2016년 7월 2일
미니피그의 활액과 골수에서 분리하고 주사기 흡인을 사용하여 비침습적으로 채취한 중간엽 줄기세포(MSC)를 확립하는 프로토콜이 제시됩니다. 세포 표현형분석은 세포 분리 후 유세포 분석을 사용하여 수행되었으며 MSC에서 유래한 골수 및 활액의 체외 배양을 수행했습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 재생 및 면역 조절 연구에 사용할 중간엽 줄기 세포를 수집하기 위해 미니돼지에서 활액과 골수를 비침습적으로 수집하는 것입니다. 이 방법은 MSC에서 활액을 확립하는 방법, 골수 MSC와 비교하여 활액을 특성화하는 방법과 같은 이비인후과 MSC 요법 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미니피그에서 추출한 활액 및 골수 유래 MSC의 주요 특성을 효과적으로 확립하는 것이며, 이는 환자에게 적용하는 데 유용합니다.
이 기술의 의미는 다양한 관절 질환의 치료로 확장되는데, 이는 활액 내에서 활액 유래 MSC의 개체군이 운동 환자에서 크게 증가하기 때문입니다. 이 방법은 재생 의학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 자가면역 질환 연구와 같은 다른 연구에도 적용할 수 있습니다. 미니피그 MSC는 자가 감염이 있기 때문에 면역 억제는 인간에게 흥미로울 수 있습니다.
다른 과학자들 외에도 시연을 하는 사람은 저의 레벨 3인 이현정과 이원재입니다. 시작하려면 마취된 미니피그가 장골 능선에 접근할 수 있도록 방향을 잡습니다. 다음으로, 장골능의 15제곱센티미터 영역을 면도기나 가위를 사용하여 제모합니다.
그런 다음 포비돈 요오드와 70% 에탄올로 노출된 피부를 번갈아 세 번 문지릅니다. 완전히 건조되면 멸균 커튼을 바릅니다. 이제 3-4밀리리터 헹굼제를 사용하여 10밀리리터 주사기에 헤파린을 미리 코팅합니다.
이렇게 하면 골수가 추출되는 동안 골수가 응고되는 것을 방지할 수 있습니다. 그런 다음 장골골 능선에서 정확히 골수 추출기를 헤파린으로 코팅된 주사기에 단단히 부착하고 최소 5ml의 골수를 추출합니다. 추출된 골수에서 세포를 분리하려면 먼저 실온에서 15ml 원추형 튜브에 동일한 부피의 DPBS로 희석합니다.
그런 다음 3mL의 밀도 원심분리 매체를 두 번째 15ml 원추형 튜브에 로드합니다. 다음으로, 희석된 골수 4ml를 밀도 원심분리 매체에 조심스럽게 옮겨 2용액 층을 만듭니다. 이제 실온에서 400분 동안 튜브를 400Gs로 원심분리합니다.
원하는 MNC는 중앙 백색 층에 수집됩니다. 이 레이어만 흡인합니다. MNC 층을 15ml 원뿔형 튜브로 배출하고 7-8ml의 DPBS로 희석합니다.
그런 다음 실온에서 10분 동안 500Gs로 세포를 원심분리합니다. 상층액을 버리고 팰릿에 담긴 세포를 10ml의 DPBS로 두 번 세척하여 이전 원심분리 주기를 반복합니다. 두 번의 세척 후 MNC를 2밀리리터의 ADMEM에 매달아 놓습니다.
그런 다음 세포를 35mm 조직 배양 접시에 넣고 가습된 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 38.5도에서 배양합니다. 48시간 후 부착되지 않은 다국적 기업과 함께 배지를 흡인합니다. 그런 다음 2ml의 신선한 ADMEM을 다시 추가하고 3일마다 배지를 교체하여 배양을 계속합니다.
세포가 70-80% 농도에 도달하면 신선한 DPBS로 배양액을 세척합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 3-5분 동안 0.25%트립신-EDTA 1밀리리터를 사용하여 세포를 해리합니다. 10 밀리리터의 ADMEM에 세포를 모아 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 실온에서 5분 동안 300Gs에서 세포를 스핀다운하고 상층액을 버립니다. 이제 수확된 다국적 기업을 1ml의 신선한 ADMEM에 현탁시키고 밀도를 측정합니다. 1/2에서 3/4 백만 사이의 세포를 4 밀리리터의 ADMEM이 함유된 T25 플라스크에 도금하여 마무리합니다.
