Minipigs의 활액과 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 세포 표현형

본 절차의 전반적인 목표는 재생 및 면역 조절 연구에 사용할 중간엽 줄기세포를 수집하기 위해 미니피그로부터 활막액과 골수를 비침습적으로 채취하는 것입니다. 이 방법은 활막액 내 MSC를 어떻게 확립하는지, 그리고 골수 MSC와 비교하여 이들의 특성을 어떻게 규명하는지와 같이 이비인후과 MSC 치료 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미니피그 유래 활막액 및 골수 유래 MSC의 핵심 특성을 효과적으로 확립하여 환자 적용에 유용하게 활용할 수 있다는 점입니다.

운동선수 환자의 관절강 내 활막액 유래 MSC 집단이 유의미하게 증가한다는 점에서, 이 기술의 시사점은 다양한 관절 질환의 치료로 확대됩니다. 이 방법은 재생 의학에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 자가면역 질환 연구와 같은 다른 연구에도 적용될 수 있습니다. 미니돼지 MSC는 자가 이식성이므로, 인간의 면역 억제 연구에도 유용할 수 있습니다.

다른 연구원들과 더불어, 제 3학년인 이현정과 이원재가 절차를 시연할 예정입니다. 우선, 장골능에 접근할 수 있도록 마취된 미니돼지의 자세를 잡습니다. 다음으로, 면도기나 클리퍼를 사용하여 장골능의 15-square-centimeter 영역을 제모합니다.

그 다음, 노출된 피부를 포비돈-요오드와 70% ethanol로 번갈아 가며 3회 세척합니다. 완전히 건조되면 멸균 드레이프를 덮습니다. 이제 3~4 mL로 헹궈내어 10 mL 주사기를 헤파린으로 사전 코팅합니다.

이렇게 하면 골수를 추출하는 동안 응고되는 것을 방지할 수 있습니다. 그런 다음, 장골능(iliac bone crest)의 정확한 위치에 헤파린 처리된 주사기와 골수 추출기를 단단히 부착하고, 최소 5 mL의 골수를 추출합니다. 추출된 골수에서 세포를 분리하려면, 먼저 실온에서 15 mL 원심관(conical tube)에 동일한 부피의 DPBS를 넣어 희석합니다.

그다음, 두 번째 15-milliliter 원뿔형 튜브에 밀도 원심분리 배지 3 milliliters를 넣습니다. 이어서, 희석된 골수를 밀도 원심분리 배지 위에 4 milliliters 조심스럽게 옮겨 두 개의 용액 층을 만듭니다. 이제 튜브를 실온에서 400 Gs로 40분 동안 원심분리합니다.

원하는 단핵구(MNCs)는 중앙의 흰색 층에 수집됩니다. 이 층만 흡입하십시오. MNC 층을 15-milliliter 원추형 튜브에 옮기고, 7~8 milliliters의 DPBS로 희석하십시오.

그런 다음, 상온에서 500 Gs로 10분 동안 세포를 원심 분리합니다. 상층액을 버리고, 10 mL의 DPBS로 펠렛팅된 세포를 두 번 세척하며 이전의 원심 분리 과정을 반복합니다. 두 번의 세척 후, MNC를 2 mL의 ADMEM에 부유시킵니다.

그 다음, 세포를 35mm 조직 배양 접시에 분주하고, 5% 이산화탄소가 공급되는 습윤 배양기에서 38.5°C로 배양합니다. 48시간 후, 부착되지 않은 MNC와 함께 배지를 흡입하여 제거합니다. 이어서 2mL의 신선한 ADMEM을 다시 첨가하고, 3일마다 배지를 교체하며 배양을 계속합니다.

세포의 합쳐짐 정도(confluency)가 70에서 80%에 도달하면, 신선한 DPBS로 배양물을 세척합니다. 그 후, 37°C에서 0.25% Trypsin-EDTA 1 mL를 사용하여 3~5분 동안 세포를 해리시킵니다. 세포를 10 mL의 ADMEM에 수집하여 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.

그 후, 실온에서 300 Gs로 5분 동안 세포를 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 이제 회수된 MNCs를 1 mL의 신선한 ADMEM에 현탁하고 세포 밀도를 측정합니다. 마지막으로, 4 mL의 ADMEM이 담긴 T25 플라스크에 50만에서 75만 개의 세포를 분주하여 마무리합니다.

플라스크를 플레이트와 동일하게 배양하고, 3일마다 배지를 교체합니다. 골수 채취 준비 시와 마찬가지로 대퇴 관절 부위에 15x10 cm 크기의 피부 절개를 준비합니다. 그런 다음, 피부 아래에서 슬개골과 경골 능선을 촉진하여 활막 관절을 확인하고, 23-gauge 바늘이 장착된 3 mL 주사기를 관절 내로 정확하게 삽입합니다.

부드럽게 흡입하여 1/2에서 1 mL 사이의 액체를 추출하고, 즉시 바늘을 뺍니다. 활액의 부피가 너무 적은 경우, DPBS로 공동을 세척하여 DPBS와 함께 활액을 수집합니다. 사용하는 DPBS의 부피는 활액 공동의 크기에 따라 다릅니다.

건강한 관절에서 활액의 최적 부피는 제한적입니다. 부피는 관절의 크기와 병리학적 상태에 따라 달라집니다. 활액에서 세포를 분리하려면, 실온에서 15-milliliter 원추형 튜브에 활액과 동일한 부피의 DPBS를 넣어 희석하십시오.

다음으로, 희석액을 40-micron 나일론 세포 스트레이너(cell strainer)로 여과하여 부스러기를 제거합니다. 그 다음, DPBS 10 mL를 추가로 넣고, 상온에서 400 Gs로 10분 동안 현탁액을 원심분리합니다. 이어서 상층액을 버리고, DPBS를 사용하여 세포를 2회 세척합니다.

세척된 세포 펠릿을 2 mL의 ADMEM에 현탁합니다. 그 후, MSC에서 시연된 것과 같이 세포 배양을 진행합니다. 미니돼지의 골수와 관절 활막 관절에서 MSC를 성공적으로 분리하여 체외에서 증식시켰습니다.

활액 유래 MSC의 형태는 골수 유래 MSC와 유사하며, 둘 다 섬유아세포와 같은 방추형 모양을 띠고 균질하게 부착됩니다. MSC는 3차 계대 배양이 완료된 후 알칼리성 인산분해효소 염색에서 양성 발현을 나타냈습니다. 다음으로, 두 배양액 모두에서 표면 마커를 분석하였습니다.

예상한 대로, 두 종류의 MSC 모두 CD29, CD44 및 Vimentin을 유의미하게 발현하였습니다. 반면, CD34와 CD45의 발현은 음성이거나 낮았습니다. 이러한 결과는 활액에서 분리한 세포를 포함하여 서로 다른 MSC를 통해 얻은 결과와 동일했습니다.

이 영상을 시청한 후, 미니돼지에서 MSC를 분리하기 위해 활액과 골수를 비침습적으로 흡인하는 방법과 이 MSC의 비교 및 표현형 분석을 수행하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도할 때는 세심한 촉진을 통해 장골능과 관절낭의 목표 지점을 찾는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 골수 유래 MSC뿐만 아니라 활액 유래 MSC 또한 연골 또는 골 형성 및 면역 억제 능력을 동일하게 갖추고 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 골관절염 또는 류마티스 관절염 모델과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 개발 이후 관절염 환자의 손상되거나 염증이 있는 관절에서 유래한 MSC의 특성을 규명함으로써 관절 질환의 자가 치료를 발전시켰습니다.