인 - 더 - 필드 응용 프로그램에 대한 설계 및 앱 타머 - 금 나노 입자 기반 비색 분석법 개발

전체적인 목표는 표적 분자 검출을 위한 압타머-금 기반 색도 측정법 개발을 위한 일반적인 접근법을 제공하고, 장기 저장 개선과 위양성 반응률 감소를 위한 접근법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 장기 저장을 위한 현장 재현성 및 위양성 반응률 감소 등 금 나노입자 압타머 색도 측정 분야의 핵심 질문에 답합니다. 이러한 검사는 유통기한과 위양성 반응 문제를 일으키기 쉽습니다.

이 작업에서는 이 두 가지 문제에 대해 개선합니다. 500밀리리터 에를렌마이어 플라스크와 대형 교반기를 농축질산 5밀리리터와 농축염산 15밀리리터를 화학 안전 후드에서 세척하세요. 플라스크 표면 전체를 산성 세척으로 적셔.

그 후 누클레아제가 없는 물로 플라스크를 헹구고 건조시킵니다. 1밀리몰라 금, 3염화물 100밀리리터를 추가하세요. 산성 세척된 얼렌마이어 플라스크 상단에 알루미늄 호일을 덮고, 뜨거운 판에서 계속 저으며 끓을 때까지 가열하세요.

다음으로 38.8밀리몰라 시트륨 10밀리리터를 추가하세요. 색깔은 투명하거나 회색에서 짙은 파란색이나 검정으로 변하며, 몇 분 내에 걸쳐 어두운 색에서 빨간색으로 변합니다. 불을 끄고 10분간 계속 저어주세요.

금 나노입자 현탁액을 실온까지 식힌 후 110마이크로리터의 DEPC를 계속 저어줍니다. 플라스크 전체를 알루미늄 호일로 덮고 DEPC 처리를 하룻밤 동안 배양시키세요. 다음 날, 금빛 나노입자 현탁액을 오토클레이브하세요.

그 후 실온으로 식힌 후 0.22마이크론 크기의 셀룰로오스 아세테이트 막을 통과시킵니다. 여과하고 고동멸균된 금 나노입자 정액은 4도 어두운 어둠 속에 보관하세요. 텍스트 프로토콜에 설명된 금 나노입자 농도를 계산하세요.

여기서 농도는 동적 광산란에 의해 결정된 15나노미터 크기의 10나노몰로 계산되었습니다. 표준 포스포라마이트 화학을 사용하여 코카인 결합 압착체 서열을 구매하거나 합성하십시오. 표준 탈염으로 aptamer를 정제한 후, 100마이크로몰 또는 1밀리몰 스톡 용액에서 뉴클레아제가 없는 물에서 올리고뉴클레오타이드를 재구성합니다.

정제된 정제 앱타머는 20도 섭씨에서 몇 달간 보관할 수 있습니다. DNA를 10나몰 스톡의 금 나노입자 용액과 결합하여 원하는 대로 금 나노입자의 부피를 조절하여 검사에 충분한 샘플을 제공합니다. 혼합물을 실온에서 3시간에서 4시간 정도 배양시키고 빛으로부터 보호하세요.

HEPES 20밀리몰라, 염화마그네슘 2밀리몰라, pH 7.4 완충제를 같은 부피로 넣고, 샘플을 4도 섭씨에서 어두운 밤새 두세요. 염 적정을 통해 분석의 색 반응을 유도하는 데 필요한 초기 염 농도는 분석법 블랭크를 사용하여 결정됩니다. 96웰 플레이트에서 압타머-금염화 분석법 180마이크로리터 알리코트에 20마이크로리터의 메탄올을 첨가합니다.

이 분석의 핵심 단계는 표적이 첨가된 후 금 나노입자를 불안정하게 만들기 위해 염화나트륨 농도를 결정하는 것입니다. 재고 염화나트륨 용액을 점차 적정하여 적정하고 당가점을 결정합니다. 여기서 시각적 관찰을 통해 아주 미세한 색 변화를 일으키기 위해 필요한 염화나트륨 부피를 결정합니다.

