Name: 당뇨병 각막에 대한 아데노 바이러스 유전자 치료 : 인간 장기 배양 각막 및 윤부 상피 세포에 상처 치유에 효과 및 세포 마커의 발현 줄기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 배우세요 인간 당뇨 각막에서 아데노바이러스 유전자 치료를 이용한 상처 치유 정상화 및 상피 줄기세포 마커 발현 회복 방법. 이 기술은 각막 질환 치료에 활용됩니다.

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NIH/NEI R01 EY13431(AVL), CTSI 보조금 UL 1RR033176(AVL) 및 재생 의학 연구소, Cedars-Cedars Medical Center의 보조금의 재정 지원에 감사드립니다.

국립 질병 연구 교환 (NDRI, 필라델피아, PA는) 합의 된 사후 건강하고 당뇨병 인간의 눈과 각막을 공급했다. NDRI의 인체 조직 수집 프로토콜은 건강 감독의 국립 연구소에 경영위원회와 제목에 의해 승인된다. 이 연구는 승인 된 시더 - 시나이 의료 센터 임상 시험 심사위원회 (IRB) 면제 프로토콜 EX-1055에 따라 진행되고있다. , 박사를 각막 외과 공동. E. Maguen와 Y 라 비노 위츠는 줄기 세포가 풍부한 각막 상피​​ 문화의 분리를 위해 폐기 공막 바퀴를 공급했다. 이 연구는 승인 된 IRB 프로토콜 Pro00019393에서 진행되고있다. 1. 인간 각막 오르간 문화 참고 : 정상과 당뇨병 각막 또는 전부의 눈은 냉장 각막 저장 매체에 수신 (예를 들어, Optisol GS) 국가 공급 업체 NDRI 사망 후 48 시간 이내에. <ol><li> 집게와 저장 용기에서 각막을 제거하고 난 그들을 두 번 씻어n은 항생제 항진균제 (ABAM) 혼합물. 전체 눈의 경우, 곡선 가위로 글로브에서 각막을 잘라. 적어도 5mm 결막 림을두고도 ABAM의 각막을 씻는다. </li><li> 각막 오목 부에 배치 할 수있는 혼합물을 제조한다. 이는 혈청의 최소 필수 배지 (MEM)를 포함 ABAM 1 밀리그램 / (0.1 N 아세트산 10 ㎎ / ㎖의 스톡 용액으로부터 제조) 용액 송아지 피부 콜라겐, 1 % 한천, 인슐린 - 트랜스페린 - 셀렌 이루어져 (7)을 보충합니다. </li><li> 전자 레인지 살균과 한천 용해 비등이 혼합물. 모든 용해하는 것은 1 분까지 걸릴 수 있습니다. 끓을 때 혼합물이 쉽게 오버 플로우 때문에 부분적으로 개방 된 튜브의 캡을 둡니다. 이러한 이유로, 여러 사이클 비등 10-15 초 동안 각각 필요할 수있다. 37 ~ 39 ° C의 혼합물을 냉각. </li><li> 멸균 60mm 요리에 각막을 아래로 상피면을 놓습니다. 1.2에 설명 된 혼합물의 약 0.5 ml의와 각막 오목를 입력합니다. 그만큼혼합물을 2 분 이내에 각막에 굳은. </li><li> 아래로 멸균 60 mm 요리의 각막을 한천 측면을 놓고 ABAM와 MEM을 포함하는 전체 매체를 추가하고, 인슐린 트랜스페린 - 셀렌 보충 7 (37 ° C)는 공기 - 액체 인터페이스 문화에 대한 윤부에서 대략 그 수준을 유지. 중간 볼륨은 접시 당 7-8 ml 인 것을. </li><li> 물 팬과 가습 5 % CO 2 배양기로 각막과 접시를 놓고 35 ° C (정상 각막 온도)에서 (이런 식으로, 습도 레벨 또는 95 % 이상으로 유지된다). 각막을 습하게하는 상피 세포에 매일 100 ㎕의 매체 (2 방울)를 추가합니다. </li><li> 각막 형태 및 4X의 목적으로 표준 현미경을 사용하여 전송 된 빛 아래 현미경 상피 세포 생존을 모니터링합니다. 하루 그래서 한 번 수행합니다. </li><li> 3 일 매체를 변경합니다. 각막는 적어도 3 주 동안 배양 될 수있다. 3~5일 유전자 치료 실험 배양 각막 다음 transduc관심 (4.1-4.4)의 유전자를 가진 전자는 상처 치유 프로토콜 (2.1-2.4)에 형질 전환 유전자 및 피사체에 따라 다른 3-5일 떠난다. </li></ol> 2. 상피 상처 치유 주 : 허약 상피 기저막이 정상 각막에서 발생하지 않는 프로세스에서 분리되기 때문에, 당뇨병 각막, 기계적 연삭에 의한 상피 조직 제거가 가능하지 않다. 따라서, 상처 치유와 유사한 조건 하에서 정상 및 당뇨병 각막을 유지하기 위해, N 헵탄과 상피의 화학적 제거는 19을 사용한다. 