Name: 전략적 내피 세포 관 형성의 분석 : 감소 세포 외 매트릭스 세포 외 기질과 성장 인자를 비교 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 배우세요 내피 세포 관 형성 분석법으로 혈관신생을 정량화하는 방법입니다. HUVEC를 이용하여 세포 외 기질과 CXCR2 억제제의 영향을 측정하고 암 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 미시간주 디트로이트에 있는 웨인 주립 대학의 의학 연구 및 교육 기금(Fund for Medical Research and Education)의 자금 지원을 받았습니다.

1. 세포 배양 <ol><li> 시드 3 × 75 센티미터 플라스크에서 완전 배양 배지 (10)의 10 mL의 5 HUVEC 세포. </li><li> 70~80%의 합류로 CO 2 5 %에서 37 ° C에서 세포를 품어. </li></ol> 2. 세관 형성의 분석 <ol><li> 4 ° C에서 얼음에 하룻밤 성장 인자 감소 (GFR) 세포 외 매트릭스 또는 정상 세포 외 기질 중 하나를 해동. 주 : &quot;세포 외 기질 &#39;간결성을 위해 이하, GFR 정상 세포 외 기질 모두를 참조하는 데 사용된다. 이를 제조하는 방법은 동일하다. </li><li> 얼음에 96 웰 배양 플레이트를 유지하고 잘 사전 냉각 팁을 사용하여 당 차게 세포 외 기질의 50 μl를 추가합니다. 만 정상 세포 외 기질을 포함하는 5 우물 세중를 준비합니다. 만 GFR 세포 외 기질을 포함하는 5 우물의 또 다른 세중를 준비합니다. </li><li> 30 분 동안 37 ° C에서 96 웰 플레이트를 인큐베이션. </li><li> HUVEC를 씻어한 번 인산 완충 칼슘, 마그네슘 (PBS)없이 솔루션 및 1 ml의 0.05 % 트립신 EDTA를 추가합니다. 대부분의 세포가 반올림 때까지 세포 분마다 확인, 1-5 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어. 한 번 플라스크를 눌러 셀을 제거. <ol><li> 5 ㎖를 기본 배지 담기 % 소 태아 혈청 (FBS)과 (아무것도하지 않고 즉, 내피 세포 성장 배지 (예 : 첨가제)를 첨가). 피펫으로 플라스크에서 세포를 수집하고 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 5 분 200 XG에서 세포를 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. </li><li> 2 ml의 기초 배지로 재 정지 혈구를 이용하여 세포 수를 계산하고, 2-3 × 105 세포 / ml의 세포 농도를 조절한다. </li></ol></li><li> 기저 매체에 CXCR2 억제제 SB225002 다음의 10 배 농도의 100 μl를 준비 : 11 μM, 5.6 μM, 1.1 μM, 0.56 μM 0 μM (제어). </li><li> 각 5 MICR에 HUVEC 정지 300 μl를 피펫ocentrifuge 튜브. 억제제 농도의 33 μl를 추가 (11 μM, 5.6 μM, 1.1 μM, 0.56 μM 0 μM) 하나의 튜브에 HUVECs를, 그리고 소용돌이를 포함하는 각. </li><li> 피펫 외 매트릭스의 각각의 웰에 세포 현탁액 (1.5 × 104 세포)를 각각 50 μL. 세중 각 서스펜션 플레이트, 37 ° C, 5 % CO 2에서 4-16 시간 동안 배양한다. </li><li> 4-16 시간 후, 잘 거꾸로 현미경 카메라 (11) (원래 배율 × 100)를 사용하여 당 형성된 튜브 (4) 사진을 찍을. </li></ol> 3. 