Name: 안압 상승을 통해 망막 허혈 - 재관류 손상의 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 학습하세요 안압 상승을 통한 망막 허혈-재관류 손상 마우스 모델 수술 기법. 이 방법은 망막 질환의 세포 메커니즘과 치료 접근법을 연구하는 데 활용됩니다.

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(; EJD EY022383 및 EY022683) 및 코어 보조금 (P30EY001765), 이미징 및 현미경 코어 모듈이 작품은 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 연구비에 의해 지원되었다.

윤리 정책 : 모든 절차가 존스 홉킨스 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 명시된 지침에 따라 수행 하였다. 주의 : 다른 설치류 균주 또는 종도 사용될 수 있지만 촬영시 사용되는 마우스는 잭슨 C57BL / 6 마​​우스이다. 다른 균주 또는 종을 사용하는 경우, 마취 용량 및 부상의 타임 라인이 다를 수 있음을 유의하십시오. 이 균주 종 실험의 변화를 수용하기 위해 I / R 조건에 적응하는 것이 중요하다. 1. 마취 칵테일을 준비 <ol><li> 50 ML의 원심 분리 관에 1.25 ml의 케타민, 0.625 ml의 크 실라, 0.375 ml의 아세 프로 마진, 그리고 22.75 ml의 인산염 완충 생리 식염수를 결합합니다. 주 : 원고의 나머지 부분이 용액 칵테일로 지칭 될 것이다. </li><li> 60 ML의 주사기와 0.20 μm의 필터를 사용하여 새 멸균 50 ML의 원심 분리기 튜브에 칵테일을 필터링합니다. 레이블 및 날짜이 새로운 부엉있다. </li><li> 완전 마취 광 유도 열화를 방지하기 위해 알루미늄 포일의 칵테일 튜브를 감싸는. 주 : 칵테일을 실온에서 보관하고 그 초기 만료 성분의 유효 기간까지 재사용 될 수있다. </li></ol> 2. 마취 부스터를 준비 <ol><li> 50 mL의 원심 분리 튜브에 4 mL의 케타민과 16 ㎖의 인산염 완충 식염수를 결합한다. 참고 :이 솔루션은 이제부터 부스터 라한다. </li><li> 60 ML의 주사기와 0.20 μm의 필터를 사용하여 새 멸균 50 ML의 원심 분리기 튜브에 부스터를 필터링합니다. 레이블 및 날짜 새로운 튜브. 주 : 부스터 실온에서 보관하고 그 초기 만료 성분의 유효 기간까지 재사용 될 수있다. </li></ol> 3. 수술 스위트 룸을 준비 <ol><li> 18 ° C와 21 ° C 사이의 실내 온도를 설정합니다. </li><li> 수술 테이블 켜고 highe에 표면의 열을 조절세인트 온도. </li><li> 수술 underpads 모든 작업 표면을 커버. </li><li> 따뜻한 수술 테이블에 빈 케이지 또는 다른 컨테이너를 정렬합니다. </li><li> 규모와 조리대에 귀 술래를 정렬합니다. </li></ol> 4. 헤파린 나트륨과 균형 소금 솔루션을 준비 <ol><li> 균형 염 용액 (HBSS)에 500㎖의 IV 병에 헤파린 나트륨 0.5ml를 추가. </li><li> 0.1 % 헤파린 나트륨의 병에 Y 사이트 튜브 prepierced 기본 세트의 날카로운 끝을 삽입합니다. </li></ol> 5. IV 극 설정 <ol><li> IV를 극 확장에서 0.1 % 헤파린 나트륨의 병을 중단하고, Y 사이트 튜브 prepierced 기본 세트에 에어 필터 캡을 열고 스냅. </li><li> 163cm (120mm 수은)에 0.1 % 헤파린 나트륨 병을 상승. 나트륨 헤파린 물방울의 피크에 테이블 탑의 높이를 측정한다. </li><li> 수동으로 Y 사이트 튜브 prepierced 차 세트를 쓸어 넘겨하여 IV 튜브에 공기 방울을 제거합니다. </l난&gt; </ol> 6. 나트륨 헤파린 드립 설정 <ol><li> 다섯 밸브 매니 폴드에 Y 사이트 튜브 prepierced 차 세트를 연결합니다. </li><li> 30 게이지를 연결 ½ 남성 튜브 피팅을 루어하는 루어 남성을 사용하여 오 포트 매니 폴드 인치 바늘. </li><li> 30 게이지 튜브의 자신의 10 인치 세그먼트로 30 게이지 ½ 인치 바늘을 각각 삽입합니다. </li><li> 지혈제를 사용하여, 새로운 30 게이지 ½ 인치 바늘의 바늘 끝을 중단하고 30 게이지 튜브에 자신의 무딘 끝을 삽입합니다. 바늘 끝의 멸균 또는 소독 단계 8.3에 대한 필요합니다. </li><li> 테이프를 사용하여, 내부 포트에 연결된 튜브 외부 포트에 연결된 관의 상부에 위치되도록 바늘 30 게이지 튜브를 배열. 이 배열은 전방 삽관시 튜브의 엉킴을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 다섯 밸브 매니 폴드에 0.1 % 헤파린 나트륨의 흐름과 각 개별 포트에 설정합니다. <ol><li> 확인이 0.1 %헤파린 나트륨은 각 포트에 대해 강력하게 흐르고 있습니다. 포트가 약하게 흐르는 경우, 포트를 교체하거나 멸균 주사기에서 공기를 취소합니다. </li><li> 30 게이지 튜브 및 5- 밸브 매니 폴드로부터 기포를 제거하기 위해 3 분 - 0.1 %의 헤파린 나트륨 2 흐르게. </li></ol></li><li> 5 밸브 매니 폴드의 모든 포트의 전원을 끄십시오. </li></ol> 7. 수술에 대한 마우스를 준비합니다 <ol><li> 수술 제품군에 마우스를 가져옵니다. 수술 중에 동물의 탈수를 방지하기 위해 각 케이지 물 병 공급. </li><li> 각 마우스의 무게를 기록한다. </li><li> 복강 g의 체중 당 0.02 ml의 칵테일 각 마우스를 주입한다. </li><li> 태그 및 각 마우스의 수를 기록한다. </li><li> 수술 테이블에 빈 용기에 모든 마우스를 놓습니다. 