이 절차는 상피를 제거하지만 모두 정상 및 당뇨 각막에 손상 기저막 뒤에 떠난다. <ol><li> 중앙 상피 변연 절제술 (20)를 수행하려면, 75 초 동안 중심 각막 전방 표면에 n 형 헵탄에 적신 5mm 여과지 디스크를 넣습니다. </li><li> 필터를 제거하고 전체 매체의 각막을 씻는다. 0.5 ml의 한천 - 콜라겐과 오목 채우기1.4에서와 같이 혼합물과 문화. 변연 절제술 후 상피 세포는 일반적으로 죽고 현미경 그대로 기저막 (7)를 뒤에 남겨 내놓고. </li><li> 만 윤부 유전자 치료와 실험에 큰 상피 상처를 만들기 위해 8.5 mm 디스크를 사용합니다. 이는 치유 과정에서 윤부 줄기 세포의 참여를 확인한다. </li><li> 현미경으로 각막 치유를 모니터링합니다. 상피 결함이 완전히 치유 될 때까지 매일 4 배 및 10 배에서 사진을 확인합니다. 치유 과정은 (정상 또는 당뇨병) 상태와 상처 크기에 따라 2 ~ 15 일 걸릴 수 있습니다. 참고 치유 과정 동안 흑색 거미 유사 세포가 정상 초점면에서 관찰된다. 이 세포는 상피 제거 4 사망 사멸 간질 간질하다. 치유는 이러한 죽은 세포는 치유 상피 세포에 의해 자란 없습니다 더 이상 볼 (그림 2, 삽입) 때 완료된 것으로 결정된다. </li><li> 치료 후완성은 반으로 각막을 잘라 저온 유지 장치 섹션에 간접 면역 형광 또는 웨스턴 블롯 16,21에 대한 간섭 단층 화합물 및 프로세스를 포함. </li></ol> 줄기 세포 농축 문화의 윤부 세포 및 유지 보수 3. 분리 참고 : 공막 림에서 기본 윤부 상피 줄기 세포 (LESC) 풍성 문화를 준비합니다. 각막 이식은 표준 각막 저장 매체 (예를 들어, Optisol)의 협력 외과 의사로부터받은 후 건강한 기증자에서 나오는 폐기 림. 그렇지 않으면, LESC 농후 배양 정상 및 당뇨병 전체 각막로부터 절단 테두리로부터 얻어 질 수 있거나 각막 기억 매체로부터 수신 NDRI 글로브. <ol><li> 전체 각막 또는 글로브가 사용되는 경우, 먼저 윤부 영역을 격리. 이렇게하려면, 상피면 멸균 플라스틱 접시에 각막을 배치하고 9 mm의 트레 (원형 각막 칼)와 중앙 영역을 제거합니다.이 중앙 부분을 폐기하십시오. 그런 다음 13mm의 트레를 사용하여 윤부 영역을 절제하고 외부 결막 부분을 폐기합니다. 분리하는 세포는 베이글과 같은 윤부 림을 사용합니다. 세포 분리 전에 멸균 면봉으로 표면 상피 반대 각막의 내측으로부터 내피 세포와 홍채 부착 잔재를 제거한다. </li><li> 디스 파제 처리를 사용하여 각막 윤부 세포 시트를 분리합니다. 2 시간 22 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 1.5 ㎖의 각질 세포를 무 혈청 배지 (KSFM) 2.4 U / mL의 디스 파제 II와 함께 각 공막 림 부화. </li><li> 부드럽게 집게 해부 스테레오 현미경 림 오프 윤부 상피 세포 시트를 용이하게하고, 0.25 % 트립신 1 ㎖로 세포를 해리 - 실온에서 30 분 동안 0.02 %의 EDTA 용액. </li><li> 매체 (예 Epilife) 10ml에 세포를 세척하고 실온에서 5 분간 탁상용 원심 분리기 (300)에서 그들을 XG 펠렛. </li><li> 재현 탁 일배양 배지에서 세포 E : N2, B27과 인간 각질 세포 성장 보충제, 10 ng / ml의 상피 세포 성장 인자 (EGF)와 매체. </li><li> KSFM에서 0.5 μg의 / cm 2에서 피브로넥틴, 유형 IV 콜라겐, 라미닌 (FCL)을 포함한 인간 기저막 단백질의 혼합물로 코팅 된 플라스크 3,000-5,000 세포 / ml 또는 60mm 접시에서 세포를 종자 매질. </li><li> 배양은 37 ℃에서 습윤 (95 % 이상의 습도) CO 2 인큐베이터에서 세포는 완전히 융합 단층을 형성 할 때까지. 이 1 ~ 2 주 정도 소요될 수 있습니다. 참고 : 정기적으로 PAX6, 각질 (K) 14, K15, K17, 및 ΔNp63α를 포함하여 추정 LESC 마커에 대한 긍정적 인 면역 세포 화학 염색에 의한 세포의 신원을 확인합니다. 차 항체를 포함하는 염색 세부 사항은 8,16-18,22을 발표했다. </li><li> 37 ° C에서 10 분 동안 (0.25 % 용액 5 희석 1) 세포 합류 통로, 1 ㎖의 0.05 % 트립신 용액을 처리한다. 5 ml의 대두 그럴 추가3.5과 매질 (4) 및 원심 셀 : ypsin 억제제 용액 (/ ㎖의 10 ㎎)을 1 희석. </li><li> 희석 된 대두 트립신 억제제 용액 3 ml의 세포 펠렛을 세척 하였다. 2 × 104 세포 / ml에서 FCL 피복 상 세포 (3.7 참조) 또는 유리 접시 챔버 슬라이드 접시. </li></ol> 장기 배양 각막 4. 