Name: IL-1β의 발기인 기반을 DsRed 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 학습하세요 생체 내 호중구 초벌 과정을 DsRed 기자 마우스를 사용하여 실시간 영상화하는 방법을. 형광 리포터와 생체 내 라벨링 기술을 결합하여 면역 반응을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.

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모든 동물 실험은 건강 지침의 국립 연구소에 따라 수행 톨레도 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인됩니다. pIL1-을 DsRed 마우스 1. 표현형 참고 : 자손은 야생형 (WT) C57BL6 마우스를 이형 pIL1-을 DsRed 마우스 번식에 의해 생성됩니다. 세 주 네 오래된 새끼는 표현형에 대한 준비가 간주됩니다. 마우스의 턱밑 출혈은 약간의 수정 (23) 설립 프로토콜을 따른다. <ol><li> 마우스 새끼 전혈에서 백혈구의 분리 <ol><li> 각 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 헤파린의 20 μl를 추가합니다. </li><li> 케이지에서 한 강아지를 획득. 강아지의 식별 태그를 기록합니다. 턱밑 정맥에서 채혈 전에 새끼를 마취 할 필요가 없습니다. </li><li> 목의 목덜미에 의해 강아지를 잡고 일에 턱밑 정맥을 관통5 밀리미터 란셋을 사용하여 전자 뺨 파우치. 혈액 방울 침투의 관점에서 스며 있도록 작은 구멍을 만들 충분한 힘을 적용합니다. 각각의 강아지에 대한 새 바늘을 사용합니다. </li><li> 헤파린 함유 microcentrifuge 관에서 강아지 당 혈액의 5 방울 - 3를 수집합니다. 펑크 사이트를 청소하고 지혈을 용이하게하기 위해 압력을 적용합니다. </li><li> 새 케이지에서 강아지를 넣고 동물 시설에 케이지를 반환하기 전에 30 분 동안 관찰한다. </li><li> 긍정적이고 부정적인 컨트롤로 알려진 표현형의 성인 쥐에서 혈액을 수집합니다. </li><li> 각 튜브, 소용돌이 튜브에 붉은 혈액 세포 용균 버퍼의 500 μl를 추가, 5 부화 - 얼음에 10 분. </li><li> 각 튜브에 세포 현탁액을 아래에 소 태아 혈청 (FBS) 500 μL - 천천히 400을 추가한다. 명확한 계면은 상층의 세포 현탁액 및 FBS의 하층 사이에서 관찰 될 수있다. </li><li> 캡 튜브와 원심 분리기 샘플을 5 분 동안 1,500 × g에서. </li><li> 모피에 1.1.9 - 반복 1.1.7 단계THER는 적혈구를 제거합니다. 용해 처음 충분한 경우 반복하지 않는다. 펠렛 원심 분리 후 식별하기 어려울 수 있습니다. </li></ol></li><li> 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 자극과 문화 <ol><li> 전체 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640 배지 200 μl의의를 Resuspend 세포. </li><li> 튜브 유세포에 세포 현탁액을 전송. </li><li> 완전 RPMI 1640 배지 990 μL와 LPS 스톡 용액 10 μL (1 ㎎ / ㎖)을 혼합하여 용액을 작동 LPS를 만든다. </li><li> 세포 현탁액 200 μL에 솔루션을 작업 10 μg의 / ml의 LPS의 20 μl를 추가합니다. </li><li> 캡 튜브는 느슨하게 5 % CO 2와 37 ° C에서 4 시간 동안 샘플을 품어. </li></ol></li><li> 유동 세포 계측법 분석 <ol><li> 유동 세포 계측법에 대한 데이터 취득 프로그램을 연다. 인수를 샘플링하기 전에 인수 템플릿을 설정합니다. </li><li> 도구 팔레트에서 도트 플롯 도구를 클릭합니다. FO 그리기사이드 분산 형 (SSC) 플롯 대 rward 산란 (FSC). 리니어 스케일에 FSC와 SSC 전압 매개 변수를 설정합니다. </li><li> 세포 계수기에 의해 허용 FSC와 SSC의 가장 낮은 임계 값을 선택합니다. 각각, FSC와 SSC에 대한 임계 값 200과 50을 적용합니다. </li><li> SSC 플롯을 대 FSC 내 파편 적혈구와 림프구, 단핵구, 과립구 및 수지상 세포를 포함하고, 배제 게이트 G1을 그린다. </li><li> 도구 팔레트에서 히스토그램 도구를 클릭합니다. FL2 (적색 형광 채널) 히스토그램을 그립니다. 