Name: 빠른 스캔 전자 스핀 공명 이미징 생리 학적으로 중요 매개 변수에 대한 새로운 길을 엽니 다 생체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 배우세요 빠른 스캔 EPR 이미징 기술을 통해 산소 농도, pH, 산화환원 상태 등 생리학적 매개 변수를 정량적으로 분석하는 방법을. 이 기술은 종양 미세환경 연구와 암 연구에 새로운 가능성을 열어줍니다.

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NIH에 의해 작품의 부분적인 지원은 GRE, 하워드 J. Halpern, PI에 NIBIB의 EB002807 및 CA177744 (GRE와 SSE)와 P41의 EB002034을 부여하고, 덴버 대학에서 기꺼이 인정한다. 마크 Tseytlin은 NIH R21 EB022775, NIH K25 EB016040, NIH / NIGMS U54GM104942에 의해 지원되었다. 저자는 mHCTPO의 합성 산도 민감한 TAM 라디칼의 합성 오하이오 주립 대학에서 지금은 웨스트 버지니아 대학의 발레리 Khramtsov, 및 Illirian Dhimitruka에 감사, 메릴랜드 대학의 제럴드 로젠 조셉 카오에 , proxyl, BMPO 및 nitronyl 라디칼.

250 MHz에서 신속한 스캔 코일 드라이버 1. 설치 <ol><li> 빠른 스캔 실험 조건의 계산 주 : RS-EPR에서 가장 중요한 파라미터는 주파수 스캔 및 스캔 넓이 (수학 식 3)의 제품 스캔 속도, α이다. 좁은 스캔 ​​폭의 경우, 빠른 스캔 속도가 사용되며, 넓은 스윕 폭에 대해, 느린 검색 속도가 사용된다. 다음은 후자의 경우를 단계별로 7 만 T 스위프 폭 6.8 kHz에서 스캔 주파수의 실험 코일 드라이버 매개 변수에 도착하는 방법을 보여줍니다. <ol><li> 공진기 대역폭 (BW 해상도)를 결정합니다. <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq1.jpg" /> (1) 여기서 V 입술 공진기의 동작 주파수이고, Q는 품질 계수이다. Q = (90)는 대표적인 결과 데이터를 얻기 위해 사용되는 신속한 검색 공진기 일반적이다. </li><li> 모든 α, 빠른 스캔 속도를 결정공진기 대역폭 빚 <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq2.jpg" /> (2) <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq3.jpg" /> N 종종 보수적 5-6로 선택된 정수이고, ΔB의 PP가 mT 내지 피크 - 투 - 피크 선폭 유도체이고, A는 로렌츠 선폭에 대한 T / s의 경우 스캔 속도이다. 참고 : 대표 섹션에서 라디칼의 일반적인 값은 <img alt="식 (4)" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq4.jpg" /> = 0.1 만 T. 이전 신속한 스캔 문헌과 비교; 수학 식 2는 BW 해상도와 동일한 신호 대역폭 (BW 시그마)를 설정함으로써 도출된다. </li><li> 속도에 의해 허용되는 최대 빠른 스캔 주파수를 결정합니다. <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq5.jpg" /> (삼) <img alt="식 (6)" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq6.jpg" /> 여기서 w는 SCA의 폭은N 및 F 스캔 주파수이다. (7) (MT)의 스윕 폭은 생체 내에서 사용되는 전류 프로브, 스펙트럼의 100 %를 커버 할 것이다. 스캔 주파수를 결정하기 위해이 값 (식 2)에서 계산 속도를 사용합니다. <img alt="식 (7)" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq7.jpg" /></li></ol></li><li> 동조 커패시터의 선택과 빠른 주사 코일 드라이버 튜닝 주의 : 급속한 주사 코일 드라이버는 전형적으로 사인파를 발생 공명 모드에서 실행. 공명은 총 리액턴스가 제로에 가까운 있도록 유도 및 용량 성 리액턴스는 동일한 크기와 반대 부호의 수 있습니다 스캔 주파수에서 발생합니다. <ol><li> 하여 빠른 스캔 코일의 인덕턴스 L을 사용하여 1.1.3에서 결정된 주파수 및 (식 4)에 대한 적절한 용량을 결정합니다. <img alt="식 (8)" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq8.jpg" /> <img alt="식 (9)" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq9.jpg" /></li><li> 코일 드라이버 커패시터 상자의 각면에 대한 용량 값을 얻기 위해 반 (식 4)에서의 C TOT 나눈다. <img alt="식 (10)" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq10.jpg" /> <img alt="식 (11)" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq11.jpg" /> 참고 : 빠른 스캔 코일 드라이버가 두 개의 앰프를 가지고있다. 커패시터를 선택했을 때, 용량 상자는 상자의 각면에 동일 용량과 균형을 할 필요가있다. 양측은 시리즈에 있습니다. </li><li> 커패시터 상자의 상단 덮개를 풀고 단계 1.2.2에서 결정된 값과 동일 양쪽에 커패시터를 삽입합니다. </li><li> 커패시터 상자의 상단을 교체하고이 켜진 상태로 유지하기 위해 그것을 아래로 나사. </li><li> 정현파의 최대 진폭을 가질 때까지 공진 된 코일 드라이버의 전면 패널을 사용하여, 출력 주파수를 조정한다. </li></ol></li></ol> 시약 및 팬텀 2. 준비 <ol><li> 라디에이터의 제조CAL을 <ol><li> 냉장고에서 15 N-PDT를 제거하고 용기를 실온 (10 ~ 15 분)에 올 수 있습니다. </li><li> 분석 저울을 사용하여 15 N-PDT의 1.4 밀리그램을 달아. </li><li> 0.5 mm의 최종 농도 15 ml의 탈 이온화 (DI) H 2 O 15 N-PDT의 1.4 mg을 추가합니다. 