아데노 바이러스 형질 도입 참고 : 재조합 아데노 바이러스 (AV)는 AV-벡터 (어떤 유전자가 삽입되지 ()는 C-충족 유전자 오픈 리딩 프레임), AV-cmet (MMP-10의 shRNA)와 AV-shM10 및 AV-shCF 포함 ( shRNA를 포함) F를 카 텝신합니다. 그들은 큰 즉각적인 초기 사이토 메갈로 바이러스 프로모터의 조절하에 유전자를 발현 E1 / E3 결실 형 5 AV이다. 는 AV-cmet 바이러스는 AV 벡터 패드 / CMV / V5-DEST (16)를 사용하여 생성됩니다. 는 AV-shRNA를 바이러스는 사용자 정의 복제 - 무능한 (-E1 / -E3) 구호 물자로 iLenti-EGFP 벡터에서 H​​H1 프로모터 및 GFP 태그 시퀀스와 함께의 shRNA 서열의 서브 클로닝에 의해 생성되는n 개의 AV 형 아데노 4 발현 시스템 (17)을 사용하여 5 게놈. <ol><li> 유전자 발현 변조 AV와 AV-벡터와 다른 각막과 각 쌍 중 하나 장기 배양 각막을 형질 도입. 24 잘 접시의 잘의 매체면에서 각각 각막을 유지 37 ℃에서 48 시간 동안 배양 배지에서 각막 당 0.8 8 10 × 1.25 플라크 형성 단위 (PFU)에서 AV-cmet를 사용합니다. 각막 당 1-2 × 10 8 PFU에서 AV-shRNA를 바이러스를 사용합니다. </li><li> 75 μg의 / ㎖ 실데나필 시트 레이트 보충 전체 매체에 전달에 대한 바이러스를 사용합니다. 이 시약은 상피 세포 (21)에 의해 바이러스의 흡수를 촉진 카베 올린 전송을 활성화합니다. 때문에 수용액에서 비아그라의 짧은 반감기로, 나중에 매체 4-5 시간에 동일한 금액을 다시 추가 할 수 있습니다. 표준 치료는 48 시간입니다. </li><li> 윤부에서 중간 수준을 유지 AV 않고 중간에 둥근 끝 멸균 주걱과 문화와 새로운 요리에 각막을 전송합니다. 추가 후itional 액체 - 공기 계면에서 4~8일, 공정 상피 상처 치유에 대한 다양한 분석 또는 시험을위한 AV 처리 각막 (위 참조). 정기적으로 각막의 상단에 100 μl의 매체 (2 방울)를 추가하여 문화 동안 각막을 적시고. </li><li> 만 윤부 세포의 형질 도입의 경우, 중앙 상피의 전달을 피하기 위해, 윤부에서 중간 수준의 공기 - 액체 계면에서의 각막과 바이러스를 배양한다. </li></ol> 배양 된 윤부 세포의 5 아데노 바이러스 형질 도입 <ol><li> 0.5 μg의 / cm 2에서 FCL 혼합물로 코팅 된 플라스틱 접시에 10 NG / ㎖ EGF와 매체에 LESC 농후 배양 (3.5 참조)를 유지한다. </li><li> 녹색 형광 단백질 유전자 (AV-GFP) 또는 AV 스크램블 감염 다중도의 범위에서 shRNA를-GFP를 (: 1-300 PFU / 세포 MOI)를 형질는 AV와 70-80%에 포화 상태에 도달 한 배양 세포를 형질 도입 2 NG / ㎖ EGF와 매체이다. transductio를 수행N, 0.5 mL의 배지에서 20 시간 뒤에 최소 부피 (0.2 ml) 중, 37 ℃에서 4 시간 동안. 카베 올린 반송 활성제 실데나필은 세포 배양 전달을 위해 필요하지 않다. </li><li> 중 폴리 양이온 (1 μg의 / ㎖ 폴리 -L- 리신, 5 μg의 / ㎖ 폴리 브렌) 또는 6 μL / mL를 전달 시약 (다음 AV 전달 효율을 향상시키기 위해 세포 표면에 결합하는 AV 용이 다음의 시약을 사용하여 예 ViraDuctin) 20 μL / mL를 전달 증강제 (예 ibiBoost). </li><li> 는 AV없이 하나 배지를 교체 한 후, 가습 된 CO2 인큐베이터에서 4 일 동안 배양 한 세포를 부화 및 반전 형광 현미경을 이용하여 GFP 발현 수준을 평가한다. </li><li> 는 AV-형질 문화에서 세포 이동을 평가하기 위해 스크래치 상처 치유 분석을 사용합니다. 멀티 웰 챔버 슬라이드에 세포를 성장. 200 μL의 PI와 함께 선형 직선 운동으로 세포를 긁어서 단층의 상처 만들기pette 팁. 부상 후, 분리 된 세포를 제거하는 새로운 하나의 매체를 변경합니다. </li><li> 4X 배율 거꾸로 현미경에 부착 된 디지털 카메라로 매일 상처 사진. 치료가 완료 될 때 시간을 기록 (상처 가장자리 전체 상처 따라 접촉). </li></ol>