플라스크를 플레이트와 마찬가지로 배양하고 3일에 한 번씩 배지를 교체하십시오. 골수 채취를 준비할 때와 마찬가지로 대퇴 관절 위에 15x10cm 크기의 피부 단면을 준비합니다. 그런 다음 피부 아래의 슬개골과 경골 능선을 촉진하여 활막 관절을 확인하고 23게이지 바늘이 달린 3ml 주사기를 관절에 정확하게 삽입합니다.
부드러운 흡입을 사용하여 1/2에서 1ml 사이의 액체를 추출하고 즉시 바늘을 빼냅니다. 활액 부피가 너무 작으면 DPBS로 캐비티를 세척하여 DPBS로 활액을 수집합니다. 사용할 DPBS의 부피는 활액강의 크기에 따라 다릅니다.
건강한 관절에서 활액의 최적 부피는 제한됩니다. 부피는 관절의 크기와 병리학적 상태에 따라 다릅니다. 활액에서 세포를 분리하려면 실온에서 15ml 원추형 튜브에 동일한 부피의 DPBS로 액체를 희석합니다.
다음으로, 40미크론 나일론 셀 스트레이너를 통해 희석액을 여과하여 파편을 이동합니다. 그런 다음 DPBS 10ml를 더 넣고 실온에서 10분 동안 400Gs에서 현탁액을 원심분리합니다. 다음으로, 상등액을 버리고 DPBS를 사용하여 세포를 두 번 씻습니다.
세척된 셀 팔레트를 2ml의 ADMEM에 매달아 놓습니다. 그런 다음 MSC로 입증된 바와 같이 세포 배양을 진행합니다. MSC는 미니피그의 골수 및 관절 활막 관절에서 성공적으로 분리되고 시험관 내에서 확장되었습니다.
활액 유래 MSC의 형태는 골수 유래 MSC의 형태와 유사하며, 둘 다 섬유아세포 방추체 모양을 가지고 있으며 균일하게 부착되어 있습니다. MSC는 세 번째 계대배양이 완료된 후 알칼리-인산가수분해효소 염색에 대해 긍정적인 발현을 보였습니다. 다음으로, 두 배양에서 표면 마커를 분석했습니다.
예상대로 두 가지 유형의 MSC 모두 CD29, CD44 및 Vimentin을 유의하게 발현했습니다. 대조적으로, CD34 및 CD45의 발현은 음성이고 낮았다. 이러한 결과는 활액에서 분리된 세포를 포함하여 독특한 MSC를 통해 얻은 결과와 동일했습니다.
이 동영상을 시청한 후에는 Minipigs에서 MSC를 분리하기 위해 활액 및 골수를 비침습적으로 흡인하는 방법과 이 MSC의 비교 및 표현형 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 신중한 촉진에 의해 결정된 장골능과 활액막에서 목표 지점을 찾는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 골관절염 또는 류마티스 관절염 모델과 같은 다른 방법을 수행하여 골수 MSC뿐만 아니라 활액 MSC가 연골 또는 뼈 시작 및 면역 억제에 대해 동일한 종류의 능력을 가지고 있는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.
개발 후, 이 기술은 관절염 환자의 관절 공격이나 염증에서 유래한 MSC를 특성화하는 데 도움을 줌으로써 관절 질환의 자가 요법을 발전시켰습니다.
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이 기사는 미니돼지의 활막액과 골수에서 비침습적으로 중간엽 줄기세포(MSCs)를 수집하는 방법을 제시합니다. 이 연구는 재생 의학 및 면역조절 응용을 위해 이러한 세포를 특성화하는 중요성을 강조합니다.
Non-invasive isolation and phenotyping of mesenchymal stem cells (MSCs) from minipig synovial fluid and bone marrow enables robust comparative analysis of cell sources for regenerative and immunomodulatory research. This workflow supports early-stage target validation and de-risks translational studies by providing standardized, reproducible MSC populations for downstream applications. The approach enhances predictive confidence in preclinical model selection and portfolio advancement for cell-based therapies targeting joint and autoimmune diseases.
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying standardized MSCs for target validation, assay development, and translational research in joint and autoimmune disease models.