최대 = 상악을 , 나스 = 코, 위도. ethm = 측면 사골, Psph = parasphenoid, 프론트 = 정면 뼈. 큰가시 고기의 머리 골격에 대한 자세한 설명은, (1974) 31하기 Anker를 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig1large.jpg" target="_blank">의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림. <ol><li> 물고기 평면 (그림 2A)을 놓고 눈을 덮고있는 막에 구멍을 위해 ~ 45 ° 각도로 눈의 측면에 날카로운 # 5 시계의 집게를 삽입합니다. </li><li> 거리 요구르트 뚜껑 (도 2b)을 박리 유사한 눈으로부터 막을 벗겨. </li><li> 눈 뒤에 열린 집게를 삽입 눈 뒤에있는 시신경을 붙잡고, 및 눈 (그림 2C)를 제거합니다. 이 멜라닌을 누출로 눈에 구멍을하지 마십시오. 구멍이있는 경우, 멜라닌 이후 단계에서 씻겨 할 수 있습니다. </li><li> 반대편에 반복합니다. </li><li> 후방에서 시작하여, opercle 플랩 아래에 하나의 작은 해부 가위 블레이드를 배치, 드래그 가위 블레이드는 등쪽 opercle 위, 그 다음 눈 소켓 (그림 2D)까지 연부 조직을 잘라. opercle 뼈에 지느러미를 잘라. </li><li> 정면 뼈 (눈 소켓에 지느러미) (그림 2E)을 잘라. </li><li> t 주위의 중간 선 parasphenoid 뼈를 잘라눈 소켓 (그림 2 층)의 그는 센터. </li><li> 반대 측의 반복 opercle 잘라. </li><li> opercle에서 집게를 삽입하고 천천히 여전히 (그림 2G - H)에 연결된 모든 연부 조직을 트리밍, 멀리 몸에서 얼굴을 떼어. 아가미 레이커의 첫 번째 행을 방해하지 않도록주의하십시오. <ol><li> 외부 피부 opercle, preopercle, subopercle 포함한 전체 설골 골격을하고, 핀셋으로 벗겨과 전방 두개 안면 골격 (치골, premaxilla 및 상악 포함한 전체 턱을 분리 할 때 중간 선 basihyal에서 양쪽에 ceratohyals를 분리 branchiostegal 광선 및 기본 지느러미와 복부 연골 요소와 코, 측면 사골을 포함한 두개골의 앞쪽 부분과 눈꺼풀 뼈)도 1 및도 2I를 참조하십시오. </li><li> 골반 쪽은 몸에서 밖으로 접을 수 있으며, 집게 보류 O를 잡아에 대한 핸들 역할을 할 수때 F 본. 등뼈는 제자리에 고정. 잠금을 해제하려면, 부드럽게 직접 거리에 물고기의 몸에서 집게로 척추를 당겨 부드럽게 물고기에 평평 척추를 눌러 뒤쪽으로 구부리십시오. </li></ol></li><li> 삽입 떨어져 아가미 골격 (- K 그림 2J)에 부착 된 나머지 근육과 인대를 괴롭 히고, 전방 및 드래그 집게 (단지 장 관 아래) 아가미 골격에 집게 후방과 복부를 마감했다. </li><li> 전방 방향 (그림 2L)에 후방에서 복부 braincase에 지느러미 아가미 골격을 부착 근육을 멀리 긁어, 닫힌 포셉의 팁을 사용. </li><li> 반대 측에 2.9와 2.10를 반복합니다. </li><li> 장내 튜브의 기반을 잡고 아가미 골격과 창자 관 (그림 2M - N)을 제거하기 위해 전방으로 잡아 당깁니다. </li><li> (다섯 번째 ceratobranchial의 끝에도 2O을 수직 절단 후방을 만들어 장내 튜브를 분리 </strong&gt;). </li><li> 아가미 골격의 등 쪽의 braincase에서 남아있는 뼈 조각을 제거한 후, 지느러미 치아 판의 양측 세트 사이에 지느러미 절단 (후방에 전방 절단) (- D 그림 3A)를 만들기 위해 아가미 바구니에 가위를 삽입합니다. 