발가락 핀치에 페달 철수 응답의 부재에 의해 확인 된 깊은 마취를 달성하기 위해 모든 마우스에 대해 5 ~ 10 분을 허용합니다. </li><li> 각 마우스의 경우, 한 방울 관리동공 팽창 및 단기 윤활에 대한 각각의 눈에 Tropicamide. </li><li> 각 마우스의 경우, 국소 마취 및 단기 윤활에 대한 각각의 눈에 Proparacaine 한 방울을 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 첫 번째 마우스 될 것 마취 된 최초의 마우스 유관 될 수 있도록 마취의 순서로 마우스를 정렬합니다. </li><li> 허용은 거의 눈 2 분을 적용하려면 삭제합니다. </li><li> 테이프에 단단하게 잡아 당겨 테이프의 연속 4 인치 조각을 준비한다. 옆으로 각각 마우스 테이프의 한 조각을 설정합니다. 주 : 테이프에 단단히 당겨 실패하면 테이프의 컬링 발생합니다. </li></ol> 8. Cannulate 전방 <ol><li> 수술 현미경 아래의 첫 번째 마우스를 정렬하고, 선호하는 각막에 현미경을 집중한다. 주 : 캐 뉼러가 하나의 눈에 대해 수행 될 수있다. 오른쪽 지배적 인 외과 의사 난을 찾을 수 있습니다왼쪽 지배적 인 외과 의사가 오른쪽을 선호 수 있지만 t 가장 쉬운 방법은 왼쪽 눈을 cannulate합니다. </li><li> 다섯 밸브 매니 폴드의 첫 번째 0.1 % 헤파린 나트륨 포트의 전원을 켭니다. </li><li> 수술 현미경 부드럽게 눈 proptose 집게 쌍을 사용한다. 모양 소대 섬유와 각막의 정점 사이의 중간 쯤 전방에 30 게이지 정맥 바늘을 삽입합니다. <ol><li> 긁힘이나 조리개, 렌즈, 또는 내부 각막 표면을 천공 않도록주의하십시오. </li><li> 각막를 두 번 관통하지 마십시오. </li><li> 캐 뉼러와 각막 사이의 마찰을 극복하기 위해 부드러운 비틀림 운동을 사용하여 전방의 깊이 캐 뉼러를 삽입합니다. </li></ol></li><li> 테이블에 30 게이지 튜브를 보호하는 테이프의 스트립을 사용합니다. 테이프에 도달하면서 삽입 된 캐 뉼러의 움직임을 최소화하기 위해, 탁상에 대해 30 게이지 튜브를 누릅니다. </li><li> 수술의 시작 시간을 기록한다. </li><li> verif, 현미경을 사용하여누설이 분명하지 y를. 누설이 존재하는 경우, 유체의 이동이 눈에 가까운 표시됩니다. </li><li> 시각적으로 I / R 눈이 반대편 눈보다 더 큰 것을 관찰함으로써 안구 팽창을 확인합니다. 함께, 누설의 유무와 안구 팽창의 존재 안압 성공적인 상승 보여준다. </li><li> 두 눈에 하이 프로 멜로 오스를 적용합니다. 하이 프로 멜로 오스는 각막과 실 microleaks에 기름칠을하는 역할을한다. 지속적인 윤활 (약 30 분마다)를 필요에 따라 하이 프로 멜로 오스 다시 적용합니다. </li><li> 모든 동물은 유관 때까지 반복 8 단계. </li></ol> 9. 모니터 마취 <ol><li> 발가락 핀치를 사용, 수염, 또는 꼬리의 육안 관찰의 육안 관찰 각 마우스를 마취 남아 있는지 확인합니다. 마우스가 페달 철수 응답, 수염 경련, 또는 꼬리의 움직임을 보여해야, 9.2 단계로 바로 진행합니다. </li><li> 마우스는 수술, 리프트 중 각성되기 시작하면꼬리는 마우스 뒤에서 하복부에 복강 0.05 ml의 부스터를 삽입합니다. 부스터을 적용하려면 2 분 1 - 허용합니다. </li><li> 마우스 추가 진정, 필요에 따라 단계를 반복 구를 필요로한다. </li></ol> 10. 전방에서 정맥을 제거 <ol><li> 각 동물의 경우, 90 분 경과 후, 부드럽게 전방에서 캐 뉼러를 당깁니다. </li><li> 인접한 동물의 정맥 튜브를 방해하지 않도록주의하면서 수술 테이블에서 마우스를 Untape. </li><li> 젤리 윤활유와 함께 두 눈을 윤활합니다. </li><li> 이후 캐 뉼러가 제거되기 때문에, 수술에서 회복 수술 테이블에 빈 컨테이너에 마우스를 정렬합니다. 수술 테이블의 열을 끄지 마십시오. </li><li> 가열 수술 테이블에 복구를 위해 3 시간 - 2, 최소한 허용합니다. 그들이 완전히 마취에서 회복 자주 때까지 쥐를 관찰한다. </li></ol> 11. 청소 식uipment <ol><li> 알코올 잎사귀를 사용하여 캐 뉼러를 소독. 참고 사항 : 오토 클레이브 등의 소독 또는 살균을위한 다른 방법은, 치환 될 수있다. </li><li> 공기로 가득 60 ML의 주사기를 사용하여 5 밸브 매니 폴드에서 0.1 % 헤파린 나트륨, 30 게이지 바늘, 30 게이지 튜브 및 캐 뉼러를 추방. </li><li> 증류수로 가득 60 ML의 주사기를 사용하여 5 밸브 매니 폴드, 30 게이지 바늘, 30 게이지 튜브 및 캐 뉼러를 씻어. </li><li> 공기로 가득 60 ML의 주사기를 사용하여 5 포트 매니 폴드, 30 게이지 바늘, 30 게이지 튜브 및 캐 뉼러에서 증류수를 추방. </li><li> 캐 뉼러를 소독 및 튜브 장치를 세척 후 재사용이 장비를 저장합니다. </li><li> 쇼핑몰, 폐기, 또는 기타 모든 장비의 전원을 끄십시오. 에 수술 테이블의 열을 남겨주세요. </li></ol> (12) 반환 그들의 홈 케이지에 대한 모든 마우스 <ol><li> 마우스 (2 후 - 3 시간) 수술에서 각성 후 홈 케이지에 각 동물을 반환. 각 케이지에 대한 겔 음식을 제공합니다. 자신의 지정된 방에 모든 새장을 돌려줍니다. </li><li> 수술 테이블의 열을 끕니다. 모든 폐기물을 폐기하고, 수술 제품군을 닦아. </li></ol> 13. 망막 평가를 수행 <ol><li> 적절한 전위도 기록에 대한 조직 학적 분석이나 어두운 적응 마우스에 대한 망막를 수집합니다. </li></ol>