모든 양을 DsRed 이벤트를 포함하는 게이트를 그릴 FL2 신호의 기준과 양성 대조군 샘플을 설정하는 대조군 샘플을 사용한다. </li><li> 사이토의 유체 제어 패널에서 유체 모드 &quot;RUN&quot;과 유량에 &quot;HI&quot;(약 60 μL / 분)을 설정합니다. 각 샘플 10,000 이벤트를 취득. </li><li> G1은 게이트에서을 DsRed 양성 세포의 비율을 측정하여 강아지의 표현형을 결정합니다. </li></ol></li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. pIL1-을 DsRed 마우스에서 피부 염증의 유도 <ol><li> 100 밀리그램 / kg 케타민, 10 밀리그램 / kg 자일 라진 및 1 ㎎ / ㎏ 아세 프로 마진을 포함하는 마취 칵테일을 복강 내 (IP) 주사하여 마우스를 마취. 적절하게 마취 마우스는 발가락 핀치에 뒷 발 철수를 표시하지 않습니다. </li><li> 마우스의 양쪽 귀에의 지느러미 표면에 헤어 제거 크림을 적용합니다. 1 분 30 초를 기다립니다. 물에 적신 솜으로 귀 표면을 닦고 자연 건조를 할 수 있습니다. </li><li> 마이크로 미터를 사용하여 귀 두께를 측정하고 별도의 새장에 마우스를 교체합니다. (- 30 분 ~ 15) 마취에서 회복 될 때까지 관찰한다. 제모 제품에 의한 피부 염증을 해결하기 위해 상기 실험을 수행하기 전에 마우스를 3 일 동안 휴식을 허용한다. </li><li> 1 ml의 아세톤에 OX 16.7 mg의 용해와 올리브 오일의 250 μL와 OX / 아세톤 용액 750 μl를 혼합하여 1.25 % (w / v)의 OX를 준비합니다. 250과 아세톤 750 μl를 혼합하여 차량의 솔루션을 준비합니다# 181; 올리브 오일의 리터. </li><li> 마취 칵테일 (2.1)의 IP 주사로 마우스를 다시하는 것은-마취. 이전과 귀 두께를 측정한다. </li><li> 오른쪽 귀 양쪽에 1.25 %의 OX의 12.5 μl를 적용합니다. 왼쪽 귀 양쪽에 아세톤 / 올리브 오일 차량 액의 12.5 μl를 적용합니다. </li><li> 완벽하게 한 다음, 다른 마우스에 의해 귀에 모욕을 방지 원래의 새장에 마우스를 교체하고 동물의 주거 시설로 돌아 회복 될 때까지 마우스 케이지 동료로부터 분리하십시오. 참고 : 머리 제거 귀 두께의 변화에​​ 의해 다음과 같은 작은 피부 염증의 원인이 될 수 있습니다. 이 작은 염증 3 일 후 해결 정상적인 귀 두께에 의해 확인됩니다. 24 시간 동안 국소 도포 한 후, OX 처리 귀는 유의 한 (P &lt;0.01)에 비해 차량의 솔루션을 단독으로 처리 귀 부종을 보여줍니다. </li></ol> pIL1-을 DsRed 마우스에서 호중구의 3 라벨링 참고 : 저용량 F에 의한 호중구의 생체 표지에luorescence-결합 호중구 특정 단클론 항체는 최근에 개발 된 프로토콜 19을 따른다. 레트로 궤도 주사는 약간의 수정 (24)와 함께 설립 프로토콜에 따라 수행된다. <ol><li> 인산염 완충 식염수 (PBS)의 90 μl를 0.5 ㎎ / ㎖ 알렉사 플 루어 647 - 복합 안티 Ly6G 단클론 항체 (클론 1A8)의 10 μl를 희석 방지 Ly6G 단클론 항체 작업 솔루션을 준비합니다. </li><li> 28 게이지 바늘과 U-100 인슐린 주사기에 방지 Ly6G 단클론 항체 작업 솔루션 (50 μg의 / ㎖) 100 ㎕를 전송합니다. </li><li> 이전에 기술 된 마취 칵테일 (2.1)의 IP를 주입하여 성인 pIL1-을 DsRed 마우스를 마취. 깨끗한 작업 보드의 마취 마우스 복부를 내려 놓습니다. </li><li> 부분적으로 소켓에서 안구 돌출 한 마우스의 눈에 부드러운 아래 피부 지느러미에 압력과 복부를 적용합니다. </li><li> 조심스럽게 복고풍 궤도에 내측 눈구석에서 약 30 °의 각도로, 아래로 베벨, 바늘을 배치공동. 참고 : 운영자가 동에 바늘을 삽입 한 번 압력, 침투 및 안심 저항을 느낄 수 있습니다. </li><li> 천천히 부드럽게 마우스로 용액 (5 μg의 단클론 항체 / 마우스 / 분사)를 작동 방지 Ly6G 단클론 항체의 100 μl를 주입. 빨리 바늘을 제거합니다. 