세관 혼란의 분석 <ol><li> 튜브 형성 분석은 (2.3-2.1 단계)와 동일한 사양에 따라 세포 외 기질과 접시를 준비합니다. </li><li> 단계에 설명 된대로 2.4 관 형성 분석법 및 분취 2.4.2 세포 외 기질을 포함하는 96 웰 플레이트에 웰 당 50 μL로 HUVEC 현탁액을 준비한다. 참고 : 충분한 웰의 플레이트그 O를 약물 치료 당 3 우물이있다. </li><li> 37 ℃에서 4 시간 동안 세포 외 기질에 세포 성장, 5 % CO 2. 약물 치료의 시작 전에 이미지를 가져 가라. </li><li> 관 형성 어 세이의 단계 2.5에 기재된 바와 같이 CXCR2 억제제 SB225002의 2 배 농도를 준비하고 된 HUVEC를 함유하는 96 웰 플레이트의 웰 당 각 농도의 50 μL를 추가한다. 세중의 각 농도 플레이트. </li><li> 37 ° C에서 또 다른 2-12 시간 동안 접시를 품어, 5 % CO 2. 웰 (11) (100 × 원래 배율) 거꾸로 현미경 카메라를 사용하여 각각에 형성된 튜브 (4) 이미지를 가져 가라. </li></ol> 4. 정량 데이터 <ol><li> 현미경 카메라 소프트웨어를 사용하여 네 개의 랜덤 현미경 분야에서 튜브의 전체 길이의 튜브를 측정함으로써, 이미지 캡처 관 형성을 평가한다. </li><li> 현미경 카메라 소프트웨어에서 이미지를 열고 &#39;주석 및 측정을 클릭합니다9 ;. &#39;길이&#39;섹션 아래에있는 &#39;간단한 라인&#39;도구를 선택합니다. 다음 마우스 오른쪽 단추로 클릭 튜브의 길이를 따라 선을 그립니다, 이미지를 클릭. 주 : 소프트웨어가 자동 픽셀 라인의 길이를 계산하고, 파일에 데이터를 입력한다. </li><li> &#39;간단한 라인&#39;도구를 선택하여 이미지의 모든 튜브 라인에 대해이 절차를 반복합니다. 다음 마우스 오른쪽 단추로 클릭 튜브의 길이를 따라 선을 그립니다, 이미지를 클릭. 주 : 소프트웨어가 각 라인의 길이를 기록하고, 화면의 데이터를 표시한다. </li><li> 사진에있는 모든 튜브를 측정 한 후, 다음, &#39;내보내기&#39;를 클릭 &#39;스프레드 시트 길이&#39;를 선택했다. 참고 : 길이 데이터를 스프레드 시트로 내보낼 수 있습니다. </li><li> 전체 길이의 튜브를 얻을 수있는 스프레드 시트 튜브 길이를 모두 추가합니다. 계산 및 튜브의 평균 길이를 기록합니다. 참고 : 네 복제는 평균과 측정 표준 편차를 권장합니다. </li></ol> 세포 외 기질 문화 5. 복구 세포 <ol><li> 문화 및 관 형성 어 세이를 수행하기에 충분한 세포 수를 산출하지 96 웰 플레이트로 큰 규모 (섹션 2 참조). 12 웰 플레이트를 들면, 세포 외 기질의 500 μL 및 HUVEC 세포 현탁액 500 μL (1.5 × 105 세포)를 사용한다. </li><li> 튜브를 형성하기 위해, 4-16 시간 동안 세포를 인큐베이션. 그 후, 세포 배양 배지를 흡인. 칼슘 및 마그네슘이없는 냉간 1X PBS 1 ㎖로 세포를 씻어. </li><li> 문화에 얼음 차가운 PBS-2.5 mM의 EDTA 버퍼의 1 ML을 추가하고 10 분 동안 얼음에 보관하십시오. </li><li> 세척 팁을 절단하여 1000 μL 피펫 팁을 사용하여 접시로부터 세포 외 기질 액을 제거하고 차가운 15 ㎖의 튜브에 전송 웰 4 얼음 ㎖의 차가운 PBS-2.5 mM의 EDTA 튜브에 넣고 . </li><li> 1-4 시간 동안 얼음에 튜브를 넣고 세포 외 모든 때까지 튜브를 몇 번 반전매트릭스를 용해시킨다. </li><li> 0 ° C에서 1,620 XG에 10 분 동안 원심 분리기 </li><li> 얼음에 1.ml 튜브에 1 ㎖의 차가운 PBS로 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 다시 0 ° C에서 3,000 XG에 5 분 후, 상층 액을 처분 원심 분리기. </li><li> -80 ° C에서 세포를 저장합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 분석을 수행 할 때, 달리 명시되지 않는 한 항상 얼음 상 또는 4 ℃에서 세포 외 기질을 유지하는 것이 필수적이다. 