Name: 류마티스 관절염 환자의 관절에서 분리 된 섬유 아세포와 같은 활막을 사용하여 유도 - 만능 줄기 세포의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 배우세요 류마티스 관절염 환자의 활막 섬유아세포에서 유도만능줄기세포를 생성하는 방법을. 렌티바이러스 시스템을 사용하여 무사육자 세포 배양으로 질병 병리를 연구할 수 있습니다.

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이 연구는 질병관리센터(HI13D2188)가 지원하는 연구 프로그램의 지원을 받았습니다.

윤리 진술 : 본 연구 프로토콜 가톨릭 대학교 (KC12TISI0861)의 기관 검토위원회에 의해 승인되었다. 1. 활막 분리 및 확장 <ol><li> 활막 격리 <ol><li> 외과 위 두 쌍의 집게 한 쌍의 소독. </li><li> 100mm의 접시에 활막 조직 전송와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)로 세척한다. </li><li> 노란 지방 조직과 뼈 잔류 물을 잘라. 둘 베코의 변형 이글의 매체 20 % 태아 소 혈청 (DMEM) (FBS) 5 ㎖를 6 웰 플레이트의 웰에 트리밍 된 조직을 전송하고 추가 할 수 있습니다. </li><li> 조각은 일회용 피펫을 관통 할만큼 작은 때까지 가위로 조직을 잘라. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 조직 함유 미디어를 전송합니다. 6 웰 플레이트에 20 % FBS와 DMEM 5 ㎖를 첨가하여 잔류 물질을 채취 한 후 튜브에 옮긴다. &lt;/ 리&gt; <li> 얼음에 해동 콜라게나. 0.01 %의 최종 농도로 콜라게나 제를 첨가하고 파라 필름으로 튜브를 밀봉. 4 시간 동안 진탕하면서 37 ℃에서 수조에서 인큐베이션. </li><li> 전량을 10 분 동안 300 × g으로 50 mL의 원심 분리, RT가 될 때까지 배양 한 후, 20 % FBS DMEM과 함께 튜브를 채운다. </li><li> 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거하고 펠렛을 재현 탁 미디어의 40ml를 추가합니다. </li><li> 반복 1.1.10-1.1.11 단계를 반복합니다. </li><li> 20 % FBS와 DMEM 25 ml의의 펠렛을 재현 탁하고 아래로 가라 조직의 큰 덩어리를 기다립니다. </li><li> 100 밀리미터 접시에 뜨는을 전송, 14 일 동안 5 % CO 2에서 37 ° C에서 품어. </li></ol></li><li> 활막 유지 보수 및 확장 <ol><li> 플레이트에서 사용 된 미디어를 버리고 PBS 5 ㎖로 세포를 씻어. </li><li> 한 ML PBS / 1 mM의 EDTA를 추가하고 2 분 동안 5 % CO 2에서 37 ° C에서 품어. </li><li> 부드럽게 요리와 transfe을 누릅니다R 15 ML 원뿔 튜브에 세포. 2 분 동안 250 XG에서 RT를 세포를 원심 분리기. </li><li> 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거하고 20 % FBS와 DMEM 30 ml의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 눈에 보이는 남은 재료를 남기지 않고, 3 × 100mm 접시에 세포를 전송합니다. </li><li> 신선한 매체마다 3 일에 미디어를 교체합니다. 한 ML PBS / 1 mM의 EDTA를 사용하여 80 %의 포화 상태에서 세포를 분할합니다. 사용하기 전에 통로 (3)까지 유지한다. 모든 분할 3 접시에 세포의 각 접시를 나눈다. 참고 : 통로 (3)에 도달 한 후, 즉시 사용하지 않을 세포가 얼 수있다. </li></ol></li></ol> 렌티 인코딩 야마나카 인자를 사용하여 2. 