출혈 소량 성공적인 주입 나왔다. </li><li> 바로 오른쪽 마우스 왼쪽 귀에 1.25 %의 OX 차량 솔루션을 적용 할 수 있습니다. </li><li> 8 시간 후, 동일한 마우스로 역 궤도 사출을 통해 새롭게 제조 방지 Ly6G 단클론 항체 작업 용액 (5 μg의 단클론 항체 / 마우스 / 분사) 100 μl를 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 즉시 이미징 전에 혈관을 시각화 30 ㎎ / ㎖ 플​​루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트 (FITC)의 100 μl를 관리하려면 복고풍 궤도 주입을 통해 덱스 트란 (150 kDa의)를 π 공역 계. </li></ol> PIL-1을 DsRed 마우스에서 호중구 초벌 4. 생체 내에 영상 <ol><li> 마취 칵테일 (2.1)의 IP를 주입으로 마우스를 마취.0; 동안 이미징을위한 마취하에 건조를 방지하기 위해 마우스 눈 수의학 연고를 적용합니다. <ol><li> PBS 동량 원래 마취 칵테일 500 ㎕의 희석하여 1 ml의 절반 - 용량 마취 칵테일을 준비한다. </li><li> 나비 27 게이지 바늘로 1 ML의 주사기에 절반 용량 마취 칵테일을 전송합니다. </li><li> 복강 마우스 복부에 나비 바늘을 삽입하고 테이핑에 의해 복부에 나비 날개를 고정합니다. </li></ol></li><li> 촬상 스테이지의 중심에 유리 커버 슬립을 놓는다. 제자리에 고정하는 커버 슬립의 가장자리를 테이프입니다. </li><li> 마우스 귀 복부 표면뿐만 아니라, 커버 슬립을 PBS 방울을 놓는다. </li><li> 위치는 커버 슬립을 통해 자사의 귀 마우스를 마취. 또한 테이프를 통해 장소에서 개최 된 커버 슬립과 유리 슬라이드 사이의 귀를 사이에 의해 아래로 귀 끝, 등쪽를 탑재합니다. </li><li> 멀티 레이저 형광 공 초점 현미경과 관련된 모든 전자 켭니다quipment. 주변 광에 노출을 최소화하기 위해 실내 조명을 끄십시오. </li><li> 이미지 수집 소프트웨어를 엽니 다. 염료 목록 메뉴에서 형광 염료의 검출을위한 레이저 채널을 선택합니다. </li><li> 접안 렌즈를 통해을 DsRed + 세포에서 혈관과 빨간 신호에서 녹색 신호를 관찰하여 염증이 귀 피부에 초점을 조정합니다. </li><li> 스캔 2 μS / 픽셀의 속도와 512 × 512 픽셀의 해상도와 빠른 검사를 수행합니다. 라이브 뷰 메뉴의 각 채널에 대한 사색을 선택합니다. 끝을 설정하고 검사의 위치를​​ 시작하는 데 초점 노브를 조정합니다. </li><li> 8 마이크로 초 / 픽셀 800 × 800 또는 1024 × 1024 픽셀의 해상도 - 스캔 (4)의 속도로 천천히 스캔을 수행합니다. 높은 전압 이득을 조정하고, 채도 (적색 화소)를 피하면서 신호의 세기를 최대화하기 위해 각 채널 오프셋. 각 채널에서 몇 빨간색 픽셀이 있어야합니다. </li><li> 제를 주사하여 입체 화상 세트를 만들전자 귀 피부, 635 μm의 × 635 μm의 × 30 μm의 (20X 목적), 또는 1270 μm의 ×를 각질층에서 표면적으로 시작하여 X, Y, 317 μm의 × 30 μm의 (40X 목표) × 317 μm의의 Z 볼륨으로 하향 진행 2 μm의 Z-단계에서 1270 μm의 × 50 μm의 (10X 목적). 주 : 각질층은 표피의 최 외층이고 용이 강한 자기 형광 신호에 기초하여 국부적 수있다. </li><li> 저속 촬상 실험에서, 레코드 3 차원 영상까지 8 시간마다 2 ~ 4 분. </li><li> 나비 바늘을 통해 절반 용량 마취 칵테일의 10 μL - 마우스가 마취에서 회복하기 시작 일시적으로, 경련 수염의 관찰에 기초하여 기록, 5를 관리 할 수​​ 있습니다. 참고 : 마취 량의주의하십시오 - 과다 복용 마우스 사망의 원인이 될 수 있습니다. 대안 적으로, 용기에 흡입 마취제 단기 마취 A의 마우스에도 적용 할 수있다노즈콘 장기 촬상에 사용될 수있다. </li><li> 이미징이 완료되면 무대에서 마취 마우스를 제거합니다. 테이프를 분리하고 마우스의 복부에서 나비 바늘을 제거합니다. 동물의 주거 시설에서 별도의 케이지에 마우스를 돌려줍니다. 참고 : - 3 시간 단기 영상 (&lt;1 시간)의 경우, 마우스는 완전히 1에 신속하게 마취에서 회복. 16 시간 - 장기 영상 (~ 8의 시간)의 경우, 마우스 (12)의 통상의 회복 기간을 서서히 회복. 따라서, 경구 투여 물은 심각한 탈수를 방지하기 위해 회복 기간 중 적어도 몇 회에서 추천된다. </li><li> 처리 영상 데이터 세트는 개별 셀을 추적 이동성 경로를 생성하고, 화상 해석 소프트웨어 (25)를 사용하여 세포 이동의 방향성 및 속도를 계산한다. </li></ol>