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<li>Li, B., Pang, I. H., Barnes, G., McLaughlin, M., Holt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+and+device+to+induce+transient+retinal+ischemia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A new method and device to induce transient retinal ischemia in the rat.</a> Curr Eye Res. 24 (6), 458-464 (2002).</li>
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저자는 공개하지 않았습니다.

망막 I / 상승 된 안압에 의해 R 부상은 쥐 망막 신경 혈관 단위 세포 손상 및 기능 장애, 특히 신경 퇴행을 모델링의 유틸리티를 입증했다. 이 절차는 강력한 제어 조직을 제공하고, 기술적 인 정교함 측면에서 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 그것은이 압력 및 허혈의 지속 시간을 증가 시키면 부상의 심각도 (24)을 증가시킬 수있다 다른 I / R 손상 모델에 주목하고있다. 이러한 이유로, 일부 실무자 4,6-10,12 여기 제시된 것과 상이한 허혈성 압력과 지속 시간을 사용하기로 결정 하였다. 따라서 망막 나는 / 상승 된 안압에 의해 R 부상은 하나 하나의 특정 실험 목표를 수용하기 위해 수술 매개 변수를 조정 할 수 있다는 점에서 다른 망막 I / R 기술을 통해 이점을 제공합니다. 그럼에도 불구하고, 대안 기술은 설치류에서 망막 I / R 손상을 유도을 위해 사용되어왔다. 시신경 신경 다발 (25), (26)의...