세포 외 기질을 4 ° C 이상으로 가온하는 경우는 중합되고, 상기 분석은 파괴 될 것이다. 그것은 접촉하는 것을 확인하는 것이 중요하다 (예를 들면, 피펫 팁, 플레이트) 세포 외 기질과 미리 냉각 전술 한 이유입니다. 각 웰에 파종 세포 수는 중요하다 너무 적은 세포의 대조군 샘플에서 예상되는 웹주지 너무 많은 세포 대 세포 클러스터 또는 단일 층을 형성하는 것이며, 상기 분석은 유효하지 않을 것이다. 이 분석의 성공에 또 다른 중요한 요인이 된 HUVEC 세포의 통로 번호이다. 통로의 수는 항상 그렇지 않으면 강력한 관 형성이 발생하지 않을 수 10 이하이어야한다. 또한, 하나는 사용되는 세포 배양 배지가 만료되지 않았는지 확인한다, 또는 세포 생존 수 없습니다. Alternatively, 하나 매체와 그 구성 요소와 나누어지는 유효 기간 후의 일정 기간 동안 유지하기 위해 -20 ℃에서 저장할 수있다. 물론, 유효 기한 전에 매체를 사용하는 것이 여전히 바람직 모든 절차와 마찬가지로, 내피 세포의 관 형성 어 세이를 수행하는 몇 가지 단점이있다. 하나의 주요 문제는 내피 세포와지지 매트릭스의 종류가 있기 때문에, 분석의 결과는 셀 매트릭스 타입 사용에 따라 크게 달라질 수 있다는 것이다. 사용 된 내피 세포 (HUVECs를, HAECs 또는 HMVECs)는 그들이 불멸화 세포에 비해 변동성을 얻을 가지고 비용이 많이 드는, 일차 전지이다. 기본 셀은 사용 제한 통로를 가지고, 따라서 장기 실험 혈관 (14)에 적합하지 않다. 신뢰성있는 데이터의 경우, 하나는 항상 상기 분석에 대해 동일한 유형을 사용한다. 시험 관내 분석에서 서로 같이, 관 형성 어 세이의 결과들은 콘되어야이차원 조직 배양의 제어 및 합성 조건의 결과는 항상 생체의 복잡한 바이오 시스템에 반영되지 않을 수 있기 때문에, 생체 내에서 강세. 또한, 튜브 형성 세포 분석법이 유형 단지 내피 세포의 관 형성을 입증하는 데 사용될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하고, 다른 비 - 내피 세포를 검사하는 데 사용되어서는 안된다. 이 분석은 화합물의 혈관 가능성을 정량화 할 수있는 비교적 간단하고 빠른 방법입니다. 또한, 단독으로,이 화합물은 실제 혈관 형성 공정에 영향을하는 특정 메커니즘에 관한 정보를 생성하지 못하고, 추가 실험을위한 플랫폼을 형성한다. 그러나, 다양한 세포 외 매트릭스의 사용이 더 일반적으로 사용되지 않는 연구 질문을위한 프레임 워크를 만드는 방법의 예입니다. 구성 요소를 대상으로 특정 억제제를 포함하는 화합물의 특정 생화학 적 메커니즘을 연구하는 방법이있다혈관 신생 경로. 또 다른 방법은 내피 세포로부터 RNA를 추출하고 분석에서 관찰 된 성장 거동을 일으킬 수의 유전자 발현 변화를 분석하기 위해 RT-PCR (실시간 PCR) (12)를 사용할 수있다. 이 방법의 미래 응용 프로그램은 혈관 신생 경로의 특정 단계에 대한 노크 다운 분석을 생성 된 HUVEC를 형질 전환 등이 있습니다. 림프관 경로를 연구하기 위해이 방법을 적용 할 가능성이있다. 세포 외 기질 성분을 변경하여, 행렬 암에서 혈관 신생을지지 세포 과정의 상호 작용이 더 설명 될 수있다. 이러한 특정 조건하에 내피 세포로부터 RNA와 단백질의 추출은 추가적인 정량적 데이터는 데이터를 묘화에 대응 제공한다.