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저자는 재정적 이해 상충이 없습니다.

본 연구의 목적은 아직 현재의 기술에 의해 실현되지 않은 살아있는 동물의 호중구 프라이밍의 과정을 모니터링하는 기술을 개발하는 것이다. 이 목표를 달성하기 위해 세 가지 설정 방법이 수행됩니다 : 피부 염증의 1) 유도 IL-1β 프로모터 기반을 DsRed 기자 마우스에서 프라이밍의 측정, 형광 접합 된 항 Ly6G의 낮은 복용량으로 호중구의 2) 생체 표지로 단클론 항체, 3) 생체 내에 공 촛점 현미경 이미지. 이 세 가지 방법의 조합은 염증성 피부 병변에서 준비하는 호중구 (을 DsRed + / Ly6G +)의 운동성 활동의 시각화를 가능하게한다. 프라이머 작업 호중구의 이동 방향과 속도는 더 철새 경로 추적을 통해 정량화된다. 시간 경과 비디오 시리즈를 기록함으로써, 프라이밍 호중구 출현 실시간 동역학 I에 의해 염증성 사이트을 DsRed 발현 습득 모니터링ndividual 호중구는 혈관 외 공간에서 관찰된다. 따라서, 호중구 프라이밍의 동적 과정이 성공적으로 여기...