망막 허혈 - 재관류 (I / R)은 녹내장, 당뇨 망막 병증, 망막 혈관 폐색 1 등 많은 인간의 망막 병변을 특징. 순환이 계속해서 복원 할 때 망막 I / R에있어서, 망막 혈관의 혈류 감소 (허혈) 망막 산소 및 기타 영양소 과민, 심각한 산화 침전 및 염증성 손상 상태를 생성한다 (재관류) 2. 신경 망막이 망막 신경 퇴행 아마도 I / R에 의한 손상의 가장 두드러진 특징 인,이 변화에 특히 취약 나타납니다. 마우스 망막 I / R 부상을 모델링하기위한 프로토콜은 여기에 제시했다. 이 기술은 망막 신경 혈관 유닛의 인간 질병의 잠재적 기전 및 치료 전략을 조사하는 연구를 가능하게한다. 수술 빈혈 (3)의 신경 퇴행성 결과를 이해하고자하는 외과 의사에 의해 1952 년에 개척, 로덴t의 망막의 I / 상승 된 안압 (IOP)에 의해 R은 허혈성 모욕 사 후 신경 퇴행성 엔드 포인트를 표준화하기위한 목적으로 1991 년에 재건되었다. 수축기 혈압 상기 IOP 인상 식염수 탱크의 물방울을 사용하여, 이러한 연구는 가압 안구 삽관은 망막의 순환을 중단시켜 신경 퇴행을 개시하기에 충분한 것을 보여 주었다. 높은 안압에 의해 망막 I / R을 사용하여 최근의 노력은 I / R에 의한 망막 신경 퇴행 5-12의 기초가되는 메커니즘을 자세히 설명하기 시작했다. 여러 그룹은 염증 13, 14, 혈관 투과성 15, 16, 모세 혈관 변성 14,17 등의 추가 병리학 적 변화를보고했다. 함께 찍은, 이러한 연구는 더 일반적으로 망막 신경 혈관 질환의 모델로 높은 안압에 의해 망막 I / R 부상을 설립했다. I / R 손상의 메커니즘을 특성화하는 것은 버지니아의 연구에 필수적이다scular 질병. 높은 안압에 의해 망막 I / R 손상은 I / R 폐암 (18)의 부상, 심장 (19), 뇌 (20), 간 (21), 신장 (22), 및 소장 (23)을 포함하여 많은 저산소증에 의한 손상 모델 중 하나입니다. 이러한 모델은 혈관 질환에 대한 우리의 이해와 임상 치료의 발전에 가장 중요한왔다. 안구 조직, 망막 I / 상승 된 안압에 의해 R 부상에 I / R 프로세스의 조사를 확장함으로써 이러한 관련 조건보다 포괄적 인 그림을 그릴 수 있습니다. 망막 임상 신경 퇴행성 조건, 망막 I / 상승 된 안압에 의해 R 부상과 긴밀하게 대응하는 허혈성 병인을 탐험에 관심있는 연구자를위한 유용한 도구를 제공합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은, 다루기 쉬운, 및 액세스를 대상으로합니다. 그것은 이러한 망막 신경 세포의 정량, 망막 두께의 측정, 전기 생리 연구 등의 신경 변성에 엔드 포인트에 의해 잘 보완망막 신경 기능 ecording. 이 모델은 신경 혈관 문의 발전에 자사의 유틸리티를 입증하고, 시각적 의학 연구의 기초 프로토콜로 상태를 적립의 약속을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>헤파린 나트륨 주사제, USP</td><td>Abraxis 제약 제품</td><td></td><td>1,000 USP/ml</td></tr><tr><td>BSS 멸균 관개 솔루션</td><td>Alcon Laboratories, Inc.</td><td>9007754-0212</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>SC-2 kg 디지털 포켓 스케일</td><td>American Weigh Scales, Inc.</td><td>SC-2 kg</td><td></td></tr><tr><td>트로피카미드 점안액 USP 1%</td><td>Bausch + Lomb</td><td></td><td>1% (10 mg/ml)</td></tr><tr><td>프로파라카인 염산염 점안액 USP, 0.5%</td><td>Bausch + Lomb</td><td></td><td>0.5% (5 mg/ml)</td></tr><tr><td>INTRAMEDIC 폴리에틸렌 튜빙</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>427400</td><td>내경: 427400</td></tr><tr><td>30 G 1/2 PrecisionGlide Needles</td><td>Benton Dickinson and Company</td><td></td><td></td>305106</tr><tr><td>BC 1ml TB 주사기, 피내 베벨 바늘이 있는 슬림 팁, 26g x 3/8</td><td>Benton Dickinson and Company</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>BD 60ml 주사기 Luer-Lok 팁</td><td>Benton Dickinson and Company</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss OPMI Visu 200/S8 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>AG 000000-1179-101</td><td></td></tr><tr><td>멸균 주사기 필터</td><td>Corning Inc.</td><td>CLS431224</td><td>0.20 & 마이크로; m</td></tr><tr><td>Durasorb Underpads</td><td>Covidien</td><td>1038</td><td>23 x 24 인치</td></tr><tr><td>알코올 준비</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td>2 Ply, Medium</td></tr><tr><td>Student Dumont # 5 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Hartman Hemostats</td><td>Fine Science Tools</td><td>13002-10</td><td></td></tr><tr><td>Primary Set, Macrobore, Prepierced Y-Site, 80 Inch</td><td>Hospira</td><td>12672-28</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 pH 7.4 (1x)</td> <td>Invitrogen</td><td>10010-049</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>증류수</td><td>Invitrogen</td><td>15230-204</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>C57BL / 6J 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed Injection : Xylazine Sterile Solution</td><td>LLOYD, Inc.</td><td></td><td>20 mg/ml</td></tr><tr><td>윤활 젤리, 수용성 정균 MediChoice</td><td></td><td></td><td>3-그램 패킷</td></tr><tr><td>NAMIC 혈관 조압 모니터링 매니폴드</td><td>Navilyst Medical, Inc.</td><td></td><td>70039355 7개의 여성 항구를 가진 5 벨브 다기관</td></tr><tr><td>Goniosoft, Hypromellose 2.5% 안과 Demulcent 해결책: Hydroxypropyl Methylcellulose</td><td>OCuSOFT, Inc.</td><td></td><td>2.5%(25mg/ml)</td></tr><tr><td>케타셋 CIII: 케타민 염산염</td><td>화이자, Inc.</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Trans-Pal I.V. 스탠드&nbsp;</td><td>Pryor Products</td><td>372</td><td>집에서 만든 60cm 스테인리스 스틸 확장</td></tr><tr><td>Acepromazine: Acepromazine Maleate Injection, USP</td><td>Vet One</td><td></td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>V-Top 수술 테이블/조정 가능한 유압</td><td>VSSI</td><td>100-4041-21</td><td></td></tr><tr><td>튜브 피팅 Luer Male to Luer Male Warner</td><td>Instruments</td><td>64-1579</td><td></td></tr></tbody></table>

