실시간 PCR에 의한 연안 퇴적물 및 정량 16S의 rRNA의 유전자 및 성적 증명서에서 동시 DNA-RNA 추출

이 절차의 전반적인 목표는 연안 해양 퇴적물에서 수율이 높고 품질이 좋은 DNA와 RNA를 추출한 후 16S 리보솜 RNA 유전자 및 전사체를 정량화하는 것입니다. 해양 퇴적물에서 DNA와 RNA를 추출한 후 정량적 PCR을 수행하는 이 방법은 환경 내 미생물 풍부도와 다양성에 대한 분자 분석의 핵심 단계입니다. 이 기술의 주요 장점은 동일한 샘플에서 DNA와 RNA를 공동 추출하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 정량적 PCR과 같은 다운스트림 분석에 사용할 수

NUI 골웨이의 엔리코 타티(Enrico Tatti) 박사와 에식스 대학교(University of Essex)의 박사 과정 학생인 던컨 스위니(Duncan Sweeney)가 시연을 맡을 예정이다. 텍스트 프로토콜에 따라 RNA free 물질을 준비하고 해안 퇴적물 샘플을 수집한 후 해안 퇴적물에서 DNA와 RNA를 공동 추출하려면 0.5g의 퇴적물을 2ml 비드 용해 튜브로 옮깁니다. 튜브에 500마이크로리터의 CTAB 인산염 완충액과 500마이크로리터의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올을 추가하고 5-10회 반전시켜 샘플을 균질화합니다.

2.5 분 동안 최고 속도로 소용돌이 한 후 16, 000 회 g, 4 °C에서 10 분 동안 회전합니다. 그런 다음 흄 후드에서 상단 수성층을 추출하여 새로운 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 샘플을 얼음 위에 놓고 500마이크로리터의 얼음으로 만든 클로로포름:이소아밀 알코올을 첨가합니다.

그런 다음 에멀젼이 보일 때까지 튜브를 여러 번 뒤집고 이전과 같이 원심분리합니다. 흄 후드에서 상단 수성층을 추출하고 새로운 멸균 1.5ml 튜브에 넣습니다. 그런 다음 핵산을 침전시키기 위해 30%PEG 염화나트륨 용액을 두 부피 넣고 잘 섞습니다.

얼음 위에서 2시간 동안 배양하거나 샘플을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 그대로 두십시오. 외피 후에, 16, 20 분 동안 4 섭씨 온도에 000 시간 g에 표본을 원심 분리하십시오. 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 부드럽게 제거하고 펠릿을 방해하지 않도록 합니다.

튜브에 약 10마이크로리터의 PEG 용액을 남겨두고 얼음처럼 차가운 70% 에탄올 1ml를 추가합니다. 샘플을 회전시킨 후 마이크로피펫을 사용하여 펠릿을 만지지 않도록 주의하면서 에탄올을 천천히 제거합니다. 그런 다음 5초 동안 원심분리하고 잔류 에탄올을 제거합니다.

펠릿을 50마이크로리터의 DEPC 처리수를 사용하여 다시 현탁시키기 전에 펠릿을 5분 동안 자연 건조시키십시오. DNA의 경우 15마이크로리터, RNA의 경우 30마이크로리터 샘플을 분취합니다. 가장 중요한 단계는 상등액을 제거하는 동안 DNA/RNA 펠릿이 이탈되지 않도록 하고 펠릿을 물에 재현탁하기 전에 잔류 에탄올이 남아 있지 않도록 하여 다운스트림 분자 반응을 억제하는 것입니다.

RNA 샘플의 DNA를 분해하기 위해 30마이크로리터의 핵산 분취액에 3마이크로리터의 DNase I 완충액과 1.5마이크로리터의 DNase I를 추가합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. DNase 불활성화 시약을 30초 동안 볼텍싱하여 혼합합니다.

그런 다음 4.8마이크로리터의 용액을 샘플에 넣고 실온에서 5분 동안 배양하고 때때로 튜브 바닥을 두드려 용액을 혼합합니다. 샘플을 회전시킨 후 RNA가 포함된 상등액을 침전물이 전달되지 않도록 주의하면서 새 튜브로 옮깁니다. RNA 품질을 확인하려면 18마이크로리터의 멸균 RNase가 없는 탈이온수를 첨가하여 2마이크로리터의 RNA를 10분의 1로 희석합니다.

별도의 PCR 반응에서 1마이크로리터의 순수 또는 10분의 1의 RNA를 멸균 0.5밀리리터 PCR 튜브에 추가합니다. 텍스트 프로토콜의 표에 따라 PCR 반응 성분을 추가하여 16S 리보솜 RNA 유전자를 증폭합니다. 양성 대조군, PCR 억제제 대조군 및 음성 대조군을 포함합니다.

그런 다음 다음 증폭 파라미터를 사용하여 PCR 반응을 실행합니다. RNA에서 첫 번째 가닥 cDNA를 생성하려면 텍스트 프로토콜에 따라 반응 시약을 0.2 millilit PCR 튜브에 추가합니다. 샘플을 섭씨 65도에서 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 샘플을 얼음 위에 최소 1분 동안 놓고 섭씨 25도에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후, 텍스트 프로토콜에서 여기에 나열된 표의 시약을 추가하고 섭씨 55도에서 50분 동안 배양합니다. 그런 다음 섭씨 72도에서 10분 동안 반응을 비활성화합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 qPCR에 대한 DNA 및 RNA 표준물을 생성한 후 환경 DNA 및 cDNA 샘플, 표준물질 및 qPCR 시약을 얼음에서 해동합니다. 핵산 표준물질을 희석하고 환경 DNA와 cDNA를 깔끔하게 10에서 마이너스 3까지 10 분의 1로 희석합니다. 총 반응 횟수에 10%를 더한 마스터 믹스를 만들고 잘 혼합합니다.

