Name: C2C12 근육 모세포의 세포에 근긴장 성 이영양증 1 모델링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 배우세요 C2C12 근육 모세포 유지, 유전자 전염 및 역바이러스/렌티바이러스 매개 유도를 활용한 근긴장성 이영양증 1 세포 모델 구축 방법. 이 기술은 근육 질환의 병리 기전 연구에 필수적입니다.

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시약을 제공해 주신 베일러 의과대학의 톰 쿠퍼(Tom Cooper) 박사님, 위스콘신-매디슨대학교(University of Wisconsin-Madison)의 마니 S. 마하데반(Mani S. Mahadevan) 박사님, 제네바 대학교(University of Geneva)의 디디에 트로노(Didier Trono) 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 휴스턴 대학교 스타트업 펀드(YL), 미국심장협회 보조금(YL, 11SDG5260033) 및 중국 국립자연과학재단(XP, 81460047)의 지원을 받고 있습니다.

1. C2C12 세포 배양 <ol><li> 성장 배지에서 100mm 플레이트 C2C12 마우스 근육 아세포를 유지 (둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)) 20 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 2 mM의 L- 글루타민. 60 % 합류 - C2C12 계대 세포는 약 50이 될 수 있습니다. </li><li> 성장 배지를 버리고 3 ㎖을 실온 인산 완충 식염수 (PBS)로 C2C12 세포를 세척 하였다. PBS를 제거하고 세포를 분리하기 위해 500 ㎕를 0.25 % 트립신 - EDTA를 추가합니다. 5 분 - 3 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다. </li><li> 3 ml의 성장 배지를 첨가함으로써 트립신을 중성화. 세포를 일시 중단 8 회 - 6 피펫. 새로운 100mm 판에 일시 중단 된 세포의 1 ML을 추가하고 37 ° C, 5 % CO 2 부화. </li></ol> 2. C2C12 세포 형질 / 전달 및 선택 <ol><li> C2C12 플라스미드 형질 <ol><li> 24 시간 이전에 형질 전환, 페이지에각 형질에 대한 여섯 잘 플레이트 잘 하나에 늦게 7.0 × 10 5 C2C12 세포. 참고 :이 50 리드 - 형질 전환시 60 %의 합류. </li><li> 형질 시약은 사용 전에 실온에 올 수 있습니다. </li><li> 간단히 미리 예열 무 혈청 배지와 소용돌이 200 μL에 플라스미드 DNA (GFP-CUG5 또는 GFP-CUG200)의 2 μg의 추가. 중간에 6 μl를 형질 전환 시약을 추가하고 소용돌이를 사용하여 30 초 즉시 섞는다. 실온에서 30 분 동안 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 2.5 ml의 무 혈청 성장 미디어 C2C12 세포의 미디어를 변경합니다. 배양 한 후 세포에 형질 전환 혼합물을 추가합니다. 5 % CO 2, 37 ° C 배양기에 플레이트를 돌려줍니다. </li><li> 4 시간 또는 야간까지 형질 전환 혼합물 / 무 혈청 성장 배지에서 세포를 유지합니다. 다음 날 다시 성장 미디어 매체를 변경하거나 독성이 명백한 경우. 참고 : 세포 독성은 CE의 현미경 검사로 평가된다LLS. 세포 형태 및 세포 분리의 변화를 관찰한다. 한은 어떠한 명백한 독성이없는 한, 무 혈청 성장 배지에서 밤새 배양 한 형질을 향상시킨다. </li><li> (플라스미드없이 형질) 제어 문화가 살아있는 세포를 가지고 있지 않을 때까지 십일 ~ 1.6 ㎎ / ㎖의 G418 - 1.2을 추가하여 세포를 형질 전환 후 48 시간을 선택합니다. G418 보충 성장 미디어 매 2 일 매체를 변경합니다. </li><li> 후속 실험을 37 ℃에서 성장 배지 및 5 % CO 2에서 G418 내성 세포를 유지한다. </li></ol></li><li> 레트로 바이러스 제제와 C2C12의 레트로 바이러스 전달 <ol><li> 10 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 2 mM L- 글루타민으로 DMEM 고 글루코스 보충하여 HEK 293 배지를 준비한다. <ol><li> 약 24 시간 형질 전환 이전에, 100 밀리미터 판 (형질에서 80 % 합류)에 4.0 × 10 6 ecotropic HEK 293 기반의 포장 세포를 플레이트 Containing 세포 배양 배지. </li></ol></li><li> 형질 시약은 사용 전에 실온에 올 수 있습니다. </li><li> 1 ml의 무 혈청 성장 배지에서 15 μg의 플라스미드 DNA (pMSCV-또는 순수하지 않아 pMSCV-Celf1Flag - 순수하지 않아)를 섞는다. 