PGR - 블루 플라스미드와 골든 게이트 어셈블리를 사용하여 터미네이터의 신속한 확인

합성생물학 프로토콜의 전반적인 목표는 골든 게이트 어셈블리를 활용하는 체외 시스템에서 터미네이터 기능을 신속하게 결정하고 터미네이터 강도를 정량화하는 것입니다. 이 프로토콜은 생물 정보학을 사용하여 인실리코(in silico)에서 발견한 터미네이터를 테스트하고 생물학적 환경에서 테스트하는 데 사용됩니다. 이를 통해 실험실 벤치 환경에서 생물 정보학적으로 식별된 종결자를 빠르고 간단하게 확인할 수 있습니다.

이 프로토콜의 주요 장점은 속도입니다. 우리는 일주일 이내에 생물 정보 식별에서 생물학적 확인까지 진행할 수 있습니다. 이를 통해 터미네이터가 실제로 터미네이터인지 확인할 수 있으며 터미네이터 강도를 정량화할 수 있습니다.

일반적으로 개인은 처음에 이 기술에 어려움을 겪을 것인데, 동일한 튜브에 리가아제와 제한 효소를 추가하는 것이 직관에 반하는 것처럼 들리기 때문입니다. 그러나 우리는 유형 2S 제한 엔도뉴클레아제를 사용하며 효소에 대한 인식 부위는 실제 절단 부위와 분리되어 있습니다. 터미네이터가 pGR 블루 플라스미드로 결찰되면 이는 영구적인 결찰입니다.

그러나 제한 효소와 리가아제를 동일한 튜브에 넣고 여러 주기를 거침으로써 높은 클로잉 효율을 달성할 수 있습니다. 100마이크로몰 농도의 뉴클레아제가 없는 물에 개별 올리고뉴클레오티드를 다시 현탁시킨 다음 10x 어닐링 완충액을 준비하여 이 절차를 시작합니다. 다음으로, 테스트할 각 터미네이터에 대해 1.5mm 마이크로 원심분리기 튜브에 라벨을 붙입니다.

각 튜브에 16마이크로리터의 초순수, 2마이크로리터의 10x 어닐링 버퍼, 원하는 터미네이터의 상단 및 하단 가닥 올리고뉴클로타이드 각각 1마이크로리터를 추가합니다. 주문한 올리고뉴클로타이드의 끝이 올바른 끈적끈적한 끝을 가지고 있는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 일단 어닐링되면 터미네이터가 올바른 방향에 있는지 확인하는 것이 중요하기 때문입니다.

터미네이터의 방향이 잘못된 경우 pGR blue는 작동하는 터미네이터인지 확인할 수 없습니다. 다음으로 마이크로 원심분리기 튜브를 플로트에 넣고 수조에서 4분 동안 끓입니다. 4분 후 가열판을 끄고 튜브를 밤새 물에 넣어 천천히 식힙니다.

어닐링된 터미네이터는 섭씨 20도에서 보관하십시오. 어닐링된 터미네이터를 40나노몰로 희석하려면 먼저 얼음에서 해동한 다음 새로운 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 124마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 1마이크로리터의 어닐링된 터미네이터에 추가합니다. 10, 000x g에 30 초 동안 표본을 분리기로 만드십시오.

탈수 후 샘플을 얼음에 보관하십시오. 새로운 thermocycler에 적합한 튜브에 6마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다. 그런 다음 1마이크로리터의 상업용 DNA 리가제 완충액을 추가합니다.

얼음 위에서 이후의 모든 단계를 수행합니다. 다음으로, pGR 블루 목적지 플라스미드 1마이크로리터당 35 - 50 나노그램을 포함하는 1 마이크로리터, 40 나노몰 어닐링 터미네이터 1 마이크로리터, 0.5 마이크로리터의 상용 고충실도 BSA1 제한 엔도뉴클레아제 및 0.5 마이크로리터의 상용 DNA 리가제를 추가합니다. 반응 혼합물을 10, 000x g에서 120초 동안 원심분리합니다.

그런 다음 튜브를 thermocycler에 직접 놓고 다음 프로그램을 실행하십시오.섭씨 37도에서 1분의 20주기, 섭씨 16도에서 1분, 섭씨 37도에서 15분의 1주기. 실행 후에는 샘플을 동결하고 섭씨 20도에서 보관하거나 즉시 변형을 진행하십시오.

적절한 형질전환 프로토콜을 사용하여 ligation reaction을 chemically competent e. coli cell로 변환합니다. 여기서 JM109 세포는 zippy transformation을 사용하여 형질전환됩니다.

L자형 유리 하키 스틱을 사용하여 형질전환된 세포 25마이크로리터를 1밀리몰 암피실린과 10밀리몰 아라비노스가 포함된 예열된 LB 한천 플레이트에 펴 바릅니다. 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 24시간 이상 배양하지 마십시오.