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저자는 금전적 이익을 선언하지 않습니다.

각막 인해 유전자 전달뿐만 아니라 효과와 부작용의 평가가 쉽게 그 표면 위치를 유전자 요법을위한 이상적인 조직 것으로 보인다. 그러나,이 방법의 강력한 임상 번역으로 인해 유전 각막 질환의 원인 및 유전자 치료 대상 24 부족한 정보를 여전히 느리다. 각막 변경을 포함하는 당뇨병 합병증은 신진 대사 메모리 (9)로 번역 자연의 대부분 성적인 될 수있다. 그 때문에, 당뇨병 조직 및 세포는 생체 외에서 그 이상을 유지하고, 장기 및 조직 배양에서 연구 될 수있다. 또한, 당뇨병 환자는 유전자 치료에 의해 보정 될 수있는 유전자 발현 수준 및 패턴의 특정 변화를 야기한다. 우리가 정상화 각막 기관 배양 7,8 줄기 세포 구획 5,6,8 포함한 당뇨병 각막 상피에서 변경 여러 마커를 식별하고 사용했다유전자 치료 마커 발현과 당뇨 각막 상피​​ 손상된 상처 치유. 우리 때문에 강한 유전자 ...

당뇨병 각막 질환은 주로 퇴행성 상피 (각막)과 신경 (신경 병증) 변경을 초래한다. 그것은 종종 상피 상처 치유 및 각막 신경의 감소 1-4의 이상에 의해 명시된다. 추정 60-70%의 당뇨병 환자는 다양한 각막 문제 1,3- 있습니다. 우리의 연구는 변경된 C-충족 원 종양 유전자 (proto-oncogene) (간세포 성장 인자 수용체)의 하향 조절을 포함하여 인간 당뇨병 각막에서의 발현 및 매트릭스 메탈-10 (MMP-10) 및 카 텝신 F (5, 6)의 상향 조절 여러 마커 단백질을 확인 하였다. 또한 상당히 설명 인간 당뇨병 각막 여러 추정 상피 줄기 세포 마커의 발현이 감소하고있다. 이전의 연구에서는 당뇨병 느린 상처 치유를 보여준다 인간 당뇨병 각막 기관 배양 시스템을 사용하여, 당뇨병 변경 마커의 수준을 정상화 아데노 바이러스 계 유전자 치료제를 개발마커의 변화 및 생체 각막 -7,8- 유사한 세포 마커의 발현 감소 줄기. 변경이 지속성은 후생 유전 학적 대사 메모리 (9)의 존재로 인해 나타납니다. 이 문화 시스템은 유전자 치료에 대한 더 사용했다. 이 치료의 목표는 당뇨병 각막 (C-충족 프로토 종양 유전자) 또는 발현 증가 (MMP-10, 카 텝신 F)에서 감소 된 표현 중 하나와 마커에서 선택되었다. 아데노 바이러스 (AV) 치료는 전체 장기 배양 각막 또는 만 공막 윤부 주변 구획에 사용 하였다. 이 구획은 각막 상피를 갱신 적극적 4,10-15 상처 치유에 참여 상피 줄기 세포 항구. 여기에서, 프로토콜은 정상과 당뇨병 인간의 각막 기관 배양 상피 상처 치유, 분리 및 줄기 세포 농축 윤부 세포 배양의 특성, 및 아데노 바이러스 세포와 각막 전달 제공됩니다. 우리의결과는 향후 이식 당뇨 각막에 마커 표현과 상처 치유를 정규화이 치료의 가능성을 보여줍니다. 또한 병용 치료는 당뇨병, 각막 16-18 정상 마커 패턴 상피를 복원 할 수있는 가장 효과적인 방법임을 시사한다.

<table><tbody><tr><td>최소 필수 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>Optisol-GS&nbsp;</td><td>바우쉬 & Lomb</td><td>50006-OPT</td><td></td></tr><tr><td>ABAM 항생제-항진균 혼합물</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>송아지 피부 콜라겐&nbsp;</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>한천, 조직 배양 등급</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>n-헵탄올</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>72954-5ML-F</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 컴파운드&nbsp;</td><td>VWR 인터내셔널</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II&nbsp;</td><td>Roche Applied Science</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>각질 세포 무혈청 배지(KSFM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>칼슘이 함유된 EpiLife 배지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MEPI500CA</td><td></td></tr><tr><td>N2 배지 보충제, 100x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 배지 보충제, 50x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>인간 각질 세포 성장 보충제, 100x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-001-5</td><td></td></tr><tr><td>트립신 0.25% - EDTA 0.02% 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>트립신 0.25% 페놀 레드 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>15050065</td><td></td></tr><tr><td>대두 