재 프로그래밍 FLSS <ol><li> 전달 (D0) <ol><li> 성장 배지에서 6 개의 웰 플레이트의 웰 당 종자 3 × 104 세포 (DMEM 500 ㎖를 10 % FBS와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된). 5 % CO에서 37 ° C에서 세포 O / N을 품어2. </li><li> 4 ° C에서 냉동과 해동의 인 Oct4, Klf4, Sox2이와 C-Myc와 다음 날, 4 야마나카 인자를 포함하는 렌티 바이러스의 한 유리 병을 제거합니다. 주 : 렌티 바이러스는 이전 연구 (11)에 기재된 절차에 의해 제조 하였다. </li><li> 바이러스를 해동하는 동안, 10 μg의 / ㎖ hexadimethrine 브로마이드를 50㎍ / ㎖의 아스코르브 산을 함유하는 (DMEM 20 % FBS 플러스 항생제) FLS 성장 매체 미디어를 변경합니다. </li><li> 미디어를 변경 한 후, 세포에 렌티 바이러스의 30 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다. 감염을 개선하기 위해, 680 × g으로 30 분 동안 35 ℃에서 플레이트를 원심 분리. </li><li> 원심 분리 후, 5 % CO 2에서 37 ℃에서 세포를 배양한다. </li></ol></li><li> 재 프로그래밍까지 유지 보수 볼 수 있습니다 <ol><li> 삼일를 들어, 0.1 mM의 나트륨 부티레이트 50 μg의 / ㎖ 아스코르브 산을 포함하는 FLS 성장 매체와 매일 미디어를 교체합니다. </li><li> 다음날, FLS의 성장 배지의 혼합물로 용지를 교체하고0.1 mM의 나트륨 부티레이트를 50㎍ / ㎖의 아스코르브 산을 포함한다 : (1 비율 1) IPSC 매체. 주 : IPSC 매체의 구성 요소는 재료 / 장비 목록에 주어진다. </li></ol></li><li> 콜로니 형성을위한 분할 세포 <ol><li> 비트로 넥틴 코팅 6 웰 플레이트를 준비합니다. <ol><li> 칼슘과 마그네슘 2+없이 6 ml의 PBS에 60 μL의 비트로 넥틴을 추가합니다. 각 우물에 혼합 2 ㎖를 넣고 적어도 1 시간 동안 RT에서 품어. 참고 : 비트로 넥틴의 작업 농도는 5 μg의 / ㎖이다. </li></ol></li><li> D5에서 PBS로 세포를 씻어. </li><li> 세포를 분리하고 2 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양 1 ml의 PBS / 1 mM의 EDTA를 추가합니다. </li><li> 2 분 동안 250 XG에서 RT를 세포와 원심 분리기를 수확. </li><li> (9 : 3, 1 : 6, 1) 다른 confluencies를 달성하기 위해 3 개의 다른 비율로 세포 분열. 세포 펠렛과에 resuspend 미디어 900 μl를 추가합니다. 6- 웰당 세포 혼합액의 300, 150, 100 μL를 추가각각 9 : 3, 1 : 6, 1 웰 플레이트 (1)의 비율을 달성한다. </li><li> 식민지가 나타날 때까지 IPSC 매체와 매일 미디어를 교체합니다. 식민지는 약 D18 이후에 나타납니다. 주의 :이 단계에서 IPSC 콜로니 않은 재 프로그래밍 FLSS와 공존. </li></ol></li><li> 식민지 따기 <ol><li> 웰에 500 μL의 비트로 넥틴을 첨가하여 48- 웰 비트로 넥틴 코팅 플레이트를 준비하고, 적어도 1 시간 동안 RT에서 배양한다. </li><li> 클린 벤치에 현미경을 놓고 인큐베이터에서 6 웰 플레이트를 제거합니다. </li><li> 48 웰 플레이트에서 비트로 넥틴 솔루션을 제거하고 10 mM이의 Rho 관련, 코일 코일 포함하는 단백질 키나제 (ROCK) 억제제로 보충 500 μl의 IPSC 미디어를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 10P 피펫 팁을 사용하여, 식민지 주위를 잘라. 48 웰 플레이트 잘 하나에 집어 식민지를 전송합니다. </li><li> 몇몇 콜로니를 픽업 한 후, 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 배양한다. </li><li> 식민지가 큰 ENO 때까지 세포를 유지우 전송. 