확인 컷은 지느러미 치아 판의 손상을 방지하기 위해 중앙에. </li><li> 아가미 골격 (그림 3E)를 개방을 지원하기 위해 아가미 골격 (창자 관의 앞쪽 끝)의 후방 끝 부분에있는 고무 장 루멘에서 두 개의 얕은 측면 상처를 확인합니다. </li><li> 물고기와 항아리에 모든 조직의 조각을 놓고 더 이상 청소가 필요하지 않은 경우 부드러운 청산, 또는 100 % 글리세롤을 계속 50 % 글리세롤, 0.25 %의 KOH와 microcentrifuge 관에 아가미 골격을 배치합니다. 고유 식별자와 라벨 항아리와 튜브는 그래서 그들은 추적 할 수 있습니다. 필요한 정화 량은 40m 이상 (대체로 물고기 큰 성어의 크기의 함수 인표준 길이 m)는 일반적으로 추가적인 청소가 필요합니다. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig2.jpg" /> 그림 2 :. 큰가 아가미 골격 해부 알리자린 레드 해부에 대한 큰가시 고기 생선 준비 스테인드. 눈은 광범위한 청산에서 탈색된다. 파란색 화살표는 동작 방향을 나타낸다. (A) 큰가 헤드의 측면도, 전방 우측이다. (B) 눈을 덮는 막 제거. 눈의 (C)를 ​​제거. (D) 지느러미는 opercle 위에 잘라. (E) 정면 뼈를 잘라. (F) Parasphenoid 절단. (G - I) 안면 골격의 제거. 복부 아가미 골격 연조직 연결 (J) 제거. (K - L) 등의 아가미 골격 연결 제거. (&lt;강한&gt; M - N) 아가미 골격의 제거. (O) 아가미 골격에서 장 튜브를 분리합니다. 자세한 내용은 단계 2.16 통해 2.1를 참조하십시오. 스케일 바 = 5 mm이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 3. 아가미 해골 다시 염색 (필요한 경우) <ol><li> 아가미 골격 어둡거나 명확한 조직을 더 얼룩, 50 % 글리세롤, 0.25 %의 KOH 용액을 제거하고 배 1 % KOH (플랫폼 통에 수평으로 흔들어 섞으면 두 번째 24 시간 세척 한 다음 1 ~ 5 분 세척)으로 씻는다. </li><li> 24 시간 동안 1 % KOH에서 0.008 % 알리자린 레드 S와 1 % KOH 다시 얼룩을 제거합니다. </li><li> 얼룩을 제거하고 24 시간 동안 1 % KOH로 교체합니다. </li><li> KOH 용액을 제거하고 50 % 글리세롤, 0.25 % KOH로 교체합니다. </li></ol> 4. 아가미 해골 장착 <ol><li> 아가미 골격을 제거등쪽면이 22mm X 60mm 유리 커버 슬립 하단 50 % 글리세롤, 0.25 % KOH 또는 100 % 글리세롤과 장소에서 (그림 3 층)이 위를 향. 아가미 골격 위에 50 % 글리세롤, 0.25 %의 KOH 또는 100 % 글리세롤 몇 방울을 추가한다. 