생존에 필요한 영양분을 얻기 위해, 악성 종양 환자의 혈류에 대한 액세스를 필요로한다. 이 액세스하기 위해, 종양 세포는 혈관 신생 따라서이 알려져 정상 생리적 과정을 하이재킹, 종양으로의 새로운 혈관의 성장을 자극하는 화학적 신호를 방출. 그것은 전이 (즉, 다른 장기 암의 확산)이 발생할 수있는 혈관을 통해 생성 된 혈관을 통해도. 혈관 신생 과정은 암과 같은 다양한 종류의 진행에 매우 중요하기 ​​때문에, 항암 치료 연구 (3)에서 매력적인 표적이다. 혈관 생성을 정량화하기 위해 사용되는 하나의 방법은 세포 외 매트릭스 상에 배치 할 때 튜브를 형성하는 혈관 내피 전구 세포의 능력을 측정하는 것이다. 이러한 관의 형성은 환경 조건 (소정 주식의 예 존재 또는 부재를 테스트 혈관 신생에 중요한 초기 단계이기 때문에,mpound) 자극 또는 억제 할 수있는 관 형성은 혈관 신생을 억제하는 대상이 될 수있는 특정 단계에 대한 통찰력을 제공합니다. 내피 세포의 관 형성 분석법은 튜브를 형성하는 세포의 능력을 측정하는 가장 널리 사용되는 4 시험 관내 방법 중 하나이다. 그것은 상대적으로 적은 부품 및 짧은 배양 기간 5를 필요로 간단한 분석이다. 아마도 가장 중요한 것은, 분석이 유형에서 얻은 데이터를 정량화 점이다. 관 형성 어 세이를 사용하는 예를 저감 성장 인자 (GFR) 외 기질 대 외 매트릭스상에서 성장한 혈관 내피 세포의 튜브의 개발을 비교 포함한다. 라미닌, IV 형 콜라겐, 성장 인자 및 프로테오글리칸은 세포 외 기질이 육종 세포의 주요 구성 요소에서 고립 된 기저막과 같은 소재입니다. 일부 화합물의 튜브를 형성하는 세포의 능력에 상이한 효과를 가질감소 된 성장 인자 감소 헤파 란 황산 프로테오글리칸 (HSPGs)와 환경. HSPGs 크게 GFR 외 기질이 감소되는 세포 외 매트릭스의 구성 요소이다. 예로서, 상기 가정은 HSPGs이 풍부한 관 형성을 방해하기 위해 상당히 강한 능력을 차단 CXCR2 수용체, SB225002와 같은 혈관 신생 억제제는 다음 세포 외 기질 및 GFR 외 매트릭스의 관 형성 활성의 비교임을인지 HSPGs의 제어를 통해 혈관 신생 억제 가능성 탐구 중요. 일반적으로 혈관에서의 화합물의 효과를 결정하기 위해 사용되는 다른 분석은 생체 내 방법에있다. 이 중 주목할만한 예는 닭 계란을 사용하여 병아리 융모 막 (CAM) 분석 (6), 그리고 생체 내 마트 리겔은 마우스를 사용하여 혈관 신생 분석 (7)를 연결합니다. 생체 내 방법은 t에서 혈관 신생을 측정하는 동안HREE 치수 및 관내 관 형성 분석법에 비하여 인체에 더욱 대표적인, 그들은 훨씬 더 많은 시간을 필요로한다는 결점을 겪고 상당히 더 수행하기 어렵다. 캠 분석 및 세포 플러그 분석 모두 비하여 관 형성 분석법은 하루에 수행 될 수 있지만, 이렇게하는 적어도 하나의 주 8 가지고 그것은 동물 사용을 요구하지 않는다. 이 보고서에서 사용한 혈관 내피 세포는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 것을 주목하는 것이 중요하다. 이들 세포는 혈관 새싹 및 혈관의 성장에 중요한 역할을하고, 충분한 양의 시험 관내 및 생체 내 실험 9 항 - 혈관 형성 활성을 평가하는데 사용될 암에서 내피 세포 유사하다. 일차 미세 혈관 내피 세포와 같은 다른 세포도 사용될 수있다. 낮은 갖는 외에주의하는 것도 중요하다정상 세포 외 기질에 비해 HSPGs 수준은 또한 GFR 외 매트릭스는 여러 요소 레벨을 감소시켰다. 이 포함되지만 이에 국한되지 않습니다 : EGF, IGF-1, PDGF와 TGF 베타. 혈관 신생 관련 화합물의 중요성을 공부하고 그 수행하는 실험은 GFR 세포 외 기질을 사용하여에 관심이있을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>EGM-2 완전 성장 배지 (EGM-2 bullet kit CC-3162</td>) <td>Fisher</td><td>NC9525043</td><td>HUVEC 완전 성장 배지 : BBE (소 뇌 추출물), hEGF (인간 표피 성장 인자), 하이드로 코르티손, GA-1000 (겐타마이신, 암포 테리신 -B), 2 % FBS (소 태아 혈청), VEGF (혈관 내피 성장 인자), hFGF-&beta와 혼합 된 EGM-2 염기 배지; (인간 섬유아세포 성장 인자 베타), R3-IGF-1(Long R 인슐린 유사 성장 인자 1), 아스코르브산 및 헤파린. 매체와 그 구성 요소를 분취하고 -20&nbsp에서 보관하십시오. &데그; C, 37&nbsp에서 따뜻한; &데그; C 사용하기 전에.</td></tr><tr><td>MATRIGEL MATRIX 10ML 성장 인자 감소 (GFR); 10&nbsp; 밀리리터; LDEV-Free</td><td>Fisher</td><td>CB-40230</td><td>성장 인자 감소 (GFR) 세포 외 매트릭스, -20&nbsp; &데그; C, 4&nbsp에서 따뜻한; &데그; C 사용하기 전에.</td></tr><tr><td>MATRIGEL 매트릭스 10ML; 10&nbsp; 밀리리터; LDEV-Free</td><td>Fisher</td><td>CB-40234</td><td>세포외 매트릭스, -20&nbsp; &데그; C, 4&nbsp에서 따뜻한; &데그; C 사용하기 전에.</td></tr><tr><td>SB225002</td><td>Fisher</td><td>559405</td><td>CXCR2 억제제, -20&nbsp; &데그; C, 사용하기 전에 실온에서 따뜻하게하십시오.</td></tr><tr><td>일차 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)&nbsp;</td><td>사이엔셀 연구소&nbsp;</td><td>8000</td><td>문화 참조에 따라&nbsp; 10.</td></tr> <tr><td>트립신 0.05 % - EDTA 페놀 레드</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>4&nbsp; &데그; C, 37&nbsp에서 따뜻한; &데그; C 사용하기 전에.</td></tr><tr><td>니콘 이클립스 Ti</td><td>니콘</td><td></td><td>도립 연구 현미경.&nbsp;</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 4.20.02 64비트</td><td>Nikon</td><td></td><td>도립 연구 현미경 소프트웨어</td></tr><tr><td>Graph-pad Prism 5</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>IC50를 계산하는 과학적인 2D 그래프 작성 및 통계 소프트웨어.</td></tr></tbody></table>