주 : 4- 옥소 -2,2,6,6- 테트라 (2 H 3) 메틸 -1- (3,3,5,5- 2 H 4, 1-15 N) piperdinyloxyl (15 N-PDT)를 1 H 4- 메틸 -3- 카르 바 모일 2,2,5,5- 테트라 (2 H 3) 메틸 -3- pyrrolinyloxyl (15-N mHCTPO) 및 3- 카르복시 2,2,5,5- 테트라 (2- H 3) 메틸 -1- (3,4,4- 2 H 3, 1 - 15 N) 피 롤리 (15 N-Proxyl) (25) (그림 1E-G) 라디칼은 수용액에서 장기간 안정성 (2 년)이 있고 실온에서 첨가 하였다. 이들의 고체 형태는 일반적으로 이러한 년간 안정 라디칼을 유지하기 위해 냉동 또는 냉장 보관한다.니트 록 시드 라디칼의 안정성은 일반적으로 그들에게 무독성 만들고, 용매가 물인 경우에 이들의 제조는 통상의 벤치 탑에서 수행 될 수있다. 유기 용제를 사용하는 경우 적절한 개인 보호 장비 (PPE)이 장착하면서, 흄 후드 내에서 질산화물 솔루션을 준비합니다. </li></ol></li><li> 산도 민감한 틸 라디칼의 제조 <ol><li> 급진적 인 트리 아릴 메틸 0.7 밀리그램 (ATAM 4) (26) 라디칼 (1,400g / 몰) 밖으로 달아 무수 에탄올 200 μL에 용해. </li><li> KH 2 PO 4 (136.1 g / 몰) 0.00681 g을 달아 최종 농도 1mM, 50 mL의 탈 이온수에 용해. </li><li> KOH (56g / 몰) 2.8 g을 달아 1 M.의 최종 농도를위한 DI 물 50ml에 용해 </li><li> KOH 7.0의 pH를 조정하기 위해 인산 버퍼 (2.2.2)에 적가 추가합니다. </li><li> 최종 진한 1 mM의 인산 완충액 800 μL 및 무수 에탄올에 ATAM 4의 200 μl를 추가80:20 버퍼에 0.5 mm의 entration : 에탄올. </li><li> 반복의 pH = 7.2에서 ATAM 4 샘플을 만들 수 2.2.1-2.2.5 단계를 반복합니다. </li><li> 별도의 6mm 석영 샘플 튜브에 ATAM 4, pH는 7.0, ATAM 4, pH는 7.2를 놓습니다. </li><li> 그 사이에 2 mm 두께의 스티로폼 스페이서와 더불어, 16mm 석영 EPR 튜브에 모두 6mm 석영 EPR 튜브를 놓습니다. 주의 : 샘플을 석영 튜브의 벽은 ATAM 샘플과 3 mm 분리 수율 0.5 mm 두께이고, 2 mm 스페이서 이외에. 사용의 pH에 민감한 트리 틸 라디칼은 오하이오 주립 대학 (26)에서 합성 하였다. 촬상에 사용 된 예 ATAM 4라고한다. pH를 감도를 차지하는 반응은도 1a에 도시된다. </li></ol></li><li> BMPO-OH의 생성 <ol><li> KH 2 PO 4 680 mg의 무게를 50 mM의 최종 농도 100 ml의 탈 이온수에 용해. </li><li> 1 M KOH 현명한 드롭 추가pH는 7.3로 인산 버퍼. </li><li> BMPO의 50 밀리그램 (199.25 g / 몰)을 달다. </li><li> 16mm의 석영 관의 조사 인산 완충액 5 ㎖로 BMPO의 50mg을 결합. </li><li> 300 mM의 과산화수소의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 5 분 동안 중압 450 W의 UV 램프와 16mm의 석영 관의 조사의 혼합물을 조사. </li><li> 유리 전달 피펫을 사용하여, 석영 관의 조사 벗어나 3mm 분배기와 16mm 석영 시험관의 한쪽면에 조사 BMPO-OH의 용액 2.5 mL로 옮긴다. </li><li> 3mm 분배기와 16mm 석영 샘플 튜브의 다른 측면에 조사 BMPO-OH의 나머지 2.5 ml의 이동. </li></ol></li><li> dinitroxide 라디칼의 제조 <ol><li> 47.5 mm의 원액 1 ml의 DMSO에 2 H 15 N-이황화 dinitroxide (그림 1C)의 24.7 mg의 달다. </li><li> 10 mM 트리스 버퍼를 준비하고 pH를 7.2로 조정한다. </li><li> (40)을μL은 원액 dinitroxide와 1 mM의 최종 농도 트리스 완충액으로 희석한다. </li><li> 중앙에 10mm 분배기와 16mm 석영 샘플 튜브에 버퍼 dinitroxide 용액 250 μl를 놓습니다. </li><li> 글루타티온 154 mg의 무게를 100 mM의 최종 농도 트리스 완충액 5 ㎖ 추가. </li><li> monoradical 라디칼로 변환 할 10mm 디바이더의 일측에 1 밀리미터 dinitroxide 용액 250 μL의 100 mM의 글루타치온 용액 5 μL를 추가한다. </li></ol></li><li> nitronyl의 질산화물의 제조 <ol><li> 냉장고에서 라디칼을 제거하고 용기를 실온 (10 ~ 15 분)에 올 수 있습니다. </li><li> nitronyl (390g / 몰)의 1.9 밀리그램을 달아. </li><li> KOH 0.56 ㎎을 칭량을 1 mM의 최종 농도를 위해 10 ml의 탈 이온수에 용해. </li><li> 0.5 밀리미터 nitronyl 최종 농도 1 mM의 KOH 용액 10 ㎖로 nitronyl의 1.9 ㎎을 섞는다. 참고 : necess 경우진은 nitronyl의 속도 매화에 vortexer를 또는 초음파기를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 250 MHz에서 신속한 검사 장비 3. 설정 참고 : 완충 용액으로 공진기 Q 및 조정에 대한 유사한 효과가 급진적 질산화물의 수성 샘플과 공진기의 튜닝 이미지화 할 수있는 샘플 설정하는 좋은 방법입니다 <ol><li> 조정 급진적 질산화물의 수성 샘플 공진기. <ol><li> 16mm 석영 EPR 튜브에 물 샘플에서 0.5 밀리미터 (15) N-PDT의 15 ml에 삽입합니다. </li><li> 크로스 루프 RS-EPR 공진기의 검출면에 석영 관을 삽입한다. </li><li> 이 샘플을 포함하는 검출 측의 주파수와 일치 할 때까지 구 소스의 주파수를 변경한다. 수동 소프트웨어에 원하는 값을 입력하여 250 MHz의 소스의 캐리어 주파수를 변경. </li><li> FREQUEN 일치 여진 쪽의 주파수를 변경공진기 실험 소스 및 검출 측 CIES. 