안압 상승을 통해 망막 허혈 - 재관류 손상의 마우스 모델

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

망막 허혈 - 재관류 (I / R)은 녹내장, 당뇨 망막 병증, 망막 혈관 폐색 등 다양한 안구 조건에서 세포 손상에 기여하는 병태 생리 학적 과정이다. I / R 손상의 쥐 모델은 특히 망막 신경 혈관의 퇴행성 손상 부에 대하여, 인간의 I / R 손상 메커니즘 및 치료 전략에 중요한 식견을 제공한다. 안압의 상승을 통해 생쥐의 망막 I / R 손상을 유도하기위한 프로토콜은 여기에 제시했다. 이 프로토콜에서, 안구 전방은 높은 염분 저수지의 물방울을 흐르는 바늘과 유관된다. 수축기 동맥 혈압보다 안압 상승이 물방울을 사용하여, 개업 일시적으로 내부 망막 혈류 (국소 빈혈을) 중단. 순환이 캐뉼라를 제거함으로써 (재관류)을 복원하는 경우, 심각한 세포 손상은 망막 신경 퇴행 궁극적 결과 계속된다. 최근 스터드이거는이 모델의 추가 요소로 염증, 혈관 투과성 및 모세관 변성을 보여줍니다. 이러한 망막 동맥 결찰, 망막 I /에 의해 R 부상으로 대체 망막 I / R 방법론에 비해 안압에 신경 기전과 치료를 검사하기위한 유용한 도구로 자신을 제시, 그 해부학 적 특이성, 실험 취급 용이성, 기술적 접근에 이점을 제공 상승 망막 신경 혈관 장치.