전략적 내피 세포 관 형성의 분석 : 감소 세포 외 매트릭스 세포 외 기질과 성장 인자를 비교

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

악성 종양은 생존하고 퍼져나가기 위해 혈액 공급이 필요합니다. 이 종양은 기존 혈관에서 새로운 혈관이 형성되는 혈관 신생 과정을 가로채서 환자의 혈류에서 필요한 혈액을 얻습니다. CXCR2(chemokine (C-X-C motif) receptor 2) 수용체는 혈관신생1과 밀접한 관련이 있는 많은 세포에서 발견되는 막관통 G-단백질 결합 분자입니다. CXCR2 수용체의 특이적 차단은 내피관 형성 분석법과 같은 여러 분석법으로 측정된 바와 같이 혈관신생을 억제합니다. 튜브 형성 분석은 주어진 화합물 또는 환경 조건이 혈관 신생에 미칠 수 있는 영향을 연구하는 훌륭한 방법이기 때문에 혈관 신생을 연구하는 데 유용합니다. 간단하고 빠른 체외 분석법으로 정량화 가능한 데이터를 생성하고 상대적으로 적은 수의 구성 요소가 필요합니다. in vivo 분석과 달리 동물이 필요하지 않으며 2일 이내에 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CXCR2 수용체를 테스트하는 내피관 형성 분석을 지원하는 세포외 기질의 변형을 설명합니다.