제조사의 프로토콜에 따라 공진기 내부 가변 캐패시터 돌려 여진 쪽의 주파수를 변경한다. </li></ol></li><li> 악기 콘솔 및 메인 자석을 설정 <ol><li> 분광계를 켜고 가로축에 시간이 임시 데이터를 기록하는 실험을 선택합니다. </li><li> 소프트웨어 내 65,536 포인트의 수 10 나노초의 시간 기준을 설정한다. </li><li> 강한 좁은 신호 만에 평균의 수를 설정하고 폭 넓은 또는 약한 신호에 대한 45,000한다. </li><li> 콘솔 소프트웨어에서 실험 매개 변수를 보내 주 필드 자석에 전원을 공급하기 위해 소프트웨어의 &quot;참여&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 9 (MT)에 대한 주요 자기장을 설정합니다. </li><li> 50dB의 전원을 감쇠 노브를 설정하고 7 W 높은 파워 앰프의 전원을 켭니다. </li></ol></li></ol> 4. 실행빠른 스캔 실험의 참고 : BMPO-OH (24)를 포함하는 팬텀의 분석에 관한 구체적인 지시 사항은, pH가 민감한 TAM 라디칼 19,27 및 산화 환원에 민감한 dinitroxides (28)는 문헌에 제공됩니다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 표준 질산화물 샘플의 전원 포화 주 : pH와 산화 환원 상태에 민감 라디칼보고하는 데 사용되는 동일한 실험 조건 하에서 기준 샘플 질산화물 라디칼 전력 포화 곡선을 수행하는 것이 유리하다. <ol><li> 제 1 절 (6.8 kHz에서의 검색 빈도와 7 (MT)의 스캔 폭)의 값으로, 빠른 스캔 코일 드라이버를 켭니다. </li><li> 50dB에서 시작, 100,000 평균과 빠른 스캔 스펙트럼을 수집합니다. 3dB에 의해 감쇠를 감소하고 측정을 반복한다. 또는 다리 판독에 절연 측정이 &lt;0만큼 오랫동안 0dB의 감쇠기 설정 될 때까지 계속합니다. </li><li> 전송 t그 컨벌루션 프로그램에 원료 빠른 스캔 데이터 (매트랩 작성된 예를 들어)과 흡수 스펙트럼에 대한 원시 데이터를 처리한다. </li><li> 프로그램에 포인트와 타임베이스의 스캔 주파수 스위프 폭, 번호를 입력하고 흡수 신호로 원료 빠른 스캔 신호를 처리 할 수있는 프로그램을 실행합니다. </li><li> 공진기의 제곱근 (와트)에 입사 전력의 함수로서 흡착 된 신호의 진폭을 그린다. 비 포화 체제에서, 진폭은 입사 전력의 제곱근에 선형으로 의존한다. </li><li> 0,0에서 시작하는 추세선을 장착하고 선형 응답 영역에 속하는 모든 데이터 포인트를 포함한다. 선형 응답 영역에서 마이크로파 전력의 제곱근에 비례하는 신호 진폭이 증가한다. </li><li> 더 높은 힘이 추세를 추정하고, EPR 신호 강도를 비교합니다. 신호 진폭은 외삽 추세선에서 3 % 이상을 일탈하지 않는 가장 높은 전력을 사용한다. 순으로 하였다정상적으로 동작하는 빠른 스캔 신호의 디콘 볼 루션에 대한 연구는 여전히 입사 신호 전력에 대하여 선형 응답 영역에 있어야한다. 주 : 원료 빠른 스캔 데이터의 전송은 네트워크 연결을 통해 또는 썸 드라이브를 통해 수행 될 수있다. 이 경우에, 전송은 프로그램이 데이터 수집 소프트웨어가 동일한 컴퓨터에없는 (매트랩) 원 데이터를 처리 할 수 ​​있기 때문에 필요하다. 원시 데이터를 처리 컨벌루션 알고리즘 (29)에 대하여 설명한다. </li></ol></li></ol>

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<li>Stoner, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-detected+rapid-scan+EPR+at+250+MHz%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Direct-detected rapid-scan EPR at 250 MHz.</a> J. Magn. Reson. 170 (1), 127-135 (2004).</li>
<li>Tseytlin, M., Biller, J. R., Mitchell, D. G., Yu, Z., Quine, R. W., Rinard, G. A., Eaton, S. S., Eaton, G. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTseytlin%2C+M+%22EPR+Newsletter%22">EPR Newsletter</a>. 23, Russian Acaademy of Sciences, Zavoisky Physical-Technical Institute. 8-9 (2014).</li>
<li>Biller, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+nitroxides+at+250+MHz+using+rapid-scan+electron+paramagnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Imaging of nitroxides at 250 MHz using rapid-scan electron paramagnetic resonance.</a> J. Magn. Reson. 242, 162-168 (2014).</li>
<li>Biller, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Sensitivity+for+Imaging+Spin+Trapped+Hydroxyl+Radical+at+250+MHz%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Improved Sensitivity for Imaging Spin Trapped Hydroxyl Radical at 250 MHz.</a> Chem. Phys. Chem. 16 (3), 528-531 (2015).</li>
<li>Burks, S. R., Bakhshai, M. A., Makowsky, M. A., Muralidharan, S., Tsai, P., Rosen, G. M., Kao, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2H%2C+15N-Substituted+nitroxides+as+sensitive+probes+for+electron+paramagnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">2H, 15N-Substituted nitroxides as sensitive probes for electron paramagnetic resonance imaging.</a> J. Org. Chem. 75, 6463-6467 (2010).</li>