참고 : 식민지 100X 배율에서 볼 현미경의 가시 필드에서 얻을 때 우리는 일반적으로 세포를 유출. </li></ol></li></ol> 3. 면역 형광 염색법 <ol><li> 셀 준비 <ol><li> 12 웰 플레이트에 멸균 18mm 커버 유리를 놓습니다. </li><li> 냉각 덮개 유리를 세척하는 PBS 1 ML을 추가합니다. </li><li> 10 μg의 / ㎖ 비트로 넥틴 액 1ml로 교체하십시오. </li><li> 적어도 1 시간 동안 실온에서 접시를 품어. </li><li> 매일 미디어를 변경, 37 ° C, 5 % CO 2에서 칠일의 비트로 넥틴 코팅 된 12 웰 플레이트와 문화의 비트로 넥틴 솔루션 및 플레이트 iPSCs를 폐기하십시오. </li></ol></li><li> 세포 얼룩 <ol><li> 배양 배지를 버리고 한 번 PBS로 세포를 씻어. </li><li> RT에서 30 분 동안 0.4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 세포를 고정한다. </li><li> RT에서 5 분 동안 0.1 % 트리톤 X-100 세포를 Permeabilize 하시려면. </li><li> permeabilization를 제거PBS는 RT에서 30 분 동안 2 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 용액과 블록. </li><li> . PBS 표 1에 따라 2 % BSA를 함유하는 항체 희석 RT에서 2 시간 동안 일차 항체와 세포를 인큐베이션. </li><li> 이차 항체 (1 : 200으로 희석)를 첨가하고 빛을 피 RT에서 1 시간 동안 세포를 배양한다. </li><li> 1 μL / 10 분 ㎖의 DAPI로 세포를 치료. </li><li> antifade 시약 슬라이드 글라스 위에 커버 글라스를 놓고 광을 피하고 24 시간 동안 RT에서 배양한다. </li><li> 형광 현미경으로 표현을 확인합니다. </li></ol></li></ol> 4. 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) <ol><li> 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 페놀 - 클로로포름 추출 방법 (11)를 사용하여 세포 펠렛에서 mRNA의 압축을 풉니 다. </li><li> 역전사 (11)를 사용하여 총 mRNA의 2 μg의에서의 cDNA를 증폭. </li><li> TEM의 cDNA 2 μl를 사용하여 PCR에 필요한 성분을 혼합플레이트 (11). </li><li> RT-PCR을 수행하고 겔 전기 영동 (11)에 의한 결과를 확인합니다. </li></ol> 5. 알칼리성 포스파타제 (AP) 염색 <ol><li> 37 ° C에서 5~7일에 대한 문화 iPSCs 전에 염색을 5 % CO 2. </li><li> 미디어를 대기음 1 분 동안 4 % PFA로 세포를 고정합니다. </li><li> 정착액을 취소하고 1X 린스 버퍼로 세포를 씻어. </li><li> AP 염색 용 시약을 준비합니다. 다음과 같은 비율로 시약을 혼합 : 빠른 레드 바이올렛 : 나프톨 AS-BI 인산 용액 : 물 = 2 : 1 : 1. </li><li> 광을 피하는 실온에서 15 분 동안 염색 용액으로 세포를 인큐베이션. </li><li> 염색 액을 버리고 린스 버퍼로 세포를 씻어. </li><li> 건조 방지 및 시야 현미경을 사용하여 발현을 확인하기 위해 PBS로 세포를 커버. </li></ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
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<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis.</a> Arthritis Res Ther. 16 (1), R41(2014).</li>
</ol>