트립신 억제제&nbsp;</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>T6414</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>인슐린-트랜스페린-셀레나이트 보충제 (ITS)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>I3146-5ML</td><td></td></tr><tr><td>케라틴 14</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53253</td><td></td></tr><tr><td>케라틴 15</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47697</td><td></td></tr><tr><td>케라틴 17</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-58726</td><td></td></tr> 항체 <tr><td>&Delta; NP63&알파;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8609</td><td></td></tr><tr><td>PAX6</td><td>BioLegend</td><td>PRB-278P-100</td><td></td></tr><tr><td>항체 nidogen-1</td><td>R& D Systems</td><td>MAB2570</td><td></td></tr><tr><td>인테그린 &알파에 대한 항체; 3&베타; 1</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1992</td><td></td></tr><tr><td>인간 피브로넥틴</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>인간 라미닌</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L4445</td><td></td></tr><tr><td>인간 유형 IV 콜라겐</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td></td> MMP-10 shRNA Capital BioSciences를 발현하는 C6745-1ML <td></td></tr><tr><td>아데노바이러스</td><td></td><td></td> cathepsin F를 발현하는 맞춤형 아데노바이러스 shRNA Capital BioSciences 스크램블 shRNA를 발현하는 맞춤형 아데노바이러스 및 GFP Capital BioSciences의 c-met OriGene(플라스미드)을 발현하는 맞춤형 아데노바이러스SC323278 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아데노바이러스 발현 GFP</td><td>KeraFAST</td><td>FVQ002</td><td></td></tr><tr><td>실데나필 시트레이트, 25 mg</td><td>Pfizer</td><td>, 약국</td><td></td></tr><tr><td>표피 성장 인자에서&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>폴리브레네</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>ViraDuctin</td><td>Cell Biolabs</td><td>AD-200</td><td></td></tr><tr><td>ibiBoost</td><td>ibidi, Germany</td><td>50301</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Corning 라운드 엔드 주걱&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 페트리 접시</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>174888</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II 멀티웰 챔버 슬라이드&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>C6807</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l 피펫 팁</td><td>Bioexpress</td><td>P-1233-200</td><td>다른 공급업체에서 사용 가능한</td></tr><tr><td>도립 현미경&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Diaphot</td><td>기타 공급업체/모델 사용 가능</td></tr><tr><td>가습 CO2 인큐베이터&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>370 (Steri-Cycle)</td><td>사용 가능한 다른 공급업체/모델 형</td></tr><tr><td>광 현미경</td><td>Olympus, 일본</td><td>BX-40</td><td>기타 공급업체/모델 사용</td></tr> 가능 <tr><td>dissecting stereo microscope</td><td>Leica, Germany</td><td>S4 E</td><td>기타 공급업체/모델 사용 가능</td></tr></tbody></table>