<li>Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Hadad, C. M., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+amino+derivatives+of+persistent+trityl+radicals+as+dual+function+pH+and+oxygen+paramagnetic+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of amino derivatives of persistent trityl radicals as dual function pH and oxygen paramagnetic probes.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (32), 10780-10787 (2008).</li>
<li>Elajaili, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+spin+relaxation+times+and+rapid+scan+EPR+imaging+of+pH-sensitive+amino-substituted+trityl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals.</a> Magn. Reson. Chem. 53 (4), 280-284 (2015).</li>
<li>Elajaili, H., Biller, J. R., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y., Tseytlin, M., Buchanan, L. B., Rinard, G. A., Quine, R. W., McPeak, J., Shi, Y., Eaton, S. S., Eaton, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Disulfides+at+250+MHz+to+Monitor+Redox%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Imaging Disulfides at 250 MHz to Monitor Redox.</a> J. Magn. Reson. , (2015).</li>
<li>Tseitlin, M., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvolution+of+sinusoidal+rapid+EPR+scans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Deconvolution of sinusoidal rapid EPR scans.</a> J. Magn. Reson. 208 (2), 279-283 (2011).</li>
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<li>Biller, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+dependence+of+electron+spin+relaxation+times+in+aqueous+solution+for+a+nitronyl+nitroxide+radical+and+perdeuterated-tempone+between+250+MHz+and+34+GHz%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Frequency dependence of electron spin relaxation times in aqueous solution for a nitronyl nitroxide radical and perdeuterated-tempone between 250 MHz and 34 GHz.</a> J. Magn. Reson. 225, 52-57 (2012).</li>
<li>Rosen, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimeric-containing+nitronyl+nitroxides+as+spin+traps+for+nitric+oxide%3A+Ssynthesis%2C+kinetic%2C+and+stability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Dendrimeric-containing nitronyl nitroxides as spin traps for nitric oxide: Ssynthesis, kinetic, and stability studies.</a> Macromolecules. 36 (4), 1021-1027 (2003).</li>
<li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-sensitive+mechanism+of+no+scavenging+by+nitronyl+nitroxides%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Redox-sensitive mechanism of no scavenging by nitronyl nitroxides.</a> Free Radical Biol. Med. 36 (2), 248-258 (2004).</li>
<li>Roshchupkina, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+EPR+measurement+of+glutathione+in+tumor-bearing+mice+using+improved+disulfide+biradical%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Bio.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical.</a> Free Radical Bio. Med. 45 (3), 312-320 (2008).</li>
<li>Mitchell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Rapid-Scan+EPR+to+Improve+Detection+Sensitivity+for+Spin-Trapped+Radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of Rapid-Scan EPR to Improve Detection Sensitivity for Spin-Trapped Radicals.</a> Biophysical Journal. 105 (2), 338-342 (2013).</li>
