해부와 큰가시 고기 아가미 해골의 평면 장착

이 실험 과정의 전반적인 목표는 가시갈치(Stickleback)의 아가미 골격을 해부하고 평면 마운트(flat-mount)하는 것입니다. 이 방법은 동물들이 새로운 환경에 어떻게 적응하는지, 그리고 성체 형태의 변이가 발달 과정 중에 어떻게 나타나는지와 같은 발달학, 유전학 및 진화 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 아가미 골격을 적출하여 평평하게 마운팅함으로써, 전체 마운트 상태에서는 연구할 수 없는 다양한 영양 특성들을 시각화할 수 있다는 점입니다. 준비 단계에서 가시볼락의 관련 머리 골격 형태를 검토하십시오. 해부를 위해 물고기를 준비한 후, 끝이 날카로운 5번 핀셋을 눈 옆에 45도 각도로 삽입하여 눈을 덮고 있는 막을 천공하는 것으로 시작하십시오.

그런 다음, 요거트 용기 뚜껑을 열 때처럼 안구 막을 벗겨냅니다. 다음으로, 벌어진 포셉을 안구 뒤쪽으로 삽입하여 시신경을 잡고 안구를 제거합니다. 안구가 천공되어 멜라닌이 유출되지 않도록 주의하십시오.

반대쪽 눈에 대해서도 이 과정을 반복합니다. 그런 다음, 작은 가위의 날을 아가미 덮개 플랩의 후측 아래에 놓고, 아가미 덮개 위쪽의 등쪽 연조직을 절개하여 안와 방향으로 자릅니다. 다음으로 안와 등쪽에 위치한 전두골을 절단합니다.

그 다음, 안와 중심 부근의 접형골 중앙선을 따라 절개합니다. 반대편에서도 동일하게 덮개 절개를 반복합니다. 다음 단계에서는 골반 가시를 손잡이로 사용할 수 있습니다.

몸체에서 직접 조심스럽게 잡아당겨 이를 펼칩니다. 이제 포셉을 오페르쿨룸(opercle) 아래에 삽입하고, 얼굴 부분을 몸체에서 천천히 벗겨냅니다. 이 과정에서 여전히 붙어 있는 연조직을 다듬어 제거합니다.

새끔살(gill rakers) 주변에서 주의를 기울여 이를 손상시키지 않도록 하십시오. 안면 골격을 제거할 때 percoll과 함께 첫 번째 새끔살뼈(ceratobranchial bone)를 실수로 잡기 쉽습니다. percoll을 앞으로 벗겨낼 때 그 아래를 살펴 추가로 잡고 있는 것이 없는지 확인하십시오.

이제 핀셋을 사용하여 정중선 기저설골(basihyal)의 양측에서 각설골(ceratohyals)을 분리하면서, 전두개 안면 골격을 벗겨내어 제거합니다. 반대편에서도 동일하게 반복합니다. 전두개 안면 골격에는 전체 턱, 전체 설골격, 그 하단의 등측 및 연골내 요소, 그리고 두개골의 전면부가 포함됩니다.

다음으로, 닫힌 포셉을 소화관 바로 아래에 삽입하고 앞쪽으로 끕니다. 이 과정에서 아가미 골격에 부착된 나머지 근육과 인대들을 떼어냅니다. 그런 다음, 닫힌 포셉의 끝을 사용하여 배측 아가미 골격을 복측 뇌곽에 부착시키고 있는 근육들을 긁어내어 제거합니다.

후방에서 전방 방향으로 긁어냅니다. 가시납치의 반대편에서도 근육 제거 과정을 반복합니다. 다음으로, 장관의 기저부를 잡고 전방으로 당겨 아가미 골격을 제거합니다.

제5 세라토브랜키얼(ceratobranchial) 후방을 수직으로 절단하여 장관을 분리하십시오. 흔히 저지르는 실수는 장관을 너무 전방에서 잡는 것이며, 이 경우 복측 전면 관이 뒤에 남게 됩니다. 반드시 흉강의 후방 깊숙한 곳을 잡아야 하며, 남는 장관은 나중에 언제든지 제거할 수 있습니다.