상당한 건강 내피 관 형성을 용이 현미경 이미지에서 관 형성 억제를 대조 할 수있다. 건강 관 형성은 모세 혈관 같은 구조 (그림 1)의 조직 웹으로 나타납니다. 비교, 억제 관 형성 흩어져 세포 (그림 2) 자체를 명시한다. 관 형성 어 세이 데이터 모세관 (표 1)의 전체 길이의 튜브를 측정함으로써 정량한다. 전체 길이의 튜브 외에, 분기점의 평균 길이의 튜브, 튜브의 전체 개수, 또는 전체 수를 측정 할 수있다. 구조화 된 관 형성을 저해 분산 튜브의 성장보다 더 순 튜브 길이를 산출한다. 도 3에서, 투여 량 반응 곡선은 GFR 외 기질 및 CXCR2의 억제제 SB225002 된 HUVEC의 실험 조건에서 IC (50)의 계산을 허용한다. 세포 외 기질과 성장 인자 감소 (GFR) 세포 외 기질에 그림 1. 내피 t의 우베 형성. 두 이미지는 세포 외 기질 (A) 및 GFR 세포 외 기질 (B)에 성공적으로 관 형성을 보여줍니다. 튜브의 상호 연결된 네트워크는 명확 튜브의 성장이 HUVECs를 건강 있음을 보여줍니다. 스케일 바 = 10 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig2.jpg" /> 에 인자 감소 (GFR)을 CXCR2 억제제 SB225002 (5.6 μM)에 의해 세포 외 기질 세포와 성장. 관 형성의 그림 2. 억제 두 이미지는 튜브를 표시세포 외 매트릭스 (A) 및 GFR 외 매트릭스 (B)의 CXCR2 억제제 SB225002 (5.6 μM)에 의해 억제되어 형성. 이 화상 표시에서 본 HUVEC 세포의 단리는 세포 덩어리 서로 접속할 필요 튜브를 형성 할 수있는 것이 아니었다. 스케일 바 = 10 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig3.jpg" /> 성장 인자 - 감소 (GFR) 세포 외 매트릭스도 3 용량 반응 곡선. X 축은 길이의 튜브를 도시하고, Y 축은 CXCR2의 억제제의 농도를 나타낸다. 용량 반응 곡선은 GFR 외 매트릭스에서 CXCR2 저해제로 HUVEC 응답이 농도 의존적​​ 인 것을 알 수있다. 이 IC (50) (반 최대한 억제Y 농도), 예를 들어, 소프트웨어 (13)를 이용하여 세포 외 기질에 대한 투여 량 반응 곡선과 비교할 수에 의해 산출 하였다. IC (50)은 50 %에 대한 응답을 저하 억제제의 농도이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 성장 인자 감소 (GFR) 세포 외 기질과 저해제 (4 각 복제) </td><td> 총 튜브 길이 평균 (픽셀) (1 픽셀 = 0.34 μm의) </td><td> 표준 편차 </td><td> P 값 </td></tr><tr><td> GFR 외 매트릭스 제어 </td><td> 2,447 </td><td> 168.174 </td><td></td></tr><tr><td> GFR 세포 외 기질 + 0.56 μM의 SB225002 </td><td> 1422.5 </td><td> 185.4218 </td><td> 0.000395 </td></tr><tr><td>GFR 세포 외 기질 + 1.1 μM의 SB225002 </td><td> 1,004 </td><td> 126.1784 </td><td> 2.14 × 10 -5 </td></tr><tr><td> GFR 세포 외 기질 + 5.6 μM의 SB225002 </td><td> 519.25 </td><td> 129.6368 </td><td> 4.19 × 10 -6 </td></tr><tr><td> GFR 세포 외 기질 + 11 μM의 SB225002 </td><td> 393.75 </td><td> 212.6857 </td><td> 1.21 × 10 -5 </td></tr></tbody></table> 표 1. 다양한 조건에서 성장 인자 - 감소 (GFR) 세포 외 매트릭스의 총 길이의 튜브를 정량화. CXCR2 억제제를 다양한 농도로 GFR 외 매트릭스상에서 성장한 샘플에 기록 된 전체 길이의 튜브를 사용하여 테이블의 일부. 데이터는 CXCR2 억제제 관 형성을 억제하는 않는 것을 나타낸다. 이러한 네 가지 복제, 표준 편차의 평균 및 P 값과 관련된 값이 포함되어 있습니다. 보여 픽셀 단위로 측정내 보낸 데이터. IC (50)은 통계 소프트웨어 (13)를 사용하여 계산 될 수있다. (1 픽셀 = 0.34 μm의)

이 원고는 통제된 환경에서 내피 세포관 형성을 사용하여 혈관 신생에 대한 주어진 화합물 또는 조건의 효과를 정량화하기 위한 튜브 형성 분석을 설명합니다.