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iPSCs의 발견 전에 과학자들은 주로 차별화를 통해 줄기 세포 생물학 및 다른 세포 계통을 연구하기는 ESC를 사용했다. 그러나,는 ESC는 초기 단계의 배아 인 배반포의 내부 매스에서 유래. 는 ESC를 분리하기 위해, 배반포의 파괴를 극복하기 불가능한 윤리적 문제를 제기 불가피하다. 는 ESC가 stemness와 다 능성 특성을 갖고 있지만, 또한, 이들은 개인으로부터 수득 될 수없고, 때로는 맞춤 분석 및 질병 검사를위한 이상적인 도구 아니다. 2007 년, 다카하시 등의 알. 인간 섬유 아세포 2에서 생성 된 iPSCs. 이론적으로는 ESC 달리 iPSCs 모든 성인 체세포에서 생성 될 수있다. 이러한 장점으로, iPSCs은 자동 세포 이식을위한 이상적인 도구가 될 것으로 생각된다. 또한, 후생 메모리의 개념, iPSCs 병원성 조건, 즉, 시뮬레이션을위한 이상적인 셀 재료로 생각되고. 질병 모델링. 혈액 세포, 소...

다 능성 줄기 세포는 다양한 임상과 생물 분야에서 차세대 플랫폼이다. 이들은 질병 모델링, 약물 스크리닝, 회생 의학적 치료에 사용될 수있는 유망한 도구이다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)이 주로 연구 및 다 능성 세포를 이해하기 위해 사용되었다. 그러나, 인간 배반포의 파괴에 의해 분리, hESCs는 여러 윤리적 문제와 연관된다. 2007 년, 박사 신야 야마나카와 그의 팀은 셀 프로그래밍 과정을 역으로 인간 성인의 체세포 1,2에서 줄기 세포를 개발했다. 따라서 hESCs는 달리 유도 - 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)은 윤리적 장애물 회피, 성숙한 체세포에서 생성 될 수있다. 인 Oct4, Sox2이, Klf4 및 c-Myc와 : 일반적으로, iPSCs는 네 개의 외래 유전자의 전달에 의해 생성됩니다. 이러한 야마나카 인자는 원래 렌티 바이러스 및 레트로 바이러스 시스템을 사용하여 제공됩니다. 첫 번째 iPSCs는 마우스 체세포의 C에서 파생 된ELL 학생 3. 그 후, 방법은 인간 피부 섬유 아세포 1,2- 적용 하였다. 후속 연구는 성공적 소변 -4- 피 5,6- 같은 다양한 소스로부터 생성 iPSCs 7 각질 및 기타 여러 세포 유형. 그러나 일부 체세포 프로그래밍에 사용되지 않은 세포 및 질병 상태의 특정 조직에서 다양한 세포 유형의 프로그래밍 기능 검사가 여전히 필요하다. 류마티스 관절염 (RA)는 모든 관절을 공격하고 다른 기관에서자가 면역 조건으로 이어질 수있는 질환이다. RA는 선진국에서 성인의 약 1 %에 영향을 미칩니다. 그것은 오히려 일반적인 질환과 그 발생 빈도는 매년 8 증가한다. 그러나, RA는 초기에는 파악하기 어렵다 파괴 oncebone 손상을 복구 할 수있는 치료가없는 일어난다. 또한, 약효는 환자마다 상이하고, 그 메딕을 예측하기 어렵다필요 오프라인. 따라서, 약물 스크리닝 방법의 개발이 필요하고, RA의 조건을 반영 할 수있는 셀 재료가 필요하다. 섬유 아세포와 같은 활막 (FLSS)는 RA 9,10의 발병에 적극적으로 세포의 참가자입니다. FLSS는 활막이라고 관절낭과 캐비티 사이의 활액 내막 안감에 존재한다. 조인트지지 구조 및 주변 연골에 영양분을 제공함으로써, FLSS는 일반적으로 관절 기능과 유지에 결정적인 역할을한다. 그러나, RA에서 FLSS는 침략 표현형을 가지고있다. RA FLSS 결국 무한 증식 (10)에 의해 주위의 뼈를 파괴, 암과 같은 표현형을 가지고있다. 이 독특한 특성으로 FLSS는 RA의 병리 생물학을 반영 할 수있는 유망한 재료로서 사용될 수있다. 그러나, 이들 세포는 거의 생성되지 않으며, 세포를 시험관 내에서 여러 통로를 통해 진행하면서 세포 표현형 변화 </em은&gt; 조건. 따라서, 환자의 상태를 나타낼 수있는 도구로서 RA FLSS를 사용하여 복잡 할 수있다. 이론적으로, RA 환자에서 파생 된 iPSCs (RA-iPSCs)는 약물 검사 및 추가 연구를위한 이상적인 도구가 될 수 있습니다. 생성 iPSCs 자기 갱신 능력이 유지 및 시험 관내에서 확장 될 수있다. 능성,이 세포는 RA 및 기타 뼈 관련 질환 (11)의 특정 연구 세포 물질 기여 성숙한 연골 세포 및 골 세포 계통으로 분화 될 수있다. 본 연구에서는 분리 및 야마나카 인자를 포함하는 렌티 바이러스를 사용하여 FLSS에서 RA-iPSCs를 생성하는 수술로 제거 활액막 및 방법에서 FLSS을 확장하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>100mm 접시</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50ml 코니컬 튜브</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15ml 코니컬 튜브</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10ml 일회용 피펫</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5ml 일회용 피펫</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>FLS 절연 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수술용 집게</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해</td>효소 <td>Sigma Aldrich</td><td>C6885-100MG</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>Sigma Aldrich</td><td>54956</td><td></td></tr><tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>iPSC Generation Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 솔루션(100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>폴리브레인</td><td>케미콘</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>렌티바이러스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>iPSC 배지 성분 (500 ml)</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>iPSC 배지 성분 (Conc.: 543 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>Sodium Selenite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>iPSC 미디어 성분&nbsp; (농도: 14ng/mL)</td></tr><tr><td>Human Transfferin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>iPSC 매체 성분 (Conc.: 10.7 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>기본 FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>iPSC 미디어 성분&nbsp; (농도: 100ng/ml)</td></tr><tr><td>Human Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>iPSC 배지 성분 (Conc.: 20 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>인간 TGF&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>iPSC 미디어 성분 (Conc.: 2 ng/ml)</td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>iPSC 미디어 성분&nbsp; (Conc.: 64 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>폴리브레네</td><td>케미콘</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>부티르산나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>비트로넥틴</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제</td><td>시그마 알드리치</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td><강력한>내구성 조절 재료</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18mm 커버 유리</td><td>슈페리어</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알디히드(PFA)</td><td>기술 및 혁신</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SSEA4 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2 항체</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-81 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4 항체</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 anti-mouse IgG (H+L) 항체</td><td>Molecular Probe</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) 항체</td><td>Molecular Probe</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probe</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold antifade reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Slide Glass, 코팅</td><td>현일 Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마 알드리치</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>이소프리필알코올</td><td>밀리포어</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA 합성 키트</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA 중합효소</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE 버퍼</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>로딩 스타</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>시그마-알드리치</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) DNA 래더 마커</td><td>효소</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 인산가수분해효소</td><td>Millipore</td><td>SCR004</td><td></td></tr></tbody></table>