<li>Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trityl+radicals+as+persistent+dual+function+pH+and+oxygen+probes+for+in+vivo+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy+and+imaging%3A+Concept+and+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Trityl radicals as persistent dual function pH and oxygen probes for in vivo electron paramagnetic resonance spectroscopy and imaging: Concept and experiment.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (23), (2007).</li>
<li>Biller, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+spin-lattice+relaxation+mechanisms+of+rapidly-tumbling+nitroxide+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Electron spin-lattice relaxation mechanisms of rapidly-tumbling nitroxide radicals.</a> J. Magn. Reson. 236, 47-56 (2013).</li>
<li>Redler, G., Barth, E. D., Bauer, K. S., Kao, J. P. Y., Rosen, G. M., Halpern, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electron+paramagnetic+resonance+imaging+of+differential+tumor+targeting+using+cis-3%2C4-di%28acetoxymethoxycarbonyl%29-2%2C2%2C5%2C5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo electron paramagnetic resonance imaging of differential tumor targeting using cis-3,4-di(acetoxymethoxycarbonyl)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl.</a> Magn. Reson. Med. 71 (4), 1650-1656 (2013).</li>
</ol>

우리는 공개할 것이 없습니다.

신속한 스캔 신호는 CW보다 높은 주파수 성분을 가지며, 선폭, 완화 시간에 따라 크게 공진 대역폭 및 급속 주사 속도를 요구한다. 특정 실험에 필요한 대역폭은 선폭 자계 (식 2)의 스캔 속도에 기초한다. 연구중인 프로브의 완화 시간에 따라서 (T 2, T * 2), 및 주사 속도는 발진 신호의 트레일 링 에지에 나타날 수있다. 250 MHz에서 T 2 ~ 500 나노초과 질산화물 라디칼를 들어 (자기 공명 57 일 록키 마운틴 컨퍼런스, EPEL, B, 등., 2015), 실험 스캔 속도는 종종 어떤 진동을 관찰 할 충분하지 않습니다. 실험은 전형적으로 대역폭 공진 대역폭에 의해 제한된다. 빠른 스캔 실험의 각각의 절반 사이클 감소 또는 필드 / 주파수를 증가 하나에 기록되고, 따라서 실험적 대역폭 ½ t 인(수학 식 1)에 나타낸 바와 같이 고 대역폭을 공진기. 실험 대역폭 파...

다른 의료 영상의 양식을 기준으로, 전자 상자성 공명 영상 (EPRI)는 정량적으로 이미지의 확산의 pH를 1-3, 포 (2) 4-7 온도 (8), 관류와 조직 (9)의 생존, microviscosity 용이성을 포함하여 생리 학적 특성에 유일하게 할 수있다 작은 분자 (10) 및 산화 스트레스 11. 조직에서 글루타치온 (GSH) 세포 (12, 13)에 의해 이황화 분열의 용이성의 평가는 산화 환원 상태를보고 할 수 있습니다. 이러한 주파수는 강도가 유전 손실 효과에 의해 감소되지 않는 작은 동물 용 화상을 생성하는 (수 cm까지) 조직 침투에 충분한 깊이를 제공하기 때문에 생체 내 이미징, 250 MHz 및 1 GHz의 사이의 주파수 범위에서 EPR가 선택된다. 예컨대 9.5 GHz의 14 (X 대역), 17 기가 헤르쯔 (K 유 - 밴드) (15, 16)와 같은 높은 주파수는, 피부, 모발 또는 단일 세포의 영상화에 사용할 수각각. 모든 주파수에서 EPRI의 성공은 자신의 위치와 운명 이미징 될 수 있도록 조직에 대한 특정 상자성 스핀 프로브에 따라 달라집니다. 전자 스핀 프로브의 환경이 공간적으로 불균일 경우 EPR 스펙트럼은 모든 위치의 기여의 합계이다. 스펙트럼 - 공간 영상은 작은 공간 세그먼트의 배열로 샘플의 볼륨을 분할하고,이 세그먼트 (17)의 각각에 대한 EPR 스펙트럼을 계산합니다. 이것은 EPR 스펙트럼의 공간적 변화를 측정하여 로컬 환경을 맵핑 할 수있다. 자기장 기울기는 돌기라고 EPR 스펙트럼으로 공간 정보를 인코딩하기 위해 사용된다. 스펙트럼 - 공간 이미지는이 돌기 (18, 19)에서 재구성된다. RS-EPR에서 자기장 (그림 2) (20, 21) 전자 스핀 완화 시간에 짧은 상대를하는 시간에 공명을 통해 스캔됩니다. 디<html> 빠른 주사 신호 econvolution 종래 제 파생 CW 스펙트럼의 첫번째 적분 동등 흡수 스펙트럼을 제공한다. 스핀 시스템 응답을 모두 흡수 및 분산 성분이 측정되도록 빠른 주사 신호는 직교 검출된다. 이것은 본질적으로 두 단위 시간당 데이터 양을 수집한다. 더 높은 전력이 포화에 대한 걱정없이 사용할 수 있도록 빠른 스캔 실험 신호의 채도는 CW에 대한보다 높은 전력에서 발생한다. (20, 22)은 더 많은 평균화 CW에 비해 단위 시간당 수행 될 수있다. 높은 전력 직접 직교 검파 및 단위 시간 당 평균보다 높은 품질의 이미지를 초래 특히, 공간 분리를 정의 높은 경사 돌기에서 빠른 스캔 더 나은 신호 대 잡음비 (SNR)를 제공하기 위해 결합한다. 