당뇨병 각막에 대한 아데노 바이러스 유전자 치료 : 인간 장기 배양 각막 및 윤부 상피 세포에 상처 치유에 효과 및 세포 마커의 발현 줄기

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

이 프로토콜의 목적은 인간의 당뇨병 각막 분자 변화를 설명하고 그들이 장기 배양 각막의 아데노 바이러스 유전자 치료에 의해 완화 될 수있는 방법을 설명하는 것입니다. 당뇨병 각막 질환은 각막 신경 및 상피 창상 치유의 빈번한 이상과 당뇨병의 합병증이다. 우리는 또한 인간의 당뇨병 각막의 여러 추정 상피 줄기 세포 마커의 대폭 변경 식을 설명했다. 이러한 변화를 완화하기 위해, 아데노 바이러스 유전자 치료가 성공적 C-충족 원 종양 유전자 (proto-oncogene) 발현의 상향 조절 및 / 또는 단백질 분해 효소의 기질 금속-10 (MMP-10) 및 카 텝신 F.이 치료의 하향 조절을 사용하여 구현 된 당뇨병 각막 상처 치유를 가속화 만 윤부 줄기 세포 구획 형질 때에도. 가장 좋은 결과는 복합 치료를 얻었다. 정규화 된 줄기 세포의 이식 가능한 환자의 경우, 예를 들어도 optimizati의 제시폴리 양이온 강화제를 사용하여 줄기 세포 농축 문화 유전자 전달의에. 이 방법은 선택된 유전자뿐만 아니라, 각막 상피​​의 상처 치유의 다른 매개체를 위해 단지 유용한 세포 기능 줄기있다.

우리는 각막 기관 배양 물에서, 당뇨병 성 마커 (예, 기저막 단백질과 인테그린 α3β1) 정상 및 당뇨병 사이 각막 창상 치유의 발현의 차이가 유지되도록 미리 보여 주었다. 이 배양 시스템은 유전자 변형 당뇨병 마커, C-MET, MMP-10의 수준을 정상화 치료를 목적하고, 카 텝신 F.시켰다 전체 각막 상피​​는 MMP-10, 카 텝신 F (개별적으로 또는 조합)에 AV-cmet 또는 AV-shRNA를 형질 도입되었을 때, 상피 상처 치유 속도가 매우 빠르고 완료되었다 (P &lt;짝 스튜던트 t 테스트로 0.03에 비해 같은 기증자 (16, 17)에서 AV-벡터 형질 동료 각막에 비해 AV-벡터). 는 AV-cmet 크게 정상적인 각막의 치료에서 차이가 없었다 절반에 의해 치유 시간 (Figu 감소</s...