호중구는 순환에서 가장 풍부하고 단명 한 백혈구 수 있습니다. 그들은 신속하게 그들이 항균 펩타이드 및 단백질 분해 효소 1을 포함하는 과립과 함께 활성 산소와 질소 중간체의 출시를 통해 같은 전문 식세포를 제공 감염이나 부상의 사이트에 채용된다. 그들의 채용 동안 호중구 염증 (2)의 위치에 도착하면 현저하게 향상 식세포 기능의 결과로, 미생물 제품, 화학 유인 물질 및 염증성 사이토킨을 포함하는 다양한 에이전트 &quot;프라이밍&quot;된다. 호중구 프라이밍 메커니즘은 광범위하게 연구 시험 관내 3,4-되었다; 그러나, 생체 내에서 처리를 동적으로 모니터링은 현재까지 불가능 하였다. 최근 생체 내에 영상은 시각화 및 생물에 생물학적 과정의 세포 역학을 정량화하기위한 중요한 기술이되고있다. Intravi탈 촬상는 종래의 광자 현미경 여기를 통해 (예를 들어, 공 초점)을 수행하거나 다 광자 현미경 (5)에 접근 할 수있다. 시간이 지남에 상당한 개선이 증가 영상 해상도 개선 촬상 깊이를 가능하게이 기술에서 달성되어, 광 손상 조직, 향상된 이미지 안정화 -6,7- 감소. 시간이 지남에 따라 세포 마이그레이션 및 상호 작용의 동적 시각화를 가능하게하는 독특한 능력을 감안할 때, 생체 내에 현미경 광범위 면역학 8 연구의 다양한 분야에 적용되고있다. 생체 내에 영상은 더 잘 이해하고 동물 모델 생활에서 모두 세포 및 분자 수준에서 면역 반응을 상황화하는 면역 학자 수 있습니다. 최근 유전자 변형의 발전뿐만 아니라 노크에서 기자 마우스 등 살아있는 동물에서 호중구의 동적 행동을 모니터링하기위한 유용한 도구를 제공하고 있습니다. 라이소자임 M 프로모터 기반의 강화 된 녹색 형광 단백질 노크에서생쥐는 크게 넘쳐, 세균 감염 및 염증 멸균 9-15 포함한 다양한 염증 과정 동안 호중구, 단핵구 및 대 식세포의 운동성을 특성화하는데 사용되어왔다. 또한, 세포질 형광 공명 에너지 전달, 바이오 센서를 발현하는 형질 전환 마우스는 염증 부위 내에 16 호중구 세포 미토 겐 - 조절 키나아제 및 단백질 키나아제 A의 활동을 연구에 사용되었다. 호중구의 형광 발현 특이성을 가진 쥐 모델 자체 림프구 항원 6G (Ly6G) (17) 식으로 결합되는 형광 단백질 tdTomato,뿐만 아니라 Cre 호텔 재조합 효소를 생산시 Catchup 녹아웃 마우스이다. 이 모델을 통해 Ly6G 결핍 호중구의 시각화는 이러한 세포에서 멸균 또는 감염성 생체 내 염증 다양한 상황에서 정상적인 기능을 발휘 있음을 보여 주었다. 을 DsRed 형광 페이지를 발현하는 형질 전환 마우스호중구 염증 단핵구 활성화 대 식세포를 포함 할 것으로 - - (IL-1β) 프로모터 (pIL1-을 DsRed)는 IL-1β 생산 세포의 운동성 동작을 시각화하는데 이용 된 interleuikin-1β 마우스의 제어하에 유전자 rotein 신흥 염증이 피부 십팔인치 생체 내에서 라벨은 염증 조직에서 호중구의 세포 및 분자 행동을 추적하는 또 다른 방법이 될 수 있습니다. 안티 GR-1 단일 클론 항체 (단클론 항체) 라벨 형광의 낮은 용량의 정맥 주사, GR-1 + 호중구의 모집 캐스케이드 후 황색 포도상 구균 (19)에 감염된 마우스의 피부 병변에 가시화되고있다. streptavidin-를 포함하는 복합체의 생체 내 투여 결합 705 nm의 양자점과 바이오틴 안티 Ly6G 단클론 항체는 특히 순환 호중구 (20) 레이블을 붙입니다. neutroph에 이러한 접합체 또한, 엔도 시토 시스IL 소체는 간질로 이주 호중구 고속 소낭 수송의 추적을 허용한다. 생체 P- 셀렉틴 대 형광 복합 항체 αM 인테그린 리간드 -1 (PSGL-1), L 셀렉틴 (CD62L)을 당 단백질로 표지 (는 CD11b를 TNFα에 의한 염증 모델)과 케모카인 (CXC 모티브) 수용체 2 (CXCR2)는 초기 염증 21시 놀이 규제 메커니즘을 해명했다. 편광 호중구는 CD11b를하고 CXCR2, 호중구의 이동을 유도하고 염증을 시작 수용체의 재분배 결과, 활성화 된 혈소판에서 CD62L 존재와 상호 작용하는 uropods을 PSGL-1이 풍부한 돌출. IL-1β는 준비하는 호중구 (22)에 상승 서명 유전자 중 하나입니다. pIL1-을 DsRed 기자 마우스에서,을 DsRed 형광 신호 (예., IL-1β의 프로모터의 활성화) 긍정적으로 mRNA 발현과 IL-1β 단백질 생산 IL-1β와 상관 관계. &lt;SUP&gt; 18 호중구 프라이밍의 프로세스를 모니터링하기 위해, 생체 내에 현미경 방법은 형광 접합 된 항 Ly6G 단클론 항체와 호중구의 생체 표지 다음 pIL1-을 DsRed 마우스 모델에서 옥사 졸론 (OX)와 피부 염증의 유도를 포함하는 개발되었다. 이 모델을 통해 다양한 질병과 질환의 동물 모델에서 호중구 뇌관의 동작 및 기능을 연구 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>헤파린 나트륨</td><td>APP 제약</td><td>NDC 63323-540-31</td><td></td></tr><tr><td>ACK 용해 버퍼</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>리포 다당</td>류 <td>시그마 - 알드리치</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>케타민 염산염</td><td>호스피라</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>자일라진</td><td>LLOYD Laboratory</td><td>NADA #139-236</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>ANADA 200-361</td><td></td></tr><tr><td>제모 크림</td><td>Church & 드와이트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A16P4</td><td></td></tr><tr><td>옥사졸론</td><td>시그마-알드리치</td><td>E0753</td><td></td></tr><tr><td>알렉사 플루어 647 안티 마우스 Ly6G 항체</td><td>BioLegend</td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>U-100 인슐린 주사기, 28G 바늘</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran, 150 kDa</td><td>시그마-알드리치</td><td>74817</td><td></td></tr><tr><td>버터플라이 주입 세트(27G 바늘)</td><td>BD</td><td>387312</td><td></td></tr><tr><td>FACS칼리버 세포분석기</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro 소프트웨어</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph 소프트웨어</td><td>범용 이미징</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