소용돌이 짧게. DNA를 / 무 혈청 성장 매체 튜브에 단계 2.2.2에서 30 ㎕를 형질 전환 시약을 추가하고 소용돌이를 사용하여 잘 섞는다. 30 분 동안 혼합물을 실온에서 인큐베이션. </li><li> ecotropic의 HEK 293 기반 패키징 세포로 형질 전환 혼합물 적가를 추가합니다. 부드럽게 플레이트 소용돌이와 5 % CO 2, 37 ° C 배양기에 다시를 반환합니다. 24 시간 후, 10 ml의 사전 예열 신선한 성장 매체에 미디어를 변경합니다. </li><li> 상층 액 (포함하는 레트로 바이러스) 피펫을 이용하여 형질 전환 후 48 시간을 수확하고 50 ML의 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송합니다. 판에 새로운 따뜻한 매체의 10 ML을 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 4 ° C에서 뜨는을 유지합니다. 참고 : 용지가 T로 부드럽게 추가그는 또한 측면 세포 단층을 방해하지 않도록. </li><li> 형질 전환 후 상층 액을 60 시간의 두 번째 배치를 수확 및 2.2.5에서 뜨는와 함께 수영장. 500 XG, 7 분 4 ° C에서 원심 분리기 세포 파편을 제거합니다. </li><li> 새로운 50 ML의 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송합니다. 2.2.9 또는 나누어지는 단계로 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 뜨는을 저장하기 위해 진행하여이 시점에서 C2C12 세포를 형질 도입하는 레트로 바이러스를 사용합니다. </li><li> 냉동 재고가 여기에 사용되는 경우, 실온에서 2.2.7에서 레트로 바이러스를 녹여. 참고 : 여러 동결 해동 사이클을 피하십시오. </li><li> 합류의 40 % - 30을 목표로 전달의 같은 날에 C2C12 세포를 플레이트. <ol><li> 성장 배지를 버리고 3ml를 실온으로 PBS C2C12 세포를 세척 하였다. 의 PBS를 제거 500 ㎕를 0.25 % 트립신 - EDTA를 추가하고, 3 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 접시를 품어 - 5 분. </li><li> 3 ㎖ 성장 의대를 추가하여 트립신을 중화IUM. 세포를 일시 중단 8 회 - 6 피펫. 혈구를 사용하여 세포를 계산하고, 60mm 판에 8.0 × 10 5 C2C12 세포를 추가합니다. </li></ol></li><li> 3 ㎖ 성장 배지에서 세포의 하나 60mm 판을 감염 0.5 ml의 레트로 바이러스를 추가합니다. 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. </li><li> 감염 후 48 시간 - 선택 항생제 (3 μg의 / ㎖의 퓨로 마이신 1)로 보충 3 ㎖ 새로운 미디어로 교체하십시오. untransduced C2C12 제어 문화가 밖으로 죽을 때까지 5 ~ 일 동안 매일 항생제와 3 ㎖ 매체를 교체합니다. </li></ol></li><li> 렌티 바이러스 준비와 C2C12의 렌티 바이러스 전달 참고 : 바이오 안전성 레벨 2 캐비닛을 모든 렌티 바이러스 관련 절차를 수행하고 생물 안전 지침을 따르십시오. 바이러스를 포함하는 액체 폐기물은 폐기하기 전에 소독해야합니다. <ol><li> 10 %의 태아 보충 HEK 293 세포 배양 배지 (DMEM 높은 포도당과 함께 100mm 접시 (~ 형질의 날에 80 % 합류)에 판 4.0 × 10 6 293T 세포,소 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 2 mM L- 글루타민) 형질 감염 전 24 시간. </li><li> 실온으로 형질 감염 시약을 따뜻하게. 8 μg의의 렌티 바이러스 전송 벡터와 함께 렌티 바이러스 포장 벡터 (4 μg의 pMD2.G 6 μg의 psPAX2) 혼합 (Celf1의 shRNA 또는 제어 shRNA를 스크램블) 1 ml의 무 혈청 세포 배양 배지에서. 소용돌이 짧게. </li><li> DNA를 / DMEM 튜브에 36 μL 사전 예열 형질 전환 시약을 추가하고 소용돌이에 의해 잘 섞는다. 30 분 동안 혼합물을 실온에서 인큐베이션. </li><li> 인큐베이터에서 293T 세포를 제거하고 판에 형질 전환 혼합물을 추가합니다. 부드럽게 플레이트 소용돌이 다시 5 % CO 2, 37 ° C 배양기에 반환. 24 시간 후, 10 ml의 신선한 배양액으로 형질 전환 혼합물을 교체합니다. </li><li> 형질 전환 후 상층 액을 포함 렌티 바이러스 48 시간을 수집하고 50 ml의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 접시에 10 ml의 새로운 따뜻한 미디어를 추가하고 반환인큐베이터합니다. 