인간 당뇨병 장기 배양 각막에서 아데노바이러스 유전자 치료의 예는 이러한 각막에서 지연된 상처 치유와 현저히 감소된 상피 줄기 세포 마커 발현의 정상화를 위해 제시됩니다. 또한 줄기세포가 풍부한 윤부 상피 배양에서 이 과정의 최적화를 설명합니다.

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

본 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 인간 당뇨병 각막의 분자적 변화를 설명하고, 각막 기관 배양 모델에서 아데노바이러스 유전자 치료를 통해 이러한 변화를 어떻게 완화할 수 있는지 입증하는 것입니다. 이 방법은 당뇨병성 상피 상처 치유 지연과 상피 SEM SEM 분자의 비정상적 발현의 기저에 어떤 분자적 변화가 있는지와 같은 당뇨병성 각막 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기관 배양 각막에서 각막 상피 상처 치유 및 줄기세포 기능의 다양한 매개체를 표적으로 하는 유전자 치료 접근법을 테스트할 수 있다는 점입니다.우리는 초당뇨성 각막 줄기세포를 정상화하는 이 방법의 유효성을 입증했으므로, 이 기술의 응용 범위는 줄기세포 기능 장애와 관련된 다른 각막 질환의 치료까지 확장될 수 있습니다. 각막의 상피 측이 아래로 향하도록 멸균된 60-millimeter 디쉬에 놓고, 오목한 부분에 0.5 milliliters의 agar-collagen 혼합물을 채웁니다. 혼합물은 2분 이내에 각막 위에서 응고됩니다.응고가 완료되면, 기-액 계면 배양을 위해 각막의 각막연(limbus) 높이까지 충분한 양의 완전 보충 배지가 담긴 멸균된 60mm 디시에 각막의 한천 쪽이 아래로 향하게 놓습니다. 그다음, 각막이 담긴 디시를 워터 팬으로 습도를 조절한 35°C, 5% 이산화탄소 배양기에 넣습니다. 중앙 각막의 상피 제거를 수행하려면, 먼저 5mm 필터 페이퍼 디스크를 N-heptanol에 적신 후, 이를 중앙 각막 앞 표면에 75초 동안 올려둡니다.필터를 제거하고, 각막을 완전 배지(full medium)로 세척합니다. 디브리드망(debridement) 후에는 일반적으로 상피 세포가 죽어 탈락하며, 왼쪽에서 보이는 것처럼 미세하게 온전한 기저막이 남게 됩니다. 각막을 습윤하게 유지하기 위해 매일 상피에 100 microliters의 배지를 추가합니다.각막 치유 과정을 현미경으로 관찰합니다. 상피 결손이 완전히 치유될 때까지 매일 4X 및 10X 배율로 사진을 촬영합니다. 치유 과정 중에 최상단 초점 평면에서 검은색 거미 모양의 세포들이 관찰됩니다.이 세포들은 상피 제거 후 사멸한 아포토시스성 기질 각질세포입니다. 치유 과정은 이러한 사멸 세포들이 재생되는 상피에 의해 덮여 더 이상 보이지 않게 될 때 완료됩니다. 완전 배지에 75 µg/mL sildenafil citrate를 첨가하여 형질

adenoviral-gene-therapy-for-diabetic-keratopathy-effects-on-wound

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 수술 기법은 마우스 눈의 subretinal 공간으로 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 주입을 보여줍니다.

마우스 눈에 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 Subretinal 주입

우리는 간장 네오 작은 섬 STZ의 형성 (streptozotocin) 유도 도우미에 의존 adenoviral 벡터 (HDAd)과 고혈당증의 반전을 사용하여 유전자 Neurogenin3의 전송 (Ngn3)와 Betacellulin (Btc)에 의해 당뇨병 쥐를.을 설명 우리의 방법은 생체 전달하고 오래 지속 유전자 발현에서의 고효율과 도우미에 의존 adenoviral 벡터의 장점이 소요됩니다.

도우미에 의존 Adenoviral 벡터로 인한 유전자의 전송에 의한 당뇨 쥐의 간에서 네오 - 작은 섬 형성

망막하 주사는 쥐의 눈에 있는 망막 색소 상피에 효과적인 유전자 전달을 위한 수술 기술입니다.  여기에서는 실험용 마우스에서 망막 색소 상피에 바이러스 벡터를 망막하 주입하는 쉽고 복제 가능한 방법을 설명합니다.