il-1β의 발기인 기반을 dsred 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

호중구는 인간의 혈액 순환에서 가장 풍부한 백혈구하고 신속하게 염증 사이트에 채용된다. 초벌은 중성 백혈구의 식세포 기능을 향상시키는 중요한 이벤트입니다. 광범위한 연구는 감염과 부상 중에 존재와 호중구 프라이밍의 중요성을 발표했지만, 사용할 수 있었다 생체 내에서이 과정을 시각화의 의미합니다. 형광 접합 된 항 - 림프구 항원을 주입함으로써 달성 - 2) 생체 호중구 라벨링 프라이밍의 척도로 사용 - 1)을 DsRed 리포터 신호는 제공된 프로토콜은 세 가지 방법을 조합함으로써 살아있는 동물에서 프라이밍 호중구의 동적 프로세스의 모니터링을 가능하게 6G (Ly6G) 단일 클론 항체 (단클론 항체), 3) 생체 내에 공 촛점 이미징. 몇 가지 중요한 단계는이 프로토콜에 관련된 : 옥사 졸론 유발 마우스 귀 피부 염증, 동물의 적절한 진정 작용, 항 Ly6G 단클론 항체의 반복 주사 및 이전을촬영시 초점 드리프트의 ention. 몇 가지 제한이 그러한 한 마우스에서의 연속 촬영 시간 (~ 8 시간)의 한계 및 형광 염료 덱스 트란 염증 상태의 혈관에서의 누설로 관찰되었지만,이 프로토콜의 생체 내에 이미징을위한 기본 틀을 제공한다 쉽게 마우스 염증 모델에서 다른 면역 세포의 검토로 확장 될 수 프라임 호중구 동작 및 기능.

pIL1-을 DsRed 마우스의 선별은 유세포 분석기를 사용하여 말초 혈 백혈구에 의해 생산 된 표현형을 DsRed 형광 신호에 기초하여 수행된다. LPS 자극은 호중구, 단구, 수상 세포 및 26-28을 포함하여 골수 세포에서 IL-1β 생산을 유도하는 것으로 알려져있다. 따라서, 고립 된 백혈구 분석 유동 세포 계측법하기 전에 4 시간 동안 LPS와 함께 배양한다. 다음으로, 게이트는이 게이트 인구 측정 셀 사이즈 (FSC) 내부 복잡성 (SSC) (도 1A) 29을 DsRed 및 신호에 기초하여 골수 세포를 순환 설정된다. pIL1-을 DsRed 마우스에서 같은 세포가 구별을 DsRed 신호 (그림 1B)를 표현하면서 WT 생쥐에서 순환 골수 세포는 최소한으로,을 DsRed을 표현한다. 표현형이 방법에 의해 확인 된 pIL1-을 DsRed 마우스 후속 실험에 사용된...

이 현재 프로토콜은 형광 리포터, 생체 내 라벨링 및 생체 내 이미징 기술을 사용하여 살아있는 동물의 호중구 프라이밍의 동적 과정을 모니터링할 수 있습니다.