미세 원심 관에 50 % 글리세롤, 0.25 % KOH 100 % 글리세롤, 변화 솔루션에서 전환과&gt; 5 분 전에 조직을 평형 설치에 흔들합니다. </li><li> 스페이서의 역할을 커버 슬립의 양쪽 끝에서 모델링 점토와 장소의 두 개의 작은 공을 굴립니다. </li><li> 느슨하게 앞쪽 아가미 골격 (그림 3G)를 평평하게하기에 충분한 압력으로 상단에 두 번째 coverslip에 배치합니다. </li><li> 껍질, 지느러미 치아 플레이트를 포함 왼쪽 지느러미 플랩을 열고 평평하고, 커버 슬립 (그림 3H) 사이에 슬라이드. </li><li> 오른쪽 지느러미 플랩 반복 기술과는 커버 슬립 (그림 3I)의 가장자리에서 떨어져 전체 아가미 골격을 누릅니다. <ol><li> 바꾸다기본적으로, 집게로 열린 두 지느러미 플랩을 잡고 조심스럽게 한 부드러운 움직임의 아가미 골격을 평평하게,에 coverslip에 배치합니다. </li><li> 중력은 아가미 골격가 다시 닫습니다 허용하지 않도록 또는 밖으로 측면 각 지느러미 쪽을 플레잉, 하나의 커버 슬립에 거꾸로 아가미 골격을 탑재합니다. 그런 다음 두 번째 22mm X 60mm 유리 커버 슬립으로 커버하고 준비를 반전. 참고 : 다른 장착 기술이 좋든 나쁘 든 각 개인에 대한 작업을하는 경향이있다. 각 시도하고 가장 편안한 느낌을 확인. </li></ol></li><li> 가볍게 아가미 골격을 유지하기에 충분 점토 공을 평평하게하기 위해 상단 커버 슬립에 평평하게 탑재 눌러하지만, 시료를 분쇄하지 않도록주의. <ol><li> 장착 과정 ceratobranchials는 회전 레이커 행을 가릴 수있다. 커버 슬립 다시 배향 ceratobranchials 또는 전체 아가미 골격 사이에 집게를 밀어이를 해결. </li></ol></li><li> 쇼핑몰 소유주에 슬라이드 트레이에 평평하게 준비합니다톰 온도. 100 % 글리세롤에 장착 준비합니다 적어도 십년 가교 된 커버 사이에 저장 될 수있다. 청소 집게, 이소프로판올, 에탄올 및 커버 팁 가위. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig3.jpg" /> 그림 3 :. 플랫 아가미 골격 조작을 장착하고 아가미 골격의 설치가 표시됩니다. 파란색 화살표는 동작 방향을 나타낸다. (A) 아가미 골격 등의 측면입니다. 지느러미 치아 판 사이 - (B D) 회전과 절개. 부드러운 조직 (E) 측면 컷은 또한 창자 관의 기반을 엽니 다. 설치를위한 준비 커버 슬립의 하단에 위치 (F) 아가미 골격. (지느러미 치아 플레이트 위) 아가미 골격의 앞쪽 절반에 위치 (G) 두 번째 커버 슬립. (H - I)지느러미 치아 판 플랩을 열고 두 커버 전표 사이에 밀어 아가미 골격의 평면 장착. 자세한 내용은 단계 4.6을 통해 4.1을 참조하십시오. 스케일 바 = 5 mm이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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분지 골격은 식도로 가는 음식을 조작, 여과 및 저작하는 물고기의 목구멍에 있는 복잡한 뼈 세트입니다. 아가미 갈퀴, 인두 치아 및 분지 뼈의 패턴을 포함한 많은 흥미로운 영양 특성은 종 간 및 종 내에서 다릅니다. 이러한 특성의 대부분은 제 자리에서 분지 골격(예: 아가미 레이커 길이, 분지 뼈 길이)으로 정확하게 측정하기 어렵거나 거의 불가능합니다. 이 평면 장착 프로토콜은 모든 분지 골격 요소를 간단한 2차원 평면에 배치하여 여러 특성의 이미징 및 정량화를 용이하게 합니다. 
이 프로토콜의 한 가지 한계는 이 평면 장착 2차원 준비 내의 치아, 아가미 갈퀴 및 대부분의 내연골을 쉽게 이미지화하고 정량화할 수 있지만 훨씬 더 많은 3차원 모양을 갖는 두 번째에서 네 번째 외분지는 쉽게 시각화되지 않으며 정확하게 측정하려면 추가 해부가 필요합니다. 이 프로토콜의 두 번째 한계는 이 방법이 어머리에 대한 파괴를 최소화한다는 것입니다. 그러나 접형골...