마우스 망막 색소 상피의 유전자 치료에 대한 바이러스 벡터의 윤부 접근 - 망막 주입

다음 문서에서는 효과적으로 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD)의 지속 가능한 마우스 모델을 만들 수있는 쉬운, 재생 가능한 기술을 제공한다. 이 동물 모델 시험 및 윤부 줄기 세포 질환에 대한 치료 효능을 비교하기에 유용하다.

간단한 기계 절차 마우스에서 윤부 줄기 세포 결핍을 만드는 방법

전직에 대 한 프로토콜 vivo 막 기관 문화 모델 부상 치료 연구는 설명 하는 유용한. 이 모델 시스템 재생 치유를 촉진 하는 에이전트 또는 조직된 3D 다세포 환경에서 약물 독성의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Ex Vivo 막 기관 문화 모델에 대 한 상처 치유 연구

여기, 우리는 3 차원 기본 조직 특성화 및 전 비보 문화에 대 한 환자 파생, 수술 excised, fibrovascular 직물을 사용 하 여 증식 성 당뇨 망막 증의 병 태 생리학을 공부 하는 프로토콜을 제시. Ex vivo 문화 모델이 테스트 또는 새로운 치료법 개발에 대 한 의무가 이기도 합니다.

증식 성 당뇨 망막 증에 Fibrovascular 합병증에 대 한 전 비보 조직 문화 모델

Descemet's Stripping Only는 Fuchs 내피 각막 이영양증으로 인한 중앙 각막 굿태를 가진 환자가 말초 세포가 내피층을 재생시키기 위해 Descemet의 막을 벗겨내는 실험 절차입니다. 우리는 eFGF1 (NM141)에 의해 자극된 가속화된 치유와 함께 영양 장애 인간 각막 생체외 에서 DSO를 시뮬레이션하는 새로운 방법론을 제시한다.

조작된 섬유아세포 성장 인자 1에 의해 자극된 가속화된 치유를 통해서만 Descemet의 스트리핑의 인간 각막 배양 모델

이 원고에서 결막 하 주사는 주입 / 회수 주사기 펌프와 미세 주입 바늘과 결합 된 기밀 제거 가능한 주사기로 구성된 주사 시스템을 사용하여 마우스의 안구 조직에 대한 유효한 벡터 전달 방법으로 입증됩니다. 이 주사 시스템은 다른 안내 내 투여 경로에도 적용 가능합니다.

작은 동물 모델에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 결막하 투여

동결 보존 후 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조 및 rd10 마우스에서 이러한 세포의 망막하 전달에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

rd10 마우스에서 인간 배아 줄기 세포 유래 광수용체 전구체의 망막하 전달

여기서는 각막을 자극하는 감각 섬유를 손상시키는 세 가지 방법을 제안합니다. 이러한 방법은 생쥐의 축삭 재생에 대한 연구를 용이하게 합니다. 다른 동물 모델에 적용할 수 있는 이 세 가지 방법은 각막 신경 분포 생리학 및 재생 연구에 이상적입니다.

쥐 각막의 신경 영양성 각막염 및 신경 재생을 유도하는 세 가지 전략

돼지 각막 체외 장기 배양 및 상피 상처 치유는 화학 물질의 안구 독성을 테스트하기 위한 경제적이고 윤리적이며 재현 가능하고 정량적인 수단을 제공합니다. 또한 상피화 및 조직 복구의 조절의 기전을 규명하고 당뇨병성 각막병증 및 상처 치유 지연을 치료하기 위한 치료법을 평가하는 데 도움이 됩니다.

장기 배양 돼지 각막 및 상피 상처 치유를 사용한 치료 및 화학적 독성 평가

배우세요 인간 당뇨 각막에서 아데노바이러스 유전자 치료를 이용한 상처 치유 정상화 및 상피 줄기세포 마커 발현 회복 방법. 이 기술은 각막 질환 치료에 활용됩니다.

당뇨병 각막에 대한 아데노 바이러스 유전자 치료 : 인간 장기 배양 각막 및 윤부 상피 세포에 상처 치유에 효과 및 세포 마커의 발현 줄기

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