류마티스 관절염 환자의 관절에서 분리 된 섬유 아세포와 같은 활막을 사용하여 유도 - 만능 줄기 세포의 생성

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

성숙한 체세포 프로그래밍 요소의 정의 된 집합을 사용하여 다 능성 줄기 세포와 같은 상태로 되돌릴 수있다. 인 Oct4, Sox2이, Klf4 및 C-Myc와 : 많은 연구는 네 야마나카의 전사 인자를 형질 도입에 의해 다양한 체세포 유형의 유도-다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 생성했다. iPSCs 연구는 생물학 및 임상 연구의 최첨단에 남아있다. iPSCs 어떤 개인의 조직으로부터 유도 될 수 있기 때문에, 특히, 환자 별 iPSCs은 질병의 병리 생물학 연구 선구 도구로 사용될 수있다. 류마티스 관절염 (RA)은 관절 연골 및 뼈 구조의 파괴에 의해 분류 된 만성 염증성 질환이다. 활막 증식은 RA의 결과로 이어질 주요 원인이나 증상 중 하나입니다. 섬유 아세포 등 활막 (FLSS)가 증식 성 활막의 주성분 세포이다. 공동의 FLSS는 무제한 결국 인접 cartil 침입, 증식나이와 뼈. 현재, 과형성 활막은 수술에 의해 제거 될 수있다. 제거 된 활막은 관절의 염증 상태를 반영하는 재료로서 RA 연구에 사용된다. RA의 발병 기전에 중요한 플레이어, FLSS 생성하여 RA 환자의 iPSCs를 조사하는 재료로서 사용될 수있다. 본 연구에서는 iPSCs를 생성 RA 환자의 FLSS를 사용했다. 렌티 바이러스 시스템을 사용하여, 우리는 FLSS가 RA 환자 별 IPSC를 생성 할 수 있음을 발견했다. FLSS로부터 생성 iPSCs 더 앞으로 RA의 기전을 연구 도구로서 사용할 수있다.