다양성의 놀라운 양이 특히 물고기들, 척추 동물 중 머리 골격에 존재합니다. 대부분의 경우 이러한 다양성은 다른 공급 전략 1 용이 - 4, 모두 외부 및 내부 두개 안면 패턴에 큰 변화를 포함 할 수있다. 아가미 골격은 물고기의 목에 내부에 위치하여 구강의 대부분을 둘러싸고있다. 아가미 골격은 아가미를 지원하는 전방 네있는 5 직렬로 동종 세그먼트로 구성되어 있습니다. 함께이 다섯 세그먼트는 물고기와 음식 (5) 사이의 인터페이스로 작동합니다. 아가미 레이커, 인두 이빨과 아가미 뼈를 포함하여 특성의 다수의 변화는 다양한 종류의 음식에 효율적 꼴에 기여한다. 큰가시 고기과는 북반구에 걸쳐 민물 호수와 시내 식민지 조상의 해양 양식 후 적응 방사선을받은. 다이어트의 변화민물에서 더 큰 먹이에 바다에서 작은 동물성 플랑크톤에서 여러 두개 안면 특성 (6)에 극적인 영양 변화를 가져왔다. 많은 연구가 큰가시 고기과 7 외부 두개 안면의 차이에 초점을 맞추고 있지만 - 13 중요한 두개 안면의 변화는 내부 아가미 골격에 반복적으로 진화. 형태 학적으로 구별 큰가시 고기 집단 사이의 비옥 한 하이브리드를 만들 수있는 능력은 아가미 골격에 진화 변화의 유전 적 기초를지도 할 수있는 좋은 기회를 제공한다. 생태 학적 의미 중 하나는 영양 특성은 아가미 레이커, 아가미 뼈의 전방 및 후방 얼굴 라인과 먹이 항목을 필터링하는 데 사용되는주기적인 피부 뼈의 패턴입니다. 일반적으로 작은 먹이 항목을 먹고 물고기는 더 이상 더 조밀하게 이격 아가미가 더 큰 먹이 14,15 먹이 물고기에 비해 레이커 경향이있다. 아가미 레이커의 변화가보고 된 적이 모두 within 종 14-19 사이, 그리고 아가미 레이커 패턴의 양상은 영양 틈새 시장 및 피트니스 (16)에 기여한다. 연구의 수십 년은 광범위하게 threespine 큰가시 고기과 (17)의 아가미 레이커 번호와 길이의 변화 문서화 - (21); 그러나, 이러한 연구는 일반적으로 아가미 레이커의 첫 번째 행에 초점을 맞춘다. 최근 작품은 하나 하나의 아가미 레이커가 이해하는 행보다 더 많은 공부의 중요성을 강조 (23)과 길이 (24) 간격 아가미 골격 (22, 23)에서와 아가미 레이커의 단일 행에 걸쳐 아가미 레이커 수의 유전자 제어 모듈을 보여 주었다 아가미 레이커 감소의 발달 유전 적 기초. 모두 생태 및 생물 의학 의미의 두 번째 영양 특성은 인두 치아의 패턴입니다. 물고기에서 치아 인두 이빨 공지 모두 경구 턱과 아가미 골격 중에 위치 할 수있다. 구강 치아 페이지에 주로 사용된다27 - 인두 치아 저작 및 먹이 조작 (25)에 사용하는 동안 레이 캡처. 두 세트는 공유 발달 메커니즘을 통해 형성과 상동 (28) 발달로 간주됩니다. 때때로 이러한 일부 제브라 피쉬, 부족으로 구강 및 인두 등의 치아 (29) 다른 종의 여러 톱니 ceratobranchials, pharyngobranchials있는 동안 같은 종, 그리고 basihyal 톱니와 30 hypobranchials있다 흥미 모듈화가 발생합니다. 큰가시 고기과에, 인두 치아 앞쪽에 다섯 번째 ceratobranchial과 등쪽에 복부 발견하고 후방은 31 pharyngobranchials 있습니다. 큰가시 고기 공급에 운동학은 구강 턱은 주로 먹이 캡처 및 인두 턱에 저작을 떠나 흡입 공급 (9)을 용이하게 사용됩니다 보여줍니다. 시클리드에서 하부 인두 턱 형태 극적 32,33를 가변 적응 및 영양 틈새 (34) 상관 관계가 밝혀졌다. 멀티PLE 담수 큰가시 고기의 인구는 복부 인두 치아 번호 23,35,36에서 극적인 증가를 진화했다. 최근 작업이 진화 치아 이득의 발달 유전 적 근거는 민물 큰가시 고기과 (36)의 두 개의 독립적으로 파생 된 인구에서 크게 구별 있음을 보여 주었다. 포유 동물의 치아와는 달리, 물고기는 성인 생활 (37)를 통해 지속적으로 자신의 치아를 재생. 이러한 전술 높은 치형 민물 인구 모두 재생 (36)의 유전 적 기초를 연구하는 희귀 척추 제공 시스템, 가속 보철물 속도 진화 해왔다. 민물 큰가시 고기과에 반복적으로 진화하고 세 번째 영양 특성은 더 이상 각각 38 epibranchial 및 ceratobranchial 뼈, 상부 및 하부 턱의 아가미 아치 분절 동족체이다. 긴 아가미 뼈는 더 큰 구강을 부여하고 가능성이 더 큰 먹이 항목을 다 할 수 있도록하기위한 적응이다onsumed. 또한, 다른 물고기에, epibranchial 뼈는 등쪽 인두 치아 플레이트 (25)의 우울증 중요하다. 아가미 레이커와 인두 치아처럼, 아가미 뼈는 쉽게 시각화 또는 정량화하기 어려운, 따라서 내부입니다. 여기에서 우리는 해부 자세한 프로토콜을 제시하고 중요한 두개 안면 특성의 다양한 쉽게 시각화 및 정량화를 허용, 아가미 골격을 평면 마운트합니다. 이 프로토콜은 큰가시 고기의 해부를 설명하지만,이 같은 방법은 다른 물고기의 다양한 작동합니다.