IL-1β의 발기인 기반을 DsRed 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 동물의 호중구 프라이밍 과정을 모니터링하는 기술을 제시하는 것입니다. 이 방법은 가장 희귀한 질병 및 장애의 동물 모델에서 호중구를 프라이밍하는 기능 및 행동의 시각화와 같은 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 바이러스 라벨링 및 생체 내 이미징의 형광 리포터를 포함하여 세 가지 확립된 방법론을 결합한다는 것입니다.이형접합 pIL1-DsRed 마우스를 야생형 C57Black 6마리 마우스와 번식시킵니다. 3-4주가 되면 새끼의 표현형을 만듭니다. 각 강아지에 대해 20마이크로리터의 헤파린이 든 1.5ml 튜브를 준비합니다.혈액을 채취하려면 강아지의 목덜미를 잡고 5mm 란셋을 사용하여 뺨 주머니의 턱밑 정맥을 뚫습니다. 작은 펑크만 있으면 됩니다. 튜브당 3-5방울의 혈액을 모으십시오.채취 후에는 반드시 출혈을 멈추고 30분 동안 관찰한 후 동물 시설로 돌려보내야 합니다. 각 샘플 튜브에 500마이크로리터의 적혈구 용해 완충액을 추가합니다. 그런 다음 튜브를 소용돌이치고 얼음 위에서 5-10분 동안 배양합니다.배양 후 각 튜브의 세포 현탁액 아래에 400-500 마이크로 리터의 소 태아 혈청을 천천히 첨가하십시오. 레이어 사이에 명확한 인터페이스가 형성되어야 합니다. 다음으로, 1, 500 Gs에서 5분 동안 샘플을 원심분리하여 세포 펠릿을 수집합니다.상층액을 버리고 200마이크로리터의 완전한 RPMI-1640 배지에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 각 현탁액을 유세포 분석 튜브로 옮기고 각 튜브에 새로 만든 LPS Working Solution 20마이크로리터를 추가합니다. 유세포 분석을 수행하기 전에 4시간 동안 샘플을 배양합니다.먼저 마취제 칵테일의 사내 주사로 마우스를 마취하고 발가락 꼬집음 테스트로 적절한 진정을 확인합니다. 다음으로 양쪽 귀의 등 표면에 제모 크림을 바르고 1분 이내에 닦아내고 물로 피부를 씻습니다. 마이크로미터를 사용하여 응용 프로그램이 만들어진 귀의 두께를 측정합니다.나중에, 마취에서 회복된 쥐를 자체 케이지에 다시 넣고 추가 테스트 전에 쥐를 최소 3일 동안 쉬게 합니다. 3일 후 마우스를 마취하고 귀 두께를 다시 측정하여 자극을 받지 않는지 확인합니다. 그런 다음 오른쪽 귀의 양쪽에 12.5마이크로리터의 1.25%옥사졸론을 바르고 왼쪽 귀의 양쪽에 12.5마이크로리터의 아세톤 올리브 오일 비히클 용액을 바릅니다.항상 그렇듯이 마우스가 마취에서 회복되는 것을 관찰하십시오. 24시간 후, 마취 상태에서 귀의 두께를 다시 측정하여 옥사졸론으로 인한 피부 염증이 발생했는지 확인합니다. 먼저 100 게이지 바늘이 있는 U100 인슐린 주사기에 100마이크로리터의 anti-lyse XG monocolonal 항체를 옮깁니다.다음으로, 앞서 설명한 바와 같이 처리된 마우스를 마취합니다. 마우스의 복부를 아래로 향하게 한 상태에서 피부, 등쪽, 복부에서 눈쪽으로 부드럽게 아래쪽 압력을 가하여 안구가 부분적으로 돌출되도록 합니다. 그런 다음 바늘을 조심스럽게 놓고 내측 안각까지 약 30도 각도로 비스듬히 놓고 바늘을 후방안와동에 조심스럽게 삽입합니다.바늘이 부비동에 들어가면 침투 압력이 완화됩니다. 그런 다음 내용물을 배출하고 바늘을 빠르게 제거하십시오. 소량의 출혈은 성공적인 주사를 의미합니다.지금, 즉각 1.25%oxazolone와 차량 해결책을 이전과 같이 좌우 쥐 귀에 적용하십시오. 8시간 후, 각 마우스에 동일한 항체를 두 번째 투여합니다. 또한 혈관을 시각화하기 위해 100마이크로리터의 fitc dextran을 안와로 후향 투여합니다.이 절차를 위해 먼저 이전과 같이 마우스를 마취하십시오. 그런 다음 이미징 중 건조를 방지하기 위해 눈에 동물용 연고를 바르십시오. 다음으로, 이미징 스테이지 중앙에 유리 커버슬립을 놓고 커버슬립의 가장자리를 테이프로 고정합니다.또한 커버슬립에 PVS 한 방울을 추가합니다. 이제 마우스의 귀를 등쪽이 아래로 향하게 하여 커버슬립 위에 놓습니다. 다음으로, PVS 한 방울로 마우스 귀의 복부 표면을 적십니다.그런 다음 유리 슬라이드로 귀 끝을 위에 장착하고 슬라이드를 테이프로 고정합니다. 이제 다중 레이저 형광 컨포칼 현미경 및 관련 장비를 켭니다. 주변 조명 노출을 최소화하기 위해 실내 조명을 끄십시오.그런 다음 컨포칼 현미경을 사용하여 3차원 이미지를 기록합니다. 타임랩스 이미징 실험의 경우 최대 8시간 동안 2-4분마다 3차원 이미지를 녹화합니다. 그 동안 쥐가 마취에서 회복하기 시작했음을 나타내는 수염이 경련하는 것을 관찰하십시오.이러한 상황에서는 나비 바늘을 통해 5-10마이크로리터의 마취 칵테일 절반 용량을 투여합니다.pIL-1-DsRed 마우스는 유세포 분석을 통해 말초 혈액 백혈구에서 생성된 표현형 DsRed 형광을 스크리닝했습니다. 야생형 마우스의 순환 골수성 세포는 DsRed를 최소한으로 발현하는 반면, pIL1-DsRed 마우스의 동일한 세포는 구별 가능한 DsRed 신호를 발현합니다.IL-1 베타 프로모터 활성화는 호중구 프라이밍의 마커이며 살아있는 pIL-1DsRed 마우스에서 가장 잘 시각화할 수 있습니다. 다음으로, 피부 감작제인 옥사졸론(oxazolone)을 오른쪽 귀에 국소적으로 도포했습니다. 나중에, 호중구는 retro orbital injection을 통해 oxazolone sensitizer의 두 번째 적용 전후에 라벨링되었습니다.마찬가지로, 혈관을 찾기 위해 fitc dextran을 주입했습니다. 많은 이중 표지된 세포가 혈관 외 공간에서 발견되었으며, 이는 프라이밍된 호중구를 나타냅니다. 소수의 세포는 lyse XG 항체에 의해서만 표지되었는데, 이는 아마도 휴지 호중구였을 것입니다.또한, 염증성 단핵구와 활성화된 대식세포를 포함할 수 있는 DsRed 양성 세포의 작은 집단이 관찰되었습니다. 두 호중구 집단을 비교하기 위해 세포 이동 경로를 추적했습니다. 두 호중구 집단 모두 세포외 공간이 진입한 후 무작위 이동을 보였다.흥미롭게도, 추정되는 프라이밍된 호중구는 휴지되어 있는 것으로 추정되는 호중구에 비해 상당히 높은 속도를 나타냈습니다. 개발 후 이 기술은 면역학 분야의 연구자들을 위한 길을 열었습니다. 두 연구에서는 서로 다른 T 세포와 관련된 다양한 염증 상태에서 많은 면역 세포의 행동과 기능을 탐구합니다.이 비디오를 시청한 후에는 살아있는 동물에서 호중구 프라이밍의 동적 과정을 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기, 우리는 마우스 노상 강도의 백혈구가 추적 연구 비침습 두 개의 광자 (2P) 현미경의 접근 방식을 설명합니다. 우리는 조직 이미징 준비의 기술적 측면을 논의하고 실행 및 데이터를 수집하도록 설정 초기의 전형적인 실험을 통해 독자를 걸어보세요.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