본 연구에서 우리는 렌티 바이러스 시스템을 사용 FLSS로부터 iPSCs를 생성하는 프로토콜을 기술한다.도 1a는 FLS 분리 프로토콜의 간단한 방식을 나타낸다. 활막 제거 수술 후, 조직은 수술 가위를 사용하여 작은 조각으로 잘게 하였다. 콜라겐 조직의 덩어리로부터 세포를 분리시켰다. 세포를 추가로 처리하기 전에 14 일간 배양 하였다.도 1b는 격리 FLSS의 형태를 나타낸다. 세포를 사용하기 전에 3 통로를 유지했다. FLSS는 일반 섬유 아 세포와 유사한 특성을 공유 할 수 있습니다. 우리의 격리 FLSS은 섬유 성 마커, 멘틴 및 피브로넥틴를 표명했다. 격리 RA FLSS는 또한 대 식세포 같은 활막 마커 CD68 (도 1C)의 낮은 발현을 보였다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within...

여기에서는 피더 세포없이 렌티 바이러스 시스템을 이용하여, 환자 유래의 섬유 아세포와 같은 활막에서 인간 - 유도 된 다 능성 줄기 세포를 생성하기위한 프로토콜을 기술한다.

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

이 실험의 전반적인 목표는 류마티스 관절염으로 염증이 생긴 관절의 활막 조직에서 분리한 섬유아세포 유사 활막세포로부터 유도만능줄기세포(iPSC)를 생성하는 것입니다. 현재 iPSC는 다양한 인간 일차 세포로부터 생성될 수 있습니다. 본 연구에서는 류마티스 관절의 핵심 병리 세포인 인간 섬유아세포 유사 활막세포로부터 iPSC를 성공적으로 생성하였습니다.이는 류마티스 관절염의 병리학적 연구에 도움이 될 수 있습니다. 본 정기간행물은 RA-FLS를 이용하여 iPSC의 퇴화에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 먼저 100 millimeter 접시에 활막 조직을 넣고 항생제가 첨가된 5 milliliters의 PBS로 조직을 세척하는 것으로 시작하십시오.황색 지방 조직과 뼈 잔해를 제거합니다. 그다음, FBS가 첨가된 DMEM 5 milliliters가 담긴 6-웰 플레이트의 한 웰에 다듬은 조직을 옮기고, 가위로 조직을 잘게 다져 일회용 피펫 팁에 들어갈 수 있을 정도의 크기로 만듭니다. 배지를 50 milliliter 원심 분리관으로 옮긴 후, 웰에 FBS가 첨가된 신선한 DMEM 5 milliliters를 추가하여 남은 조직을 모두 수집하고, 웰의 전체 내용물을 원심 분리관으로 옮깁니다.다음으로, 얼음에서 해동한 collagenase를 최종 농도가 0.01%가 되도록 튜브에 넣고 파라필름으로 밀봉한 후, 37 °C 항온수조에서 흔들어주며 배양합니다. 4시간 후, 신선한 DMEM 및 FBS를 추가하여 최종 부피가 50 mL가 되도록 채우고 원심분리를 통해 조직 파편을 수집합니다. 펠렛이 손상되지 않도록 상층액을 제거한 다음, 세포를 40 mL의 신선한 배지에 재현탁하여 다시 한번 원심분리합니다.두 번째 펠릿을 FBS가 첨가된 신선한 DMEM 25 miilliters에 다시 현탁하고 조직의 큰 덩어리들이 가라앉을 때까지 둡니다. 그런 다음 상층액을 새로운 100 millimeter 디쉬로 옮기고 synoviocytes를 37 degrees Celsius, 5%CO2 조건에서 14일 동안 배양합니다. synoviocyte 배양을 확장하려면 사용한 배지를 제거하고 5 milliliters의 PBS로 세포를 세척합니다.PBS를 제거하고 세포 배양 인큐베이터에서 1 mL의 EDTA를 사용하여 2분 동안 세포를 해리합니다. 배양이 끝나면 디쉬를 가볍게 쳐서 남아 있는 부착 세포들을 떼어내고, 생성된 세포 현탁액을 원심분리를 위해 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 펠렛을 30 mL의 DMEM 및 FBS에 재현탁한 후, 3개의 새로운 100 mm 디쉬에 세포를 나누어 접종합니다.3일마다 활막세포에 신선한 배지를 공급하고, 앞서 시연한 바와 같이 세포 합류도가 80%가 되었을 때 3개의 새로운 배양 접시로 세포를 분할하십시오. 