<table><tbody><tr><td>수산화칼륨 (KOH)</td><td>EMD</td><td>PX1480-1</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7893-4L</td><td></td></tr><tr><td>10% 중성 완충 포르말린(NBF)</td><td>Azer Scientific</td><td>NBF-4-G</td><td></td></tr><tr><td>알리자린 레드 S</td><td>EMD</td><td>AX0485-3</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 안경 22 mm x 60 mm</td><td>VWR</td><td>16004-350</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 10 mm 유리 페트리 Dish</td><td>Kimble Chase</td><td>23064-10010</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td>의 샘플을 해부하려면 <td>Ellsworth 접착제</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>을 유리 또는 플라스틱 페트리 접시에 부어 해부 플레이트를 만들 수 있습니다</td></tr><tr><td>. 모델링 Clay</td><td>Sargent Art</td><td>22-4000</td><td>1 lb 크림</td></tr><tr><td>섬광 바이알 (500 케이스)</td> <td>Wheaton</td><td>986586</td><td>붕규산 유리 나사 캡</td></tr><tr><td>펜크스-뒤몽 #5 이녹스 (생물학 팁)</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>듀모스타는 대체</td></tr><tr><td>해부 가위입니다&nbsp;</td><td>FST</td><td>15003-08</td><td>샘플의 크기에 따라 다른 크기를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica</td><td>S6E with KL300 LED</td> 다른 <td>많은 모델도 잘 작동하며 평평한 바닥을 갖는 것이</td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기 튜브 1.7 ml</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>판지 슬라이드 트레이</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td></td></tr></tbody></table>

해부와 큰가시 고기 아가미 해골의 평면 장착

Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton

척추동물 머리의 후인두 분절은 물고기의 식품 가공의 주요 부위인 분지 골격을 일으킵니다. 물고기 가지 골격의 형태는 종의 식단과 일치합니다. 삼가시 스틱백어류(Gasterosteus aculeatus)는 다양한 형질에서 진화된 차이의 유전적, 발달적 기초를 연구하기 위한 모델 시스템으로 부상했습니다. sticklebacks의 해양 개체군은 수많은 새로운 담수호와 개울을 반복적으로 식민지화했습니다. 이러한 담수 환경에서의 새로운 식단에 대한 적응은 독립적으로 파생된 담수 개체군에서 반복적으로 진화한 일련의 두개안면 변화의 기초가 될 수 있습니다. 여기에는 분지 골격에 대한 세 가지 주요 패턴 변화가 포함됩니다 : 아가미 갈퀴 뼈의 수와 길이 감소, 인두 치아 수의 증가, 분지 뼈 길이 증가. 여기에서는 threespine stickleback fish의 내부 가지 골격을 해부하고 평평하게 장착하는 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 전체 3차원 분지 골격을 해부하고 이를 대부분 2차원 준비물에 평평하게 장착하면 분지 골격 형태를 쉽게 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 이 해부 방법은 저렴하고 빠르며 비교적 쉬우며 다양한 어종에 적용할 수 있습니다. sticklebacks에서 이 효율적인 방법을 사용하면 유전자 교배에서 골격 형태를 정량화하여 두개안면 패터닝을 제어하는 게놈 영역을 매핑할 수 있습니다.

<html> 중요한 영양 특성의 다양한 정량화 할 수있는 해부와 평면 탑재 아가미 골격이 프로토콜 결과 (그림 4). 지느러미보기에서 아가미 레이커, 모든 인두 치아 판, 거의 모든 아가미 뼈의 모든 행은 쉽게 시각화, 22 정량화 할 수있다 - 24,35,36,38,42합니다. 알리자린 레드 S는 다른 마커 (예, 유전자 변형 GFP 42) 및 시각화하는 다른 방법으로 이중 라벨을 허용하는 로다 민 또는 유사한 적색 필터에 형광. 형광 이미징 또는 표현형을 계획하는 경우 형광은 어둠 속에서 상점 준비합니다, 그래서 빛 빨리 사라져요. 복부보기에서 아가미는 시각과 색소 침착 (43)를 정량화 할 수있다. 최상의 상태로 준비 년 동안 100 % 글리세린에 저장 될 수있다. <p class="jove_content" fo:k...

