류마티스 관절염 환자의 관절에서 분리 된 섬유 아세포와 같은 활막을 사용하여 유도 - 만능 줄기 세포의 생성

이 실험의 전반적인 목표는 류마티스 관절염에 염증이 생긴 관절의 활막 조직에서 분리된 섬유아세포와 같은 활막세포로부터 유도만능줄기세포(IPC)를 생성하는 것입니다. 현재 iPSC는 다양한 인간 일차 세포에서 생성될 수 있습니다. 우리는 류마티스 관절의 주요 병리학적 세포인 인간 섬유아세포와 같은 활막세포에서 iPSC를 성공적으로 생성했습니다.

이것은 류마티스 관절염의 병리학을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 정기 간행물은 RA-FLS를 사용하여 IPSC의 퇴화에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 활액 조직을 100mm 접시에 넣고 항생제가 첨가된 PBS 5ml로 조직을 씻는 것으로 시작합니다.

황색을 띤 지방 조직과 뼈 잔여물을 제거합니다. 그런 다음 FBS가 보충된 5ml의 DMEM이 들어 있는 6웰 플레이트의 한 웰로 트리밍된 조직을 옮기고 조각이 일회용 피펫 팁을 관통할 수 있을 만큼 작아질 때까지 가위를 사용하여 조직을 다집니다. 배지를 50ml 원뿔형 튜브로 옮긴 다음 5ml의 새로운 DMEM과 FBS를 웰에 추가하여 남아 있는 조직을 수집하고 전체 웰 내용물을 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 얼음이 해동된 콜라겐 분해 효소를 최종 농도 0.01%로 튜브에 첨가하고 파라필름으로 튜브를 밀봉하여 섭씨 37도의 수조에서 진탕과 함께 배양합니다. 4시간 후, 새로운 DMEM과 FBS를 튜브에 최종 부피 50ml까지 채우고 원심분리를 통해 조직 조각을 수집합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 제거한 다음 다른 원심분리를 위해 40ml의 새 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다.

두 번째 펠릿을 25마일의 신선한 DMEM과 FBS에 다시 현탁시키고 큰 조직 덩어리가 가라앉도록 합니다. 그런 다음 상등액을 새 100mm 접시에 옮기고 활액을 섭씨 37도, 5%CO2에서 14일 동안 배양합니다. 활액막 배양을 확장하기 위해 사용된 배지를 버리고 세포를 5ml의 PBS로 세척합니다.

PBS를 제거하고 세포 배양 인큐베이터에서 2분 동안 1ml의 EDTA로 세포를 해리합니다. 배양이 끝나면 접시를 부드럽게 두드려 남아 있는 부착 세포를 분리하고 생성된 세포 현탁액을 원심분리를 위해 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 30ml의 DMEM 및 FBS에 다시 현탁시키고 세포를 3개의 새로운 100mm 접시로 분할합니다.

3일마다 활액체에 새로운 배지를 공급하고 방금 설명한 것처럼 세포를 80% 포화도에서 3개의 새로운 배양물로 분할합니다. transduction Day zero에서 5%CO2에서 섭씨 37도에서 하룻밤 배양을 위해 신선한 성장 배지의 6웰 플레이트에 웰당 3 x 10에서 4번째 FLS를 확인합니다. 다음날 야마나카 인자 4개가 함유된 렌티 바이러스 1바이알을 섭씨 4도에서 해동하고 FLS 배양 배지를 헥사디메트린 브로마이드와 아스코르브산이 보충된 FLS 성장 배지로 교체합니다.

바이알 내용물이 해동되면 30마이크로리터의 렌티 바이러스를 세포에 넣고 부드럽게 혼합하여 바이러스를 균일하게 분포시킵니다. 감염을 개선하려면 플레이트를 원심분리하고 세포를 인큐베이터로 되돌려 놓고 3일 동안 부티르산나트륨과 아스코르브산을 함유한 새로운 FLS 성장 배지로 매일 배지를 교체합니다. 4일째에는 배지를 부티르산나트륨과 아스코르브산을 함유한 FLS 성장과 iPSC 배지의 혼합물로 교체합니다.

5일차에 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 6ml에 비트로넥틴 60마이크로리터를 첨가하고 6웰 플레이트의 3웰에 각각 2ml의 용액을 실온에서 최소 1시간 동안 코팅합니다. 비트로넥틴이 굳는 동안 형질도입된 세포를 PBS로 세척하고 시연된 바와 같이 EDTA로 분리합니다. 원심분리에 의해 해리된 세포를 수집한 후, 펠릿을 900마이크로리터의 신선한 배지에 다시 현탁시킵니다.

웰에서 과도한 비트로넥틴을 제거하고 300, 150 및 100마이크로리터의 세포를 개별 웰에 추가합니다. 그런 다음 세포를 인큐베이터로 다시 보내고, 콜로니가 나타날 때까지 배지를 매일 새로운 iPSC 배지로 교체합니다. 콜로니를 선택하려면 먼저 비트로넥틴으로 코팅된 48웰 플레이트의 각 웰에 ROCK 억제제가 보충된 500마이크로리터의 iPCS 배지를 추가합니다.

그런 다음 FLS 배양물을 깨끗한 벤치의 해부 현미경 아래에 놓고 10마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 관심 콜로니 주위를 자릅니다. 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 선택한 콜로니를 48웰 플레이트의 1웰로 옮깁니다. 모든 콜로니를 선택했으면 콜로니가 옮길 수 있을 만큼 충분히 커질 때까지 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다.

군체가 현미경의 가시 시야를 벗어날 때 세포를 분할하는 것, 100X 배율에서 볼 수 있습니다. 이 이미지에서는 초기 14일 배양 후 분리된 FLS의 형태를 관찰할 수 있습니다. 이 세포는 일반적으로 섬유아세포의 특성을 나타내는데, 섬유화 마커인 비멘틴(vimentin)과 피브로넥틴(fibronectin)의 발현이 유사할 뿐만 아니라, 대식세포와 같은 활막세포 마커 CD-68.8의 낮은 발현을 보이며, 야마나카 인자 렌티-바이러스 형질도입 후 11일이 지나면 5-10번의 계대에 걸쳐 선별 및 증폭될 수 있는 작은 콜로니가 나타나기 시작합니다.

이러한 류마티스 관절염 iPSC는 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase)를 발현하는데, 이는 이들이 미분화 상태로 남아 있음을 나타냅니다. 이 세포는 또한 RT-PCR 및 면역형광 분석으로 확인된 만능 마커를 발현합니다. 류마티스 관절염 iPCS는 핵형 분석에 의해 결정되는 44+XY의 정상적인 염색체 패턴을 나타냅니다.

또한, SCID 마우스에 주입한 지 12주 후, 류마티스 관절염 iPSC는 다양한 조직 표현형을 나타내는 기형종을 형성했습니다. 면역형광 염색에 의해 확인된 생식층 분화. 마스터링이 완료되면 활막을 사용하여 FLS에서 iPSC를 생성할 수 있습니다.

비디오를 시청한 후에는 활막 조직에서 분리하는 방법과 이를 사용하여 재프로그래밍을 유도하는 방법에 대해 더 잘 이해할 수 있을 것입니다. 이러한 RAF-FLS 유래 iPSC는 류마티스학에서 재생 또는 약물 스크리닝을 연구하는 데 유용할 수 있습니다. 이러한 iPSC가 확립되면 다양한 종류의 표적 세포 또는 장기가 생성될 수 있습니다.

이는 질병을 연구하거나 유전자 편집 등과 같은 다른 미래 응용 분야에 유용 할 수 있습니다.