형질도입 0일 차에, 6-well 플레이트의 각 well에 3 x 10⁴개의 FLS를 신선한 성장 배지와 함께 분주하고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 4가지 Yamanaka 인자가 포함된 Lenti-virus 1바이알을 4 °C에서 해동하고, FLS 배양 배지를 hexadimethrine bromide와 ascorbic acid가 첨가된 FLS 성장 배지로 교체하십시오.바이알 내용물이 해동되면 30 µL의 렌티바이러스를 세포에 첨가하고 부드럽게 섞어 바이러스가 균일하게 분포되도록 합니다. 감염 효율을 높이기 위해 플레이트를 원심 분리하고, 세포를 인큐베이터로 옮긴 후 3일 동안 소듐 부티레이트와 아스코르브산이 포함된 신선한 FLS 성장 배지로 매일 교체해 줍니다. 4일째에는 배지를 소듐 부티레이트와 아스코르브산이 포함된 FLS 성장 배지와 iPSC 배지의 혼합물로 교체합니다.5일 차에 칼슘과 마그네슘이 없는 6 mL의 PBS에 60 µL의 vitronectin을 첨가하고, 6-웰 플레이트의 3개 웰에 해당 용액을 각각 2 mL씩 분주하여 실온에서 최소 1시간 동안 코팅합니다. vitronectin이 코팅되는 동안, 시연된 바와 같이 형질전환된 세포를 PBS로 세척하고 EDTA를 사용하여 분리합니다. 원심분리를 통해 분리된 세포를 수집한 후, 침전물을 900 µL의 신선한 배지에 재현탁합니다.웰에서 과잉의 vitronectin을 제거하고, 각 웰에 300, 150, 100 µL의 세포를 각각 분주합니다. 그 후 세포를 인큐베이터로 옮기고, 콜로니가 나타날 때까지 매일 신선한 iPSC 배지로 교체합니다. 콜로니를 픽킹하기 위해, 먼저 vitronectin이 코팅된 48-well 플레이트의 각 웰에 ROCK inhibitor가 첨가된 iPSC 배지 500 µL를 넣습니다.그 다음, FLS 배양물을 클린 벤치 위의 해부 현미경 아래에 두고, 10 µL 피펫 팁을 사용하여 관심 있는 콜로니 주변을 절단합니다. 200 µL 피펫 팁을 사용하여 선택한 콜로니를 48 웰 플레이트의 1개 웰로 옮깁니다. 모든 콜로니를 선택한 후, 콜로니가 전이에 충분한 크기가 될 때까지 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.100배 확대 시 현미경의 가시 범위 밖으로 콜로니가 확장되었을 때 세포를 분할합니다. 이 이미지에서는 초기 14일 배양 후 분리된 FLS의 형태를 관찰할 수 있습니다. 세포들은 전반적으로 섬유아세포의 특성을 나타내며, 섬유화 마커인 vimentin과 fibronectin의 유사한 발현과 대식세포 유사 활막세포 마커인 CD-68의 낮은 발현을 보입니다. Yamanaka 인자 렌티바이러스 형질전환 후 8~11일이 지나면 작은 콜로니들이 나타나기 시작하며, 이를 선택하여 5~10회 계대 배양하며 증폭할 수 있습니다.이 류마티스 관절염 iPSC들은 알칼라인 포스파타아제를 발현하여 미분화 상태를 유지하고 있음을 나타냅니다. 또한, RT-PCR 및 면역형광 분석을 통해 확인한 결과, 이 세포들은 다능성 마커를 발현합니다. 류마티스 관절염 iPSC들은 핵형 분석 결과 44+XY의 정상적인 염색체 패턴을 보입니다.또한, SCID 마우스에 주입한 12주 후, 류마티스 관절염 iPSC는 다양한 조직 표현형을 나타내는 테라토마를 형성하였습니다. 이는 면역형광 염색을 통해 배엽 분화가 확인되었습니다. 이를 통해 활막의 FLS로부터 iPSC를 생성하는 방법을 습득할 수 있습니다.영상을 시청한 후, 활막 조직에서 세포를 분리하는 방법과 이를 이용해 리프로그래밍을 유도하는 방법에 대해 더 잘 이해하게 될 것입니다. 이러한 RAF-FLS 유래 iPSC는 류마티스 학계의 재생 연구나 약물 스크리닝에 유용하게 활용될 수 있습니다. 일단 이러한 iPSC가 구축되면, 다양한 종류의 표적 세포나 장기를 생성할 수 있습니다.이는 해당 질환 연구나 유전자 편집 등과 같은 향후의 다른 응용 분야에 유용할 수 있습니다.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-using-fibroblast-like