아가미 갈퀴, 인두 이빨, 분지 뼈를 포함한 분지 골격은 대부분의 물고기에서 식품 가공의 주요 부위 역할을 합니다. 여기에서는 이 내부 골격을 3척추 스틱백으로 해부하고 평평하게 장착하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 다른 다양한 어종에도 적용할 수 있습니다.

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology ...

이 실험 과정의 전반적인 목표는 가시갈치(Stickleback)의 아가미 골격을 해부하고 평면 마운트(flat-mount)하는 것입니다. 이 방법은 동물들이 새로운 환경에 어떻게 적응하는지, 그리고 성체 형태의 변이가 발달 과정 중에 어떻게 나타나는지와 같은 발달학, 유전학 및 진화 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 아가미 골격을 적출하여 평평하게 마운팅함으로써, 전체 마운트 상태에서는 연구할 수 없는 다양한 영양 특성들을 시각화할 수 있다는 점입니다. 준비 단계에서 가시볼락의 관련 머리 골격 형태를 검토하십시오. 해부를 위해 물고기를 준비한 후, 끝이 날카로운 5번 핀셋을 눈 옆에 45도 각도로 삽입하여 눈을 덮고 있는 막을 천공하는 것으로 시작하십시오.그런 다음, 요거트 용기 뚜껑을 열 때처럼 안구 막을 벗겨냅니다. 다음으로, 벌어진 포셉을 안구 뒤쪽으로 삽입하여 시신경을 잡고 안구를 제거합니다. 안구가 천공되어 멜라닌이 유출되지 않도록 주의하십시오.반대쪽 눈에 대해서도 이 과정을 반복합니다. 그런 다음, 작은 가위의 날을 아가미 덮개 플랩의 후측 아래에 놓고, 아가미 덮개 위쪽의 등쪽 연조직을 절개하여 안와 방향으로 자릅니다. 다음으로 안와 등쪽에 위치한 전두골을 절단합니다.그 다음, 안와 중심 부근의 접형골 중앙선을 따라 절개합니다. 반대편에서도 동일하게 덮개 절개를 반복합니다. 다음 단계에서는 골반 가시를 손잡이로 사용할 수 있습니다.몸체에서 직접 조심스럽게 잡아당겨 이를 펼칩니다. 이제 포셉을 오페르쿨룸(opercle) 아래에 삽입하고, 얼굴 부분을 몸체에서 천천히 벗겨냅니다. 이 과정에서 여전히 붙어 있는 연조직을 다듬어 제거합니다.새끔살(gill rakers) 주변에서 주의를 기울여 이를 손상시키지 않도록 하십시오. 안면 골격을 제거할 때 percoll과 함께 첫 번째 새끔살뼈(ceratobranchial bone)를 실수로 잡기 쉽습니다. percoll을 앞으로 벗겨낼 때 그 아래를 살펴 추가로 잡고 있는 것이 없는지 확인하십시오.이제 핀셋을 사용하여 정중선 기저설골(basihyal)의 양측에서 각설골(ceratohyals)을 분리하면서, 전두개 안면 골격을 벗겨내어 제거합니다. 반대편에서도 동일하게 반복합니다. 전두개 안면 골격에는 전체 턱, 전체 설골격, 그 하단의 등측 및 연골내 요소, 그리고 두개골의 전면부가 포함됩니다.다음으로, 닫힌 포셉을 소화관 바로 아래에 삽입하고 앞쪽으로 끕니다. 이 과정에서 아가미 골격에 부착된 나머지 근육과 인대들을 떼어냅니다. 그런 다음, 닫힌 포셉의 끝을 사용하여 배측 아가미 골격을 복측 뇌곽에 부착시키고 있는 근육들을 긁어내어 제거합니다.후방에서 전방 방향으로 긁어냅니다. 가시납치의 반대편에서도 근육 제거 과정을 반복합니다. 다음으로, 장관의 기저부를 잡고 전방으로 당겨 아가미 골격을 제거합니다.제5 세라토브랜키얼(ceratobranchial) 후방을 수직으로 절단하여 장관을 분리하십시오. 흔히 저지르는 실수는 장관을 너무 전방에서 잡는 것이며, 이 경우 복측 전면 관이 뒤에 남게 됩니다. 반드시 흉강의 후방 깊숙한 곳을 잡아야 하며, 남는 장관은 나중에 언제든지 제거할 수 있습니다.