이 비디오는 GFP 발현 호중구를 가진 면역 저하 형질전환 마우스의 감염 부위에서 호중구 모집 역학을 연구하기 위한 생체 내 이미징을 보여줍니다. 발광 박테리아를 주입하여 감염을 일으키는 것과 관련이 있습니다. 이는 감염 부위에 호중구가 동원되도록 유도하며, 이미징을 통해 추적이 이루어집니다.

Murine 모델에서 감염 부위의 호중구 모집 역학 및 박테리아 부담 모니터링

이 동영상은 쥐 모델에서 피부 염증을 유발하여 테스트 항원을 평가하는 생체 내 기술을 보여줍니다. 오일/아세톤 용액에 함유된 합텐(hapten)인 테스트 항원을 마우스 귀 피부에 국소적으로 적용하고 적절한 기간 후에 피부의 염증을 평가합니다.

피부 염증을 유발하여 항원에 대한 면역 반응을 평가하는 기법

여기 혈관 염증 및 라이브 쥐 혈전 형성되는 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 형광 intravital 현미경의 실험 기술을보고합니다. 이 현미경 기술은 혈관 질환의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있고 pathophysiological 조건에 따라 pharmacologic 요원을 테스트 할 가치가 있습니다.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

염증 부위에서 이펙터 CD4 T 세포의 삽입 운동을 제어하는​​ 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 우리는 시각화 현장에서 이러한 세포의 동적 거동의 연구를 허용 염증 귀 진피의 시험 관내 -primed CD4 T 세포에서 조작하는 비 침습적 방법을 제시한다.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

여기에 설명 된 방법은 비 침습적 bioluminescence 이미징 (BLI)을 통해 생쥐의 폐에서 IL-8 프로모터 의존 염증 활성화의 시각화 수 있습니다. 동일한 동물을 루시퍼 레이즈 리포터 구조물의 전달 시점으로부터 최대 2 개월 동안 BLI에 여러 번 투여 할 수있다.

IL-8 transiently Transgenized 마우스 모델<em&gt; In Vivo</em&gt; 염증 반응의 장기 모니터링

여기에서, 우리는 마우스 cremaster 근육의 포스트 모세관 정맥에 intravital 현미경 검사법을 수행하는 방법을 보여줍니다. 일반적으로 염증과 패혈증의 다른 모델, 특히 케모카인과 사이토 카인에 의해 유도 된 모델에 적용, 우리는 과장 된 근육 백혈구 침투를 포함하는 muscolopathies의 연구에서 그 관련성을 강조.

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

호중구 이동은 화학 유인 물질 및 세포 외 미세 환경과의 상호 작용에 대한 반응으로 원형질막의 빠르고 지속적인 리모델링에 의존합니다. 본원에서는 마취된 마우스의 귀에 주입된 호중구에서 막 리모델링의 역학을 조사하기 위한 Intravital Subcellular Microscopy에 기초한 절차가 설명됩니다.

생리학적 조건에서 세포하막 리모델링을 조사하기 위해 마우스 피부의 호중구 이동을 이미징합니다.

학습하세요 생체 내 호중구 초벌 과정을 DsRed 기자 마우스를 사용하여 실시간 영상화하는 방법을. 형광 리포터와 생체 내 라벨링 기술을 결합하여 면역 반응을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.

IL-1β의 발기인 기반을 DsRed 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상

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