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 inducible의 lentivirus를 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다 표현 Oct4, Sox2, C - Myc와 Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

우리는 인간의 요인 Oct4, Sox2, Nanog, 그리고 Lin28의 lentivirus - 중재 전송을 사용하여 인간의 체세포에서 유도된 pluripotent 줄기 세포의 생성에 대한 프로토콜을 보여줍니다. Pluripotency는 형태학 및 배아 줄기 (ES) 세포 특정 마커의 존재에 의해 확인되었다.

Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

우리는 함께 retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 벡터, 라이브 염색법에 의해 정확하게 다시 프로그램 hiPSC의 신분을 이용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC) Tra-로 인간의 체세포의 효율적인 언어학 재활을위한 프로토콜을 제시 1-81 항체.

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

이 비디오는 마우스의 자가면역 관절염에 대한 세포 기반 치료법을 보여줍니다. 오브알부민 특이적 수용체를 발현하는 iPSC 유래 T 조절 세포에 보조제에서 유화된 메틸화된 소 혈청 알부민(mBSA)을 주입합니다. 쥐 항원제시세포(APC)는 mBSA를 처리하여 T세포에 전달하여 T세포가 활성화되고 무릎 관절의 활액막으로 이동하도록 유도합니다. 후속 주사에는 왼쪽 무릎에 mBSA만 투여하고 오른쪽 무릎에 mBSA와 오브알부민을 조합하여 투여합니다. 왼쪽 무릎에서는 mBSA에 대한 면역 반응이 관절염을 유발하는 반면, 오른쪽 무릎에서는 오브알부민과 상호 작용하는 T 조절 세포가 염증을 완화하여 관절염 증상을 개선합니다.

쥐 모델에서 자가면역 관절염에 대한 세포 기반 치료법

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

여기서는 쥐 모델에서 자가면역 관절염의 면역 요법을 위해 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 기능적 항원(Ag) 특이적 조절 T 세포(Tregs)를 개발하는 방법을 제시합니다.

자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달

선물이 여기 각 somite 파생 (myotome, sclerotome, dermatome, 및 syndetome)에 인간 유도 만능 줄기 세포의 분화에 대 한 프로토콜 정의 화학적 조건에서 미래의 질병 모델링에 응용 프로그램에는 고 정형 외과에서 세포 기반 요법입니다.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

본 연구는 쥐의 염증성 관절염 조직으로부터 활막 대식세포 및 섬유아세포를 분리하기 위한 수정된 프로토콜을 제공한다.

쥐 관절염 조직에서 Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts의 분리 및 배양

이 논문에서는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 공막의 과발현과 2D 바이오리액터를 통한 단축 스트레칭이 결합된 iPSC 유래 중간엽 기질 세포를 생성하여 iTenocyte를 생성하는 절차에 대해 설명합니다.

Generation of induced pluripotent stem cell-derived iTenocytes via combined scleraxis overexpression and 2D Uniaxial tension(공막 과발현 및 2D 단축 장력 결합을 통한 유도만능줄기세포 유래 iTenocytes 생성)

우리는 활막의 급성 염증, 감염, 구조적 변화를 평가할 수 있는 인간 체외 트랜스웰 시스템을 개발했습니다.

기능과 구조가 보존된 체 외 인간 낙액 조직을 이용한 전임상 접속 모델

배우세요 류마티스 관절염 환자의 활막 섬유아세포에서 유도만능줄기세포를 생성하는 방법을. 렌티바이러스 시스템을 사용하여 무사육자 세포 배양으로 질병 병리를 연구할 수 있습니다.

류마티스 관절염 환자의 관절에서 분리 된 섬유 아세포와 같은 활막을 사용하여 유도 - 만능 줄기 세포의 생성

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