아가 골격의 등쪽 뇌갑에서 남아 있는 모든 뼈 파편을 제거한 후, 가위를 아가 바구니(branchial basket)에 삽입하고 양측 등쪽 치판(dorsal tooth plates) 사이의 등쪽을 절개합니다. 이때 등쪽 치판에 손상을 주지 않도록 절개 부위를 중앙에 유지하십시오.다음으로, 아가미 골격의 후단에 있는 고무질의 장강에 두 개의 얕은 외측 절개를 넣습니다. 아가미 골격을 여는 것을 돕기 위해 장관의 전단에도 절개를 넣습니다.이제, 완만한 투명화를 위해 50% glycerol과 0.25% potassium hydroxide가 담긴 마이크로 원심분리 튜브로 골격을 옮깁니다. 또는 추가적인 투명화가 필요하지 않은 경우 순수 glycerol로 옮깁니다. 재염색이 필요한 경우, 상세 내용은 텍스트 프로토콜에 기재되어 있습니다.마운트 준비를 위해 용액을 순수 글리세롤로 교체하고, 튜브를 최소 5분 동안 흔들어 줍니다. 그다음, 아가미 골격을 꺼내어 22 by 60 millimeter 유리 커버슬립의 하단 근처에 등 쪽이 위로 향하도록 놓습니다. 이제 골격 위에 글리세롤을 몇 방울 떨어뜨립니다.다음으로, 모델링 점토를 작은 공 모양으로 두 개 만들어 커버슬립의 양 끝에 각각 배치하여 스페이서로 사용합니다. 그런 다음, 전방 아가미 골격이 평평해질 정도의 압력을 가하여 두 번째 커버슬립을 준비물 위에 느슨하게 덮습니다. 이제 배측 치판을 포함한 왼쪽 배측 플랩을 조심스럽게 들어 올려, 두 커버슬립 사이에 플랩을 밀어 넣습니다.그런 다음 오른쪽 등쪽 플랩에도 동일하게 수행합니다. 그리고 아가미 골격 전체를 커버슬립 가장자리에서 멀리 밀어냅니다. 절차를 마무리하려면 상단 커버슬립을 가볍게 눌러 점토 구슬을 납작하게 만듭니다.아가 골격이 평평하게 고정될 정도만 가해하십시오. 다만, 골격이 으스러질 정도로 과하게 누르지 않도록 주의하십시오. 과정 중 갈퀴(raker)의 일부가 가려지면, 커버글라스 사이에 핀셋을 넣어 새鳃궁(ceratobranchial)이나 표본 전체의 방향을 다시 조정하십시오.순수 글리세롤로 평면 마운팅(flat mount)하면, 준비물을 실온에서 최소 10년 동안 평면 상태로 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜을 통해 아가미 골격을 해부하고 평면 마운팅할 수 있으며, 이를 통해 다양한 중요한 영양 특성들을 시계열적으로 기록할 수 있습니다.등면에서 보았을 때, 모든 아가미 갈퀴 열, 모든 인두치판 및 거의 모든 새궁뼈를 쉽게 시각화하고 연령을 측정할 수 있습니다. Alizarin red S는 로다민 또는 유사한 적색 필터에서 형광을 발하므로, 다른 마커를 이용한 이중 표지 및 대안적인 시각화 방법이 가능합니다. 이 이미지에서 아가미 갈퀴는 캐럿 기호(^)로 표시되어 있습니다.치아는 화살표 머리로, 뼈는 별표로 표시하였습니다. 숙련되면 이 해부는 몇 분 만에 완료할 수 있으며, 수백 마리의 동물을 대상으로 비교적 빠르게 수행할 수 있습니다. 본 영상에서는 가시송곳돔의 아가미 골격 해부를 시연하였으나, 이 절차가 다양한 어종에 대한 가이드로 활용되기를 바랍니다.아가 골격을 해부함으로써, 전체 마운트(whole mount)에서는 보이지 않는 다양한 중요한 영양 특성들을 빠르고 쉽게 시각화할 수 있습니다. 이는 두개안면 골격의 발달과 진화를 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다.

dissection-flat-mounting-threespine-stickleback-branchial

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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