빠른 스캔 23로 CW에 대한 한 약 10 시간을 필요로하는 팬텀의 이미지에 대해 동일한 SNR에 대해 달성했다. 텐트 &quot;&gt; 증가 된 SNR은와 OH의 반응에 의해 형성된 저농도 스핀 트랩 부가 물 250 MHz에서 실험을 허용 5-tert- 부 톡시 -5- 메틸 -1- pyrroline- N의 옥 시드 (BMPO-OH) 될 이황화 링커로 연결된 CW 방법 (24)에 눈에 보이지 않는. Dinitroxides은 글루타티온에 의해 분열에 민감한, 그래서 세포의 산화 환원 상태를보고 할 수 있습니다. 균형이 존재의 디 - 및 모노 급진적 인 형태 사이에, 글루타티온 존재의 농도에 의존한다. 이러한 변화를 관찰하면 전체 5 mT 내지 넓은 범위의 촬영이 필요하고, 실험 CW 자계 스테핑에 비해 빠른 스캔 EPR 훨씬 빨리 달성 될 수있다. 분광계 메인 계자 자석, 빠른 주사 코일 드라이버 및 신속한 스캔 간 루프 공진기 전체 신속한 검사 시스템은 네 개의 부분으로 구성된다. 메인 제만 필드 설정 분광계 및 CW 실험에서와 같은 메인 계자 함수상기 공진기로부터의 데이터를 수집. 빠른 스캔 코일 드라이버는 빠른 스캔 크로스 루프 공진기에 특별히 디자인 된 빠른 스캔 코일에 들어가는 사인 스캔 전류를 생성한다. 빠른 스캔 간 루프 공진기에 급속 주사 코일 (3) 및 15 kHz에서 주파수 스위프 큰 균일 한 자기장을 생성한다.

<table><tbody><tr><td>4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperdinyloxyl (15N-PDT)</td><td>CDN 동위원소&nbsp;</td><td>M-2327</td><td>98% 원자 15N, 98% 원자 D, 캐나다 퀘벡</td></tr><tr><td>4-1H-3-카르바모일-2,2,5,5-테트라(2H3)메틸-3-피롤리닐옥실(15N-mHCTPO)</td><td>N/</td><td>A</td><td>U. 메릴랜드에서 합성되고 참고 문헌 29</td></tr><tr><td>에 설명되어 있습니다.3-카르복시-2,2,5,5-테트라(2H3)메틸-1-(3,4,4-2H3,1-15N)피롤리디닐옥실(15N-Proxyl)</td><td>N/A</td><td></td><td>U. Maryland에서 합성되고 Reference 25</td></tr><tr><td>4 mm Quartz EPR Tubes</td><td>Wilmad Glass</td><td>707- SQ-100M</td><td></td></tr><tr><td>4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4)piperdinyloxyl (14N-PDT)</td><td>CDN 동위원소</td><td>D-2328</td><td>98% 원자 D, 퀘벡 캐나다</td></tr><tr><td>pH 민감성 트리틸 라디칼(aTAM4)</td><td>오하이오 주립 대학 오하이오 주립대학교</td>에서 합성된 <td>N/A</td><td> University and described in Reference 26</td></tr><tr><td>Potassum Phosphate, Monobasic</td><td>J.T. Baker Chemicals</td><td>1-3246</td><td></td></tr><tr><td>6 mm Quartz EPR Tubes</td><td>Wilmad Glass</td><td>Q-5M-6M-0-250/RB</td><td></td></tr><tr><td>8 mm Quartz EPR Tubes</td><td>Wilmad Glass</td><td>Q-7M-8M-0-250/RB</td><td></td></tr><tr><td>5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide (BMPO)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>U. Maryland에서 합성하고 Reference 30</td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009 SIGMA</td><td>30%</td></tr><tr><td>16 mm Quartz EPR tube</td><td>Wilmad Glass</td><td>16-7PP-11QTZ</td><td></td></tr><tr><td>Medium Pressure 450 W UV lamp</td><td>Hanovia</td><td>679-A36</td><td>Fairfield, NJ</td></tr><tr><td>L-Glutathione, reduced</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G470-5</td><td></td></tr><tr><td>Nitronyl</td><td>NA</td><td>N/A에 설명되어 있습니다.</td><td>U. Maryland에서 합성되고 Reference 31</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide&nbsp;</td><td>J.T. 베이커 화학</td><td>1-3146</td><td></td></tr></tbody></table>

빠른 스캔 전자 스핀 공명 이미징 생리 학적으로 중요 매개 변수에 대한 새로운 길을 엽니 다<em&gt; 생체</em

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

우리는 산소 농도, 산도, 산화 환원에 대한 생체 내 조건 하에서 정량 정보를 제공 할 수있는 빠른 주사 전자 상자성 공명 (RS-EPR)를 사용하여 250 MHz에서 안정 라디칼 리포터 분자의 2 차원 스펙트럼 공간적 이미징 우수한 방법을 보여 상태 및 신호 분자의 농도 (즉, OH •, • NO). 는 RS-EPR 기술 표준 연속파 (CW) 기법에 비해 더 높은 감도가 향상된 공간적 해상도 (1 ㎜) 및 짧은 획득 시간을 갖는다. 팬텀 구성 다양한 1~6 mm로 변화하는 공간적 해상도, 16 μT (160 mg)을 5 (MT 50 G)에 이르는 리포터 분자의 스펙트럼 폭을 테스트 하였다. 빠른 스캔 EPR 효과는 신호 증가 더 많은 전력이 포화하기 전에, 스핀 시스템에 입력 할 수 있도록하는 동안 가교 고리 쌍봉 공진기 여진 및 검출, 노이즈 저감을 분리시킨다. 이종래 CW EPR 실험에서보다 실질적으로 더 높은 신호 대 잡음비로 이끈다.