아가 골격의 등쪽 뇌갑에서 남아 있는 모든 뼈 파편을 제거한 후, 가위를 아가 바구니(branchial basket)에 삽입하고 양측 등쪽 치판(dorsal tooth plates) 사이의 등쪽을 절개합니다. 이때 등쪽 치판에 손상을 주지 않도록 절개 부위를 중앙에 유지하십시오.

다음으로, 아가미 골격의 후단에 있는 고무질의 장강에 두 개의 얕은 외측 절개를 넣습니다. 아가미 골격을 여는 것을 돕기 위해 장관의 전단에도 절개를 넣습니다.

이제, 완만한 투명화를 위해 50% glycerol과 0.25% potassium hydroxide가 담긴 마이크로 원심분리 튜브로 골격을 옮깁니다. 또는 추가적인 투명화가 필요하지 않은 경우 순수 glycerol로 옮깁니다. 재염색이 필요한 경우, 상세 내용은 텍스트 프로토콜에 기재되어 있습니다.

마운트 준비를 위해 용액을 순수 글리세롤로 교체하고, 튜브를 최소 5분 동안 흔들어 줍니다. 그다음, 아가미 골격을 꺼내어 22 by 60 millimeter 유리 커버슬립의 하단 근처에 등 쪽이 위로 향하도록 놓습니다. 이제 골격 위에 글리세롤을 몇 방울 떨어뜨립니다.

다음으로, 모델링 점토를 작은 공 모양으로 두 개 만들어 커버슬립의 양 끝에 각각 배치하여 스페이서로 사용합니다. 그런 다음, 전방 아가미 골격이 평평해질 정도의 압력을 가하여 두 번째 커버슬립을 준비물 위에 느슨하게 덮습니다. 이제 배측 치판을 포함한 왼쪽 배측 플랩을 조심스럽게 들어 올려, 두 커버슬립 사이에 플랩을 밀어 넣습니다.

그런 다음 오른쪽 등쪽 플랩에도 동일하게 수행합니다. 그리고 아가미 골격 전체를 커버슬립 가장자리에서 멀리 밀어냅니다. 절차를 마무리하려면 상단 커버슬립을 가볍게 눌러 점토 구슬을 납작하게 만듭니다.

아가 골격이 평평하게 고정될 정도만 가해하십시오. 다만, 골격이 으스러질 정도로 과하게 누르지 않도록 주의하십시오. 과정 중 갈퀴(raker)의 일부가 가려지면, 커버글라스 사이에 핀셋을 넣어 새鳃궁(ceratobranchial)이나 표본 전체의 방향을 다시 조정하십시오.

순수 글리세롤로 평면 마운팅(flat mount)하면, 준비물을 실온에서 최소 10년 동안 평면 상태로 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜을 통해 아가미 골격을 해부하고 평면 마운팅할 수 있으며, 이를 통해 다양한 중요한 영양 특성들을 시계열적으로 기록할 수 있습니다.

등면에서 보았을 때, 모든 아가미 갈퀴 열, 모든 인두치판 및 거의 모든 새궁뼈를 쉽게 시각화하고 연령을 측정할 수 있습니다. Alizarin red S는 로다민 또는 유사한 적색 필터에서 형광을 발하므로, 다른 마커를 이용한 이중 표지 및 대안적인 시각화 방법이 가능합니다. 이 이미지에서 아가미 갈퀴는 캐럿 기호(^)로 표시되어 있습니다.

치아는 화살표 머리로, 뼈는 별표로 표시하였습니다. 숙련되면 이 해부는 몇 분 만에 완료할 수 있으며, 수백 마리의 동물을 대상으로 비교적 빠르게 수행할 수 있습니다. 본 영상에서는 가시송곳돔의 아가미 골격 해부를 시연하였으나, 이 절차가 다양한 어종에 대한 가이드로 활용되기를 바랍니다.

아가 골격을 해부함으로써, 전체 마운트(whole mount)에서는 보이지 않는 다양한 중요한 영양 특성들을 빠르고 쉽게 시각화할 수 있습니다. 이는 두개안면 골격의 발달과 진화를 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다.