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

이 실험의 전반적인 목표는 다양한 혈관신생 분자와 관련된 성분을 포함하는 두 개의 서로 다른 세포외 매트릭스를 사용하여 혈관신생 케모카인에 대한 내피 세포관 형성 의존성을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 암 혈관 신생 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다., 예를 들어 왜 혈관 신생이 세포 외 기질의 변형을 사용하여 대체 경로를 통해 지원합니까? 이 기술의 주요 장점은 정량화할 수 있고 더 적은 변수를 사용한다는 것입니다.절차를 시연하는 것은 실험실의 연구원인 Miss Donghong Ju가 맡을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 GFR 세포외 기질 또는 정상 세포외 기질을 섭씨 4도에서 밤새 해동합니다. 96웰 배양 플레이트를 얼음 위에 놓고 사전 냉각된 피펫 팁을 사용하여 웰당 50마이크로리터의 냉각된 세포외 매트릭스를 추가합니다.정상 세포외 기질만 포함하는 5개의 웰을 3회분으로 준비한 다음, GFR 세포외 기질만 포함하는 5개의 웰을 3회분으로 준비합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 30분 후 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS로 HUVEC을 한 번 세척하고 05%의 트립신 EDTA 1ml를 첨가합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 1분에서 5분 동안 세포를 배양하고 대부분의 세포가 둥글게 될 때까지 1분마다 확인합니다. 그런 다음 플라스크를 두드려 세포를 제거합니다. 그런 다음 1% FBS가 포함된 5ml의 Basal 배지를 플라스크에 추가합니다.세포를 15ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 200배 G로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 5분 후, 상등액을 버리고 2ml의 기저 배지로 세포를 다시 현탁시킵니다.혈구계를 사용하여 세포를 세고 세포 농도를 2-3배, 10배, 1밀리리터당 5번째 세포로 조정합니다. 그런 다음 기저 배지에서 5가지 다른 10X 농도의 CXCR2 억제제 100마이크로리터를 준비합니다. 300마이크로리터의 HUVEC 현탁액을 5개의 개별 마이크로 원심분리기 튜브 각각에 피펫팅합니다.그런 다음 각 농도의 10X 억제제 33마이크로리터를 HUVEC이 포함된 튜브에 넣고 와류로 가열합니다. 다음으로, 각 세포 현탁액의 50마이크로리터를 세포외 기질의 개별 웰에 피펫팅합니다. 각 현탁액을 3배로 플레이트에 넣고 섭씨 37도에서 4-16시간 동안 배양합니다.그런 다음 도립 현미경 카메라를 사용하여 우물당 4장의 사진을 찍습니다. 이 절차에서는 튜브 형성 분석과 동일한 사양에 따라 세포외 기질과 플레이트를 준비합니다. 그 후, HUVEC 현탁액을 준비하고 웰당 50마이크로리터의 세포외 기질을 포함하는 96웰 플레이트에 분취합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 4시간 동안 세포외 기질의 세포를 성장시킵니다. 그런 다음 약물 치료를 시작하기 전에 이미지를 촬영합니다. 다음으로, 기저 배지에서 CXCR2 억제제의 5가지 다른 2X 농도를 준비합니다.HUBEC을 포함하는 96개의 웰 각각에 각 농도의 CXCR2 억제제 50마이크로리터를 추가합니다. 그 후, 섭씨 37도에서 2-12시간 동안 플레이트를 더 배양합니다. 그런 다음 도립 현미경 카메라를 사용하여 각 웰의 이미지 4개를 촬영합니다.이미지에 포착된 튜브 형성을 평가하려면 현미경 카메라 소프트웨어를 사용하여 4개의 무작위 현미경 필드에서 총 튜브 길이를 측정합니다. 이렇게 하려면 현미경 카메라 소프트웨어에서 이미지를 열고 Annotations and Measurements를 클릭합니다. Length 섹션에서 simple line tool을 선택합니다.이미지를 클릭한 다음 튜브 길이를 따라 선을 그린 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 계산을 수행합니다. 그런 다음 간단한 선 도구를 선택하여 이미지의 모든 튜브 라인에 대해 절차를 반복합니다. 이미지를 클릭하고 튜브의 길이를 따라 선을 그린 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭합니다.소프트웨어는 각 줄의 길이를 기록하고 화면에 데이터를 표시합니다. 그림의 모든 튜브를 측정한 후 내보내기를 클릭한 다음 Length to Spreadsheet(스프레드시트로 길이)를 선택하여 길이 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다. 스프레드시트에서 모든 튜브 길이를 추가하여 총 튜브 길이를 구합니다.다음으로, 튜브의 평균 길이를 계산하고 기록합니다. 이 절차에서는 12웰 플레이트에서 튜브 형성 분석을 배양하고 수행합니다. 튜브를 형성하기 위해 4-16시간 동안 세포를 배양합니다.그 후, 세포 배양 배지를 흡인하고 칼슘과 마그네슘이 없는 1ml의 차가운 1XPBS로 세포를 헹굽니다. 그런 다음 2.5 millimolar EDTA가 포함된 1ml의 얼음처럼 차가운 PBS 버퍼를 배양액에 추가하고 10분 동안 얼음에 보관합니다. 10분 후, 팁을 잘라낸 상태에서 1, 000마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 접시에서 세포와 세포외 기질 혼합물을 제거합니다.그런 다음 세포를 차가운 15ml 튜브로 옮깁니다. 얼음처럼 차가운 PBS 4ml로 웰을 씻고 같은 튜브에 넣습니다. 그런 다음 튜브를 1-4시간 동안 얼음 위에 놓고 세포외 기질이 용해될 때까지 튜브를 몇 번 뒤집습니다.그런 다음 섭씨 0도에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 얼음 위의 1.5ml 튜브에 1ml의 차가운 PBS로 셀 팔레트를 다시 매달아 놓습니다. 섭씨 0도에서 5분 동안 다시 원심분리하십시오.그런 다음 상층액을 버리고 세포를 섭씨 80도에서 보관하십시오. 이 두 이미지는 정상 세포외 기질과 사구체여과제(GFR) 세포외 기질에서 성공적인 내피관 형성을 보여줍니다. 상호 연결된 튜브 네트워크는 이러한 HUBC에서 튜브의 성장이 건강하다는 것을 분명히 보여줍니다.이 두 이미지는 정상 세포외 기질 및 GFR 세포외 기질에서 5.6마이크로몰에서 CXCR2 억제제인 SB225002에 의한 튜브 형성 억제를 보여줍니다. 이 이미지에서 볼 수 있는 HUVEC의 고립된 덩어리는 세포가 서로 연결하는 데 필요한 튜브를 형성할 수 없었음을 보여줍니다. 이 그래프는 GFR 세포외 기질에 대한 CXCR2 억제제에 대한 HUVEC 반응이 용량에 따라 다르다는 것을 보여줍니다.이 절차에 따라 준비된 세포를 사용하여 QRTPCR 또는 RNA 염기서열분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 평균 튜브 길이, 총 튜브 수 또는 총 분지 지점 수와 같은 데이터는 실험 조건에서 혈관 형성 과정을 특성화하기 위해 이미지를 사용하여 얻을 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