높은 안압에 의해 망막 I / R의 신경 퇴행성 효과는 일반적으로 두 가지 표준 방법을 사용하여 평가됩니다. 신경 세포의 핵의 NeuN의 immunolabeling는 I / R 모욕 (그림 1) 다음과 같은 중요한 신경 세포 손실을 공개했다. 내가 / R이, 파라 포름 알데히드에 고정 된 신경 세포 마커 NeuN으로 표시하고, 전체 탑재 한 후 간단히, 눈은 7 일 탈핵. 이미지는 공 초점 현미경을 사용하여 촬영하고, NeuN 표지 세포 (11)를 계산하여 정량화 하였다. 신경절 세포 층 신경 세포 수가 감소가 I / R - 유도 세포 사멸을 나타낸다. 망막 신경 세포의 기능 장애는 전위도 (도 2)를 이용하여 설명되었다. 간단히, 칠일 I / R 후, 암순응 전위도 여러 플래시 ...

이 문서에서는 마우스에서 안압 상승으로 망막 허혈 - 재관류 손상을 유도하는 절차를 설명합니다. 안압 상승으로 망막 허혈 - 재관류 손상은 망막 신경 혈관 기기의 인간 질병에 대한 잠재적 인 세포 메커니즘과 치료를 조사하는 연구를 가능하게 망막에 손상 산소와 영양 공급에 의해 특징 인간의 병리를 모델링하는 역할을한다.