분석이 반응을 최적화하기 위해, 상온에서 96웰 플레이트에서 메탄올에 희석된 분석 분자 20마이크로리터를 180마이크로리터 아리코트의 압정머-금 나노입자 분석액에 첨가합니다. 즉시 이전 단계에서 결정한 염화나트륨 농도를 추가하여 분석의 색 반응을 시작합니다. 염화나트륨 농도를 높이거나 낮추고 목표 반응과 빈 반응을 비교하여 가능한 한 큰 색상 변화를 얻으세요.

가장 큰 반응 차이를 주는 염화나트륨 농도를 사용하세요. 염화나트륨 첨가 후 150초 후 분석 반응을 관찰하거나 측정하세요. 분광광도계를 사용하여 650나노미터와 530나노미터에서 흡광도를 분석합니다.

결과를 분석물 농도에 따른 650나노미터와 530나노미터에서 얻은 흡수율 비율로 그래프로 표시하라. 빈 신호에 대한 분석의 반응을 정규화하세요. 앞서 설명한 앱타머-금 나노입자 분석 성분을 준비하세요.

트레할로스가 밀리리터당 1그램, 자당이 밀리터당 1그램씩 포함된 각각 핵효소가 없는 물에 각각 용액을 만들어 냉동 용액을 만듭니다. 따라서 이 분석법을 냉동할 때 중요한 단계는 샘플에 얼마나 많은 트레할로스와 자당 용액을 첨가해야 완전하고 고르게 동결되도록 결정하는 것입니다. 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에서 60 MN4 DNA per gold nanoparticle 분석법을 최종 부피 200마이크로리터에서 추출하여 19.2밀리그램당 트레할로스와 4.8밀리그램/밀리리터 자당을 포함한 용액을 만듭니다.

최종 극저온 용액 농도는 DNA 비율에 따라 달라집니다. 샘플을 146도 냉동고나 액체 질소에서 급속 냉동합니다. 샘플은 사용할 때까지 냉동 보관하세요.

이 작업에서는 샘플을 146도 냉동고에 하룻밤 보관한 후 20도 냉동고로 옮겨 장기 보관합니다. 여기 표시된 것은 처리되지 않은 금 나노입자와 DNA aptamer 처리된 금 나노입자에 대한 염화나트륨 적정 곡선의 대표적인 결과입니다. 분석에 사용된 초기 염화나트륨 농도는 적정(titration)으로 결정되었습니다.

코카인 및 대조 분자에 대한 압타머-금 나노입자 색도 측정법의 대표적인 결과가 여기 제시되어 있습니다. 그래프들은 DNA 커버리지 밀도를 높이면 코카인 검사의 거짓 양성 반응률에 미치는 영향을 보여줍니다. 여기 보여지는 코카인 색도 분석법의 광영상 분석에서 얻은 보정 곡선 플롯입니다.

스마트폰으로 촬영한 사진들. 아프타머-금 나노입자 색도 측정법이 코카인 및 대조 분자에 대해 보이는 대표적인 반응 결과가 여기 제시되어 있습니다. 이 데이터는 신선하게 준비된 샘플과 최대 4주간 냉동 보관된 샘플을 비교합니다.

이 과정을 시도할 때는 금 나노입자를 불안정하게 만들고 표적 첨가 시 전형적인 색 변화를 촉진하기 위해 적절한 염화나트륨 농도를 결정하는 것이 매우 중요합니다. 이 영상을 본 후에는 관심 있는 표적을 검출하기 위한 금 나노입자 압형성체 색도 분석 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 여기 제시된 접근법을 사용하면 거짓 양성 반응률을 줄이고 검사 결과를 한 달 이상 지속 가능하게 유지할 수 있습니다.