암피실린은 빠르게 분해됩니다. 다음날, 군체의 색깔을 검사하십시오. 성공적인 결찰은 가시광선에서 흰색 또는 노란색이어야 하며 파란색 또는 자외선 아래에서 녹색으로 형광을 발합니다.

실패한 결찰은 가시광선 아래에서 파란색인 군체를 생성합니다. 각 터미네이터 및 대조군에 대해 1밀리몰 암피실린과 10밀리몰 아라비노스가 함유된 5밀리리터의 멸균 LB 육수가 들어 있는 시험관을 준비합니다. 이 프로토콜을 수행할 때 pGR을 사용하면 적절한 컨트롤이 있는지 확인하는 것이 매우 중요합니다.

첫 번째 제어는 LB 육수여야 합니다. 다음 대조군은 암피실린에 대한 내성이 있지만 청색광 아래에서 형광을 발하지 않는 세포여야 합니다. 이것들은 공백으로 사용됩니다.

다음 대조군은 절단되지 않은 pGR 플라스미드로, 터미네이터가 설치되어 있지 않으며, 이는 터미네이터 강도의 기준선 역할을 하고 마지막 튜브는 샘플용이 됩니다. 가시광선 아래에서 멸균 루프를 사용하여 2-3개의 흰색 또는 노란색 집락을 선택하고 LB 육수로 옮깁니다. 샘플을 섭씨 37도, 160rpm에서 16-18시간 동안 셰이커에서 배양합니다.

다음 날, 분광 광도계를 사용하여 600나노미터에서 각 샘플의 광학 셀 밀도를 측정합니다. 일반적으로 이 시간이 지나면 0.8 - 1.0의 OD 600이 예상됩니다. 멸균 96웰 플레이트를 후드에 놓습니다.

각 샘플 또는 대조군에 대해 암피실린과 아라비노스가 함유된 199마이크로리터의 멸균 LB 육수로 3개의 웰을 준비합니다. 다음으로, 하룻밤 동안 국물에서 나온 세포 용액 1 마이크로 리터를 96 웰 플레이트의 개별 웰로 피펫팅합니다. 접시에 통기성 덮개를 채운 다음 섭씨 37도 및 160rpm에서 18-20시간 동안 흔듭니다.

다음 날, 플레이트 리더를 사용하여 OD 600을 측정하며, 이는 약 0.5입니다. 또한 395나노미터의 여기 파장과 509나노미터의 방출에서 G of P 형광을 측정합니다. 575나노미터의 여기 파장과 605나노미터의 방출에서 RFP 형광을 측정합니다.

Excel을 사용하여 형광을 OD 600으로 나누어 성장 변화를 정규화합니다. 정규화 후, GFP 제어 형광에 대한 GFP 종단기 형광을 취하고 RFP 제어 형광에 대한 RFP 종단기 형광으로 나누어 상대적인 종결자 강도를 측정합니다. 이 비디오에 설명된 바와 같이 미생물 파지 bernal 13에서 생물 정보학적으로 확인된 추정 종결자 T1에서 6을 수정했습니다.

이러한 결과는 상대 형광을 보여줍니다. 모든 결과는 절단되지 않고 수정되지 않은 PGR을 포함하는 셀을 대조군으로 사용하여 정규화되었습니다. T3는 강력한 터미네이터로 밝혀졌습니다.

모든 결과는 세 배로 성장하고 시각적 표현을 위해 평균화된 개별 군체를 나타냅니다. 오차 막대는 평균 데이터 포인트 간의 편차를 나타냅니다. 종결자 강도를 정량화하기 위한 최상의 참조 대조군을 결정하기 위해 종결자가 없는 원래 pGR 플라스미드를 사용하는 원시 데이터와 종결자가 아닌 것으로 알려진 염기서열로 복제된 pGR 블루를 비교했습니다.

여기에서 볼 수 있듯이 두 대조군 모두 유사한 수준의 GFP 및 RFP 발현을 보였으며 더 중요한 것은 유사한 GFP 대 RFP 비율을 생성했다는 것입니다. 이러한 모든 결과는 시각적 표현을 위해 세 번 성장하고 평균화된 개별 군체를 나타냅니다. 이 기술을 완전히 익히면 배송 및 주문 시간을 포함하여 72시간 밖에 걸리지 않을 수 있습니다.

pGR 블루는 대장균에서만 작용한다는 점에 유의해야 합니다. 또한, 우리는 터미네이터의 작은 부분만 보고 있기 때문에 전사를 제어할 수 있는 다른 조절 요소에 대해 전혀 알지 못합니다. pGR blue를 사용하여 이 프로토콜로 달성한 결과를 확인하기 위해 정량적 PCR과 같은 추가 방법을 사용할 수 있습니다.

또한 pGR 인서트를 잘라내어 원하는 플라스미드로 접합할 수 있습니다.