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

이 기술의 전반적인 목표는 망막 허혈-재관류 손상 및 그 병리학적 결과에 대한 실험 모델을 제공하는 것입니다. 이 방법은 망막 허혈-재관류의 기저 메커니즘을 조사하고, 관련 병변을 치료하기 위한 잠재적인 치료법을 평가하는 데 흔히 사용됩니다. 이 기술의 주요 장점은 주변 조직에 가해지는 손상을 최소화하면서 안구 구조에 매우 정밀하게 표적화된 손상을 유발한다는 점입니다.이 기술의 유용성은 염증, 산화 스트레스, 망막 신경혈관계의 기능 장애를 포함하여 망막 허혈-재관류 손상의 다양한 징후를 이해하고 분석하는 범위까지 확장됩니다. 캐뉼라 삽입을 위한 수술 기법은 시각적 가이드 없이는 재현하기 어려울 수 있으므로, 이 방법의 비디오 시연이 매우 중요합니다. 절차를 시작하기 전, 테이블 위에서 빈 케이지를 따뜻하게 데워 두십시오.그 다음, 미리 구멍이 뚫린 Y-사이트 튜빙의 1차 세트 뾰족한 끝부분을 0.1% Heparin sodium 병에 삽입하고, Heparin sodium 병 하단을 IV 폴 연장대에 겁니다. 튜빙의 공기 필터 캡을 딸깍 소리가 나게 엽니다. 그런 다음, Heparin sodium 유동 압력을 120 mililiters of mercury로 생성하기 위해, 테이블 상판부터 Heparin sodium 점적 정점까지의 높이가 163 centimeters가 되도록 Heparin sodium 병을 높입니다.기성 천공 Y-사이트 튜브가 포함된 기본 세트를 열어 헤파린 나트륨(Heparin sodium)이 튜브를 채우도록 한 다음, 해당 튜브를 5밸브 매니폴드에 연결합니다. 그다음 루어 수(Luer male) 대 루어 수 튜브 피팅을 사용하여 30게이지 0.5인치 바늘을 5포트 매니폴드에 연결합니다. 각 바늘을 30게이지 튜브의 10인치 세그먼트에 각각 삽입합니다.그 다음, 지혈 겸자를 사용하여 새로운 30 gauge 0.5인치 바늘 팁을 부러뜨린 후, 뭉툭한 끝부분을 30 gauge 튜브의 열린 끝에 삽입합니다. 이어서, 테이프를 사용하여 전방실 캐뉼라 삽입(Anterior Chamber Cannulation) 중 튜브가 엉키는 것을 방지하도록, 내부 포트에 연결된 튜브가 외부 포트에 연결된 튜브 위에 위치하도록 배치합니다. 이제, 공기 방울을 제거하기 위해 5밸브 매니폴드와 각 개별 포트에 0.1% Heparin sodium 흐름을 2~3분 동안 가합니다.그다음, 5방향 밸브 매니폴드의 모든 포트를 닫습니다. 캐뉼라 삽입을 수행하기 위해, 마취제를 투여한 후 모든 마우스를 수술대 위의 보온 케이지에 넣고, 5~10분 후 발가락 꼬집기 반응이 없는 것을 통해 깊은 마취 상태가 되었는지 확인합니다. 그런 다음 각 동물의 눈에 동공 확장을 위한 Tropicamide 한 방울과 국소 마취를 위한 Proparacaine 한 방울을 투여하고, 마취된 순서대로 마우스를 배치하여 가장 먼저 마취된 마우스부터 캐뉼라 삽입을 진행할 수 있도록 합니다.안약이 효과를 나타낼 때까지 기다리는 동안, 테이프를 팽팽하게 잡아당긴 후 4인치 길이의 직선 조각으로 뜯어 동물 한 마리당 한 조각씩 준비하여 따로 둡니다. 테이프를 팽팽하게 잡아당기지 않으면 테이프가 말릴 수 있으므로 주의하십시오. 첫 번째 마우스가 준비되면, 해당 동물을 수술 현미경 아래에 배치합니다.그 다음, 5방향 밸브 매니폴드의 첫 번째 0.1% Heparin sodium 포트를 열고, 포셉을 사용하여 한쪽 눈을 부드럽게 돌출시킵니다. 이어서, 30 gauge 캐뉼라 바늘을 진대 섬유와 각막 정점의 중간 지점 정도의 전방에 삽입합니다. 이때 각막을 두 번 뚫지 않도록 주의하십시오.캐뉼라를 전방실 깊숙이 삽입하기 위해 부드럽게 비트는 동작을 사용함에 유의하십시오. 이제, 테이프를 집는 동안 삽입된 캐뉼라의 움직임을 최소화하기 위해 30 gauge 튜브를 테이블 상판에 밀착시키고, 테이프를 사용하여 튜브를 테이블에 고정하십시오. 튜브가 고정되면 수술 시작 시간을 기록하십시오.현미경을 사용하여 누출이 없는지 확인하고, 허혈-재관류(Ischemia-Reperfusion) 측의 눈이 대조측 눈보다 더 큰지 확인하여 안구 팽창의 발생 여부를 확립합니다. 이후 각막을 윤활하고 미세 누출을 차단하기 위해 실험 종료 시까지 30분마다 양쪽 눈에 Hypromellose를 도포합니다. 시술 중 동물이 움직일 경우, 꼬리를 들어 올려 케타민(Ketamine) 부스터를 복강 내로 투여하십시오.첫 번째 동물의 캐뉼라 삽입 90분 후, 전방에서 캐뉼라를 부드럽게 뽑아내고 양쪽 눈에 윤활 젤을 도포합니다. 이후 캐뉼라를 제거함에 따라, 동물이 완전히 회복될 때까지 각 마우스를 수술대 위의 케이지에 다시 넣습니다. 모든 캐뉼라를 제거한 후에는 알코올 스왑으로 소독합니다.그 다음, 공기를 채운 60 milliliter 주사기를 사용하여 5-way 매니폴드, 30 gauge 바늘, 30 gauge 튜브 및 캐뉼라에서 Heparin sodium을 밀어내어 제거합니다. 이어서, 증류수를 채운 60 milliliter 주사기로 모든 기구를 헹굽니다. 마지막으로, 60 milliliters의 공기를 이용해 모든 재료에서 증류수를 밀어내어 제거한 후, 소독 및 세척된 장비를 나중에 사용할 수 있도록 보관합니다.허혈-재관류 손상 7일 후 공초점 현미경 이미징을 통해 신경세포 핵의 NeuN 면역표지를 확인한 결과, 허혈-재관류 자극 이후 상당한 수준의 신경세포 소실이 나타났습니다. 실제로 대조군과 허혈-재관류 유도 안구의 NeuN 양성 세포를 수동으로 정량화한 결과, 손상 후 신경절 세포층의 신경세포 수가 감소한 것으로 나타났으며, 이는 허혈-재관류로 인한 세포 사멸이 발생했음을 보여줍니다. 또한 망막전위도 검사를 통해 기록된 a-파와 b-파의 진폭 감소는 손상되지 않은 대조군 안구와 비교하여 허혈-재관류로 인해 망막 신경 기능의 손상이 발생했음을 의미합니다.이 기술을 숙달하면 마우스가 마취에서 깨어나기를 기다리는 마지막 2시간을 포함하여, 동물 10마리에 대해 약 5시간 동안 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 깊은 마취 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 효과적인 진정 상태가 유지되어야 동물의 움직임으로 인한 캐뉼라의 이탈을 방지할 수 있기 때문입니다.이 절차를 마친 후, 망막 기능에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 망막전위도와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술을 통해 안과 신경과학 및 혈관 생물학 분야의 연구자들은 설치류에서 망막 신경혈관 병인과 치료적 개입을 탐구할 수 있었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 안구 전방 캐뉼라 삽입을 통해 표적 망막 손상을 유도하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.수술 도구를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으며, 본 절차를 수행하는 동안에는 효과적인 날카로운 물체 폐기함 사용과 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.

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녹내장은 세계에서 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 고가 intraocular 압력은 큰 위험 요소입니다. 레이저 photocoagulation 유도 안구 고혈압은 물론 기존 동물 모델 중 하나입니다. 이 동영상은 쥐에서 아르곤 레이저 photocoagulation에 의해 안구 고혈압을 유발하는 방법을 보여줍니다.