실험의 제품은 신호 진폭을 나타내는 위색 스케일 화상 (한 스펙트럼, 하나의 공간) 이차원으로 재구성 돌기의 집합이다. 신호가 존재하지 않는 경우 깊고 푸른는 기본이고, 녹색은 낮은 진폭과 빨간색이 최고입니다. X 축 (스펙트럼 치수)을 따라 조각 자기장 축에서 EPR 신호 (EPR 전이)를 도시한다. Y 축 (공간의 치수)를 따라, 신호들 사이의 간격은 공진기의 샘플 사이의 물리적 공간 간격에 대응한다. 그림 3은 CW (그림 3B) 또는 (15) N 대체 질산화물 라디칼 (그림 3D)의 세 가지 유형과 팬텀의 RS (그림 3A)이 획득 한 두 영상의 비교를 보여줍니다. 가장 광범위한 신호는 15 N...

새로운 전자 상자성 공명 (EPR) 방법, 빠른 스캔 EPR (RS-EPR)는, 기존의 연속파 (CW) 기술보다 우수하고 생체 내 이미징을위한 새로운 장소를 엽니 다 2D 스펙트럼 공간 영상에 대한 설명된다. 결과 250 MHz에서 입증되지만, 기술은 주파수에서 적용 가능하다.

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Imaging(RSEPRI)의 전반적인 목표는 생의학 연구에 유용한 산소 농도, pH, 산화환원 상태 및 신호 전달 분자의 농도에 대한 정량적 정보를 제공하는 것입니다. EPRI는 종양 환경과 관련된 암 연구의 핵심 질문들에 답하는 데 사용될 수 있는 도구입니다. Rapid-scan EPR 이미징의 주요 장점은 연속파(CW) EPR 이미징과 비교했을 때, 더 다양한 프로브 분자를 사용하여 훨씬 더 빠른 시간 내에 더 많은 정보를 획득할 수 있다는 점입니다.산화환원 상태나 pH에 민감한 분자들은 rapid-scan EPRI의 강점이 잘 드러나는 좋은 사례입니다. 텍스트 프로토콜에 명시된 대로 rapid-scan 실험 조건의 계산부터 이 절차를 시작하십시오. rapid-scan의 중요한 부분 중 하나는 신호가 공진기 대역폭과 스캔 주파수 소사 폭(sweep width)과 같은 실험 조건에 어떻게 의존하는지 이해하는 것입니다.실험을 제대로 최적화하려면 이 세 가지를 모두 이해해야 합니다. 급속 스캔 코일 드라이버에는 두 개의 증폭기가 있습니다. 커패시터를 선택할 때, 커패시터 박스의 양측에 동일한 정전용량이 배치되어 균형을 이루어야 합니다.양측은 직렬로 연결됩니다. 커패시터 박스의 상단 커버를 나사로 풀어 제거하고, 결정된 값과 동일한 커패시터를 양측에 삽입하십시오. 커패시터 박스의 상단 커버를 다시 덮고 나사를 조여 고정되었는지 확인하십시오.공진 코일 드라이버의 전면 패널을 사용하여 사인파 파형이 최대 진폭을 가질 때까지 출력 주파수를 조정하십시오. 라디칼을 준비하기 위해, N-15 PDT를 냉동고에서 꺼내 용기가 실온에 도달하도록 둡니다. 분석 저울을 사용하여 N-15 PDT 1.4 milligrams를 정량하십시오.최종 농도가 0.5 millimolar가 되도록 N-15 PDT 1.4 milligrams를 탈이온수 15 milliliters에 첨가합니다. 다음으로, 16 millimeter 석英 조사 튜브에 BMPO 50 milligrams와 물 5 milliliters를 혼합합니다. 여기에 300 millimolar 과산화수소 100 microliters를 첨가합니다.16 mm 석영 조사 튜브에 담긴 혼합물을 450 W 중압 자외선 램프로 5분 동안 조사합니다. 유리 전송 피펫을 사용하여 조사된 BMPO-OH 용액 2.5 mL를 석영 조사 튜브에서 3 mm 분할막이 있는 16 mm 석영 샘플 튜브의 한쪽으로 옮깁니다. 나머지 2.5 mL의 조사된 BMPO-OH를 분할막이 있는 석영 샘플 튜브의 반대편으로 옮깁니다.두 번째 중요한 단계는 출력 포화 곡선을 이해하는 것입니다. 스캔 속도가 증가함에 따라, 신호가 포화되기 전에 더 높은 출력과 더 큰 신호 진폭에 도달할 수 있습니다. 신호 진폭을 크게 하는 것은 데이터 획득 시간을 단축하는 또 다른 방법입니다.