19마이크로리터의 마스터 믹스와 1마이크로리터의 템플릿을 96웰 광학 qPCR 플레이트의 각 웰에 3배로 추가합니다. qPCR 광학 덮개를 사용하여 플레이트를 덮습니다. 그런 다음 플레이트를 잠시 원심분리하여 qPCR 기계의 가열 블록에 넣습니다.

그런 다음 qPCR 관리자 소프트웨어를 연 다음 프로토콜 탭을 클릭하고 새로 만들기를 클릭하고 다음 증폭 조건을 추가합니다. 샘플 부피를 20마이크로리터로 설정하고 OK를 클릭한 다음 프로토콜을 저장합니다. 이제 플레이트 탭을 선택합니다.

그런 다음 Edit Selected(선택한 항목 편집)에서 Select Fluorophore(형광단 선택)를 클릭합니다. 해당 프로브에 대한 리포터 염료를 추가하고 확인을 클릭합니다. 표준물질이 포함된 wells를 강조 표시한 다음 Sample Type(샘플 유형) 메뉴에서 Standard(표준)를 선택합니다. Replicate Series(시리즈 복제)를 선택하여 Replicate Size(복제 크기)를 3으로 변경하고 Apply(적용)를 클릭합니다.

Dilution Series를 선택하여 표준 농도에 대해 계산된 시작 농도를 추가합니다. 희석 계수 10을 나타내고, 표준 곡선이 플레이트에 추가된 순서에 따라 감소 또는 증가를 선택한 다음 적용을 클릭합니다. 알 수 없는 샘플이 포함된 웰 위치를 강조 표시하고 Sample Type 드롭다운 메뉴에서 Unknown을 선택합니다.

Replicate Series(계열 복제)를 선택하고 Replicate Size(복제 크기)를 3으로 변경한 다음 Apply(적용)를 클릭합니다. Sample Name(샘플 이름)에서 샘플 이름을 편집하고 템플릿 제어 웰이 없는 경우 절차를 반복합니다. 그런 다음 플레이트 편집기 상자에서 확인을 클릭하고 파일을 저장합니다.

그런 다음 실행 시작을 클릭합니다. 실행이 완료되면 [Quantification] 탭을 선택하여 표준 곡선, 표준 곡선 설명자 및 증폭 플롯을 표시합니다. 마지막으로, Quantification Data 탭을 선택하여 Cp 값과 알려지지 않은 샘플의 유전자에 대한 해당 시작 수량을 선택합니다.

text protocol에 따라 wet weight sediment의 g당 유전자 사본 수를 결정합니다. 이 겔 이미지에서 볼 수 있듯이 성공적인 핵산 추출은 고분자량 게놈 DNA 밴드의 존재 외에도 날카로운 23S 및 16S 리보솜 RNA 밴드가 보이는 명확한 DNA 및 RNA 밴드를 생성합니다. 이 수치는 qPCR 반응에 사용할 표준 곡선을 생성하기 위해 10배 희석 범위를 올바르게 준비하고 증폭할 때 각 표준 희석 간에 3.3 사이클 차이가 있음을 보여줍니다.

교차 지점 또는 Cp 값을 템플릿 없음 컨트롤 또는 NTC(있는 경우)에서 보고하는 것이 중요합니다. 이 경우 3.3 사이클의 표준 및 미지 샘플에 대한 Cp 컷오프 또는 NTC의 Cp 값보다 높은 로그 폴드가 앞서 설명한 대로 부과됩니다. 여기서, 환경 시료 증폭을 깔끔하게, 10에서 마이너스 1로, 10에서 마이너스 2로, 10에서 마이너스 3으로 희석을 실시하였다.

깔끔한 샘플은 증폭되지 않았고 10에서 마이너스 10에서 마이너스 3까지의 Cp 값은 각각 24.12, 26.02 및 28.40이었습니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이 0.99의 R 제곱 값과 90에서 110% 범위 내의 PCR 효율을 포함한 표준 곡선 설명자가 필요합니다. 이 실험에서 NTC Cp는 30.5였고 27.2의 음의 Cp 컷오프가 적용되었습니다.

유전자 풍부도를 습식 퇴적물 1g당 2.5 곱하기 10 곱하기 7번째, 7번째 10 곱하기 10 곱하기 10 각각 마이너스 1, 10 곱하기 마이너스 2 희석이 나왔다. 10에서 마이너스 3 희석 Cp는 NTC 컷오프보다 컸습니다. 이 경우, 10에서 음수 2를 최적 템플릿 희석으로 선택했습니다.

이 절차를 시도하는 동안 RNA는 빠르게 분해될 수 있으므로 샘플을 얼음 위에 보관하고 장갑을 사용하여 항상 RNase로 인한 오염을 방지하는 것이 중요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 우리는 페놀 : 클로로포름 및 이자밀 알코올을 사용하고 있으며 이는 매우 위험 할 수 있음을 잊지 마십시오. 그리고 이 절차를 수행하는 동안 실험실 가운, 장갑 및 보호 안경을 착용하고 화학 후드 아래에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 DNA와 RNA를 추출하고 해양 연안 퇴적물에서 유전자 및 전사체 풍부도를 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차는 DNA와 RNA를 추출하고 토양을 포함한 대부분의 환경 샘플에서 다양한 유전자 표적을 정량화하는 데 쉽게 사용할 수 있습니다.