SD 쥐에서 레이저 유도 만성 안구 고혈압 모델

출처: Lani-Louzada, R., et al., 설치류의 외과적 유도 녹내장에 대한 변지 혈관신경총의 전원형 소작. J. Vis. Exp. (2022)이 비디오는 쥐 모델에서 상승된 안압(IOP)의 유도 및 모니터링을 보여줍니다. 이 과정에는 변부 혈관을 소작하는 것이 포함되며, 그 결과 혈관 폐색과 안압 상승이 발생합니다. 그런 다음 쥐가 회복되도록 하고 IOP는 비교를 위해 실험 눈과 대조 눈 모두에서 정기적으로 모니터링됩니다.

 쥐 모델에서 상승된 안압 유도

만성 안구 고혈압 쥐의 눈 섬유주 레이저 광응고술을 사용하여 유도된다. 안압 (IOP)는 레이저 치료 후 몇 개월 동안 상승합니다. 시력 실험 동물의 대비 감도의 감소는 optomotor 테스트를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다.

비주얼 결함의 특성을 만성 안구 고혈압의 레이저 유도 마우스 모델

쥐의 망막은 오랫동안 뇌에 접근 창으로 인정을 받고있다. 이 기술 문서에서 우리는 허혈성 손상 후 중추 신경계 내에서 혈관 재생의 실패로 이어질 메커니즘을 연구하는 산소에 의한 망막 병증의 마우스 모델을 사용하는 프로토콜을 제공합니다. 기술 시스템은 망막과 중추 신경계 내에서 기능 혈관의 재성장을 촉진하는 전략을 탐구하는 무력화 할 수 있습니다.

마우스 망막을 사용하여 중추 신경계의 혈관 재생의 평가

여기서는 관찰 녹내장, 망막 신경절 세포의 손실을 초래 쥐 눈 안압을 유도 프로토콜을 제시한다. 자기 마이크로 비드는 전방에 주입과 방수의 유출을 차단하는 자석을 이용하여 홍채 각막 각도에 매료된다.

자기 마이크로 비드 폐색 모델 마우스의 녹내장 안구 고혈압 종속 유도합니다

만성 안구 고혈압 쥐와 쥐, 일치 녹 내장 망막 신경 절 세포의 기능 및 구조 저하로 이어지는 circumlimbal 봉합을 적용 하 여 유도 된다.

쥐와 쥐에 Circumlimbal 봉합에 의해 유도 된 녹 내장의 모델

여기서, 우리는 실리콘 오일의 내카메라 주입에 의해 마우스 눈에 안구 고혈압 과 녹내장 신경 변성을 유도하는 프로토콜을 제시하고 전방 챔버에서 실리콘 오일 제거를위한 절차는 높은 안구 압력을 반환 정상적인.

마우스의 가역성 실리콘 오일 유도 안구 고혈압 모델

산소 유발 망막병증(OIR)은 미숙아 및 증식 성 당뇨병 망막증의 망막병증과 같은 허혈성 망막 질환을 모델링하고 신생아 질환에 대한 항 혈관 신생 약물을 평가하는 개념 증명 연구의 모델로 사용될 수 있다. OIR는 정량화 될 수있는 망막에서 견고하고 재현 가능한 신생 혈관화를 유도합니다.

설치류에 있는 허혈성 망막 질병을 위한 산소 유도한 망막병증 모형

여기서, 우리는 간단한 봉합사 및 클램프를 사용하여 일시적인 양측 공통 경동맥 폐색에 의한 망막 허혈의 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 심혈관 비정상으로 인한 망막 허혈의 병리학적 메커니즘을 이해하는 데 유용할 수 있습니다.

과도 양측 공통 경동맥 폐색에 의해 유도된 허혈성 망막 손상의 뮤린 모델

이 프로토콜은 망막 플랫 마운트 마우스의 제조 및 면역형광 염색 및 분석을 위한 상세한 방법을 기술한다. 마우스 새끼를위한 fluorescein 안저 혈관 조영술 (FFA)의 사용 및 이미지 처리도 자세히 설명되어 있습니다.

산소 유발 망막병증 마우스 모델에서 망막 혈관의 동적 성장 모니터링

이 프로토콜은 전방삽관 삽입 및 안압 상승을 통해 망막 허혈을 유도한 다음 안압 정상화를 통해 재관류를 시작하여 마우스 눈의 망막 허혈-재관류 손상을 모델링합니다.

Induction of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury in a Mouse Eye Model

학습하세요 안압 상승을 통한 망막 허혈-재관류 손상 마우스 모델 수술 기법. 이 방법은 망막 질환의 세포 메커니즘과 치료 접근법을 연구하는 데 활용됩니다.

안압 상승을 통해 망막 허혈 - 재관류 손상의 마우스 모델

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