튜브 형성 분석은 종양 세포의 혈관 활동을 평가하는 데 사용됩니다.

종양 세포의 Vasculogenic 활동을 평가 Matrigel 기반 튜브 형성 분석

관 형성 분석법은 시험관 내 혈관 신생을 측정하기위한 신속하고 정량적 방법이다. 내피 세포는 조절 된 미디어와 결합 기저막 추출물에 도금된다. 튜브 형성은 시간 이내에 발생하고 새로 형성된 세관은 쉽게 정량화.

에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석<em&gt; 체외</em&gt; 혈관 신생 연구

우리는 검출 및 정량화 리간드, 혈관 내피 성장 인자 패밀리의 구성원의 활성을 모니터링하는 간단한 셀 기반 생물학적 검정을 기술한다. 분석법은 리간드가 수용체 결합 및 가교 결합의 반 정량적 또는 정량적 평가를 제공하는 인자 의존적 세포주에서 발현 된 키메라 수용체를 사용한다.

혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

내 피 엽 전환 (EndMT)는 EndMT에 관련 된 세포 신호 경로 조사 하는 데 유용의 생체 외에서 유도 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 실험 모델에서 EndMT MS-1 내 피 세포에서 TGF-β와 치료에 의해 유발 됩니다.

내 피 엽 전환 성장 인자-β 신호 변환에 의해 유도 된의 분자 분석

여기서, 우리는 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브 형성 분석을 사용하여 혈관 네트워크 형성에 루타 graveolens의 물 추출물의 효과를 평가한다.

HUVEC 튜브 형성 분석은 혈관 신생에 천연 물의 영향을 평가하기 위해

3차원 공동 배양 스페로이드 혈관신생 분석 시스템은 생리적 혈관신생을 모방하도록 설계된다. 공배양 스페로이드는 두 개의 인간 혈관 세포 전구체, ECFC 및 MSC에 의해 형성되고, 콜라겐 겔에 내장된다. 새로운 시스템은 혈관 신생 변조기를 평가하는 데 효과적이며 생체 내 연구에 보다 관련성이 있는 정보를 제공합니다.

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

The aim of this method is to obtain fibroblast-derived 3D matrices as a natural scaffold for subsequent cellular assays. 섬유아세포는 전처리된 배양판에 씨를 뿌리고 매트릭스 생성을 위한 아스코르브산으로 자극된다. 행렬은 탈세포화되고 관련 세포(예를 들어, 내피 세포)를 배양하도록 차단된다.

섬유 아세포 유래 3D 매트릭스 시스템은 내피 튜브 형성 분석에 적용

여기서 제시된 것은 혈관 형성에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 환자 유래 유도 만능 줄기 세포 유래 내피 세포에서 제브라피쉬 및 튜브 형성 분석에서 의 제브라피시 및 튜브 형성 분석에서 전체 마운트에 대한 프로토콜이다.

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

현재 프로토콜은 영양막 세포와 같은 세포가 세포외 기저막 매트릭스 층에 걸쳐 모세관 같은 구조로 조직되는 고전적인 체외 혈관 형성 분석에서 형성된 튜브와 같은 구조를 복구할 수 있도록 합니다. 회수된 구조는 다양한 생화학 분석을 위한 RNA 및 단백질 분리에 사용됩니다.

분화 마커 발현 분석을 위한 Angiogenesis-Tube Formation Assay에서 영양막 세포 회수

이 연구는 2차원(2D) 스크래치 상처 이동 분석 및 3차원(3D) 스페로이드 발아 분석과 함께 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 각각의 다운스트림 분석 방법과 함께 in vitro 혈관 신생을 연구하는 데 적합한 분석법으로 제시합니다.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

배우세요 내피 세포 관 형성 분석법으로 혈관신생을 정량화하는 방법입니다. HUVEC를 이용하여 세포 외 기질과 CXCR2 억제제의 영향을 측정하고 암 연구에 활용할 수 있습니다.

전략적 내피 세포 관 형성의 분석 : 감소 세포 외 매트릭스 세포 외 기질과 성장 인자를 비교

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