먼저, 0.5 millimolar N-15 PDT 수용액 샘플 15-milliliter를 16-millimeter 석영 전자 상자성 공명 튜브에 넣어 니트록사이드 라디칼 수용액 샘플로 공진기를 조정합니다. 석영 튜브를 교차 루프 급속 스캔 전자 상자성 공명(RSEPR) 공진기의 검출 측에 삽입합니다. 샘플이 포함된 검출 측의 주파수와 일치할 때까지 기기 소스의 주파수를 변경합니다.이제, 여기(excitation) 측의 주파수를 공진기의 실험 소스 및 검출 측 주파수와 일치하도록 변경하십시오. 공진기 캐비티 내부의 가변 커패시터를 돌려 여기 측의 주파수를 변경합니다. 기기 콘솔과 메인 자석을 설정하려면 분광계를 켜고 가로축이 시간인 과도 데이터(transient data)를 기록하는 실험을 선택하십시오.pH 또는 산화환원 상태에 민감한 라디칼을 관찰할 때와 동일한 실험 조건 하에서 표준 니트로사이드 라디칼 샘플의 출력 포화 곡선을 측정합니다. 시스템 설정이 완료되면, 이미징 실험을 위해 경사 자기장을 수동으로 또는 컴퓨터 프로그램을 통해 인가합니다. EPR 신호 강도는 스핀이 한 에너지 수준에서 다음 수준으로 전이되게 하는 공진기의 마이크로파 장에 정비례합니다.이 마이크로파 장의 명칭은 B1입니다. B1은 마이크로파 출력의 제곱근에 비례합니다. 마이크로파 출력이 4배가 되면 B1은 2배가 됩니다. 이 그림에서는 출력이 8mW에서 32mW로 4배 증가함에 따라, B1이 18mG에서 36mG로 2배 증가하였습니다.상대적 진폭을 마이크로파 전력의 제곱근 또는 공진기 효율을 알고 있는 경우 B1의 함수로 도식화하여 전력 포화 곡선을 작성할 수 있습니다. 이 곡선에서 선형을 이루는 영역은 EPR 신호가 포화되거나 왜곡되지 않는 전력 범위를 나타냅니다. 급속 스캔 실험의 장점 중 하나는 검은색 점으로 표시된 일반 CW 실험에 비해 유색 점으로 표시된 선형 전력 범위가 확장된다는 점입니다. 여기에는 5 µM 농도로 3 mm 간격으로 배치된 BMPO-OH 부가물로 구성된 팬텀의 2차원 스펙트럼 공간 이미지가 나와 있습니다.이미지의 단면은 250 megahertz에서의 스펙트럼 형태를 보여줍니다. 이 이미지는 1.5 millimeter 두께의 벽이 두 개의 시료 챔버를 분리하고 있는 팬텀 내에서 일산화질소를 포집하는 데 사용될 수 있는 N-14 nitranyl 라디칼을 보여줍니다. 250 megahertz에서의 스펙트럼 형태가 여기에 표시되어 있습니다.pH 민감성 triarylmethyl 라디칼의 2차원 이미지는 인산염 완충액의 pH가 7.0일 때와 7.4일 때의 스펙트럼 특성 차이를 반영합니다. 이 이미지는 10 mm 스페이서가 있는 2구획 팬텀 내의 N-15 dinitroxide를 보여줍니다. 초기에는 두 구획 모두 0.5 mM의 프로브를 포함하고 있습니다.디니트로사이드(dinitroxide)에 글루타티온(glutathione)을 첨가하면 환원된 링커 부위가 끊어져 두 개의 모노니트로사이드(mononitroxide)가 생성되며, 이러한 변화는 2차원 이미지에 반영됩니다. 신속 스캔 EPR의 개발은 홀전자를 가진 분자를 연구하는 능력에 있어 완전한 패러다임의 전환을 가져왔습니다. 오늘 여러분은 이를 in vivo EPR에 적용하는 사례를 확인했지만, 이는 금속 함유 화합물의 저온 연구 및 다른 다양한 시스템 연구에도 훌륭한 가능성을 제공합니다.지금까지 연구한 모든 샘플에서 신호 대 잡음비가 최소 한 자릿수(order of magnitude) 이상, 때로는 그보다 더 크게 개선되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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빠른 스캔 전자 스핀 공명 이미징 생리 학적으로 중요 매개 변수에 대한 새로운 길을 엽니 다

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