4 ° C에서 뜨는을 저장합니다. </li><li> 형질 전환 후 상층 액을 60 시간의 두 번째 배치를 수집하고 2.3.5에서 뜨는와 결합. 500 XG, 7 분 4 ° C에서 원심 분리기 잠시. </li><li> 신선한 50 ML의 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송합니다. 신선한 바이러스를 사용하는 경우, 2.3.9 단계로 진행합니다. 향후 사용을 위해, 매장 10 ㎖를 분취에서 -20 ° C에서 뜨는 바이러스 함유. </li><li> 동결 스톡이 사용되는 경우, 사용하기 전에 실온에서 2.3.7에서 바이러스를 해동. 참고 : 여러 동결 해동 사이클을 피하십시오. </li><li> 전달의 같은 날 2.2.9에 기술 된 바와 같이 (2.1 절에서 얻은) 플레이트 C2C12-CUG200 세포. 참고 : 30 목표 - 합류의 40 %. </li><li> C2C12-CUG200의 60mm 판을 감염 인큐베이터에 접시를 반환하는 0.5 ml의 바이러스를 추가합니다. </li><li> 전달 후 72 시간 - 선택 항생제 (3 μg의 / ㎖의 퓨로 마이신 1)와 보충 신선한 매체와 문화 매체를 교체합니다.모든 untransduced C2C12 - CUG200 제어 문화가 밖으로 죽을 때까지 5 ~ 일 동안 선택 항생제와 문화 매체 일상을 새로 고칩니다. </li><li> GFP-CUG200 형질 세포에서 Celf1 최저를 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 3. C2C12 세포 분화 <ol><li> 플레이트 분화 개시 전에 2.5 ml의 성장 매체 24 시간에서 6 웰 플레이트 잘 하나에 2 × 10 6 세포. 주 : 전체 합류 24 시간에 도달되도록 도금 밀도를 조정할 수있다. <ol><li> PBS로 융합 세포를 씻어 낮은 혈청 분화 배지 2.5 ㎖ (둘 베코 이글 배지는 2 % 말 혈청 개질 100 U가 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 2 mM L- 글루타민, 1 μM의 인슐린)을 추가 . 매 2 일 매체를 교체합니다. 참고 : 냉동 재고 인슐린을 유지하고 각각의 매체 변화에 미디어에 추가합니다. </li></ol></li><li> C2C12 차별화하는 동안, 콴에 대한 샘플을 수집titative 다음 시점에서 RT-PCR (섹션 4 참조) Day0, 1, 2, 4, 6 일째에 대한 면역 염색 배양 공정 6 - 8 (섹션 5 참조). </li></ol> 4. RNA의 분리 및 정량 RT-PCR <ol><li> RNA 분리에 대한 제조 업체의 프로토콜을 사용합니다. 분리 후, 30 μL의 RNase가없는 물에 RNA 펠렛을 재현 탁하고 다운 수회 피펫을하고. 주의 : 샘플을 정량적 RT-PCR을 진행 또는 -80 ° C에서 저장 될 수있다. </li><li> 정량적 RT-PCR (10)에 대한 RT qPCR에 키트를 사용하여 제조업체의 지시 사항을 따르십시오. 표 1에 따른 반응 혼합물을 준비한다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 볼륨 (μL) </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 2 × 반응 버퍼 </td><td> (10) </td><td> 1 배 </tD&gt; </tr><tr><td> 앞으로 프라이머 </td><td> 0.5 </td><td> 200 nm의 </td></tr><tr><td> 역방향 프라이머 </td><td> 0.5 </td><td> 200 nm의 </td></tr><tr><td> 조사 </td><td> 0.5 </td><td> 200 nm의 </td></tr><tr><td> 효소 및의 RNase 억제제 역 </td><td> 0.1 </td><td> 0.25 U / ㎖ </td></tr><tr><td> 주형 </td><td> 1 </td><td> 100 NG 총 RNA </td></tr><tr><td> 의 RNase없는 물 </td><td> 7.4 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 총 믹스 </td><td> (20) </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 정량적 RT-PCR 마스터 믹스 준비 <ol start="3"><li> 열 프로파일 표 2를 사용하여 20 ㎕의 RT-qPCR에 반응을 실행합니다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 역전사 단계 </td><td> 30 분, 48 ° C </td></tr><tr><td> DNA 폴리머ASE의 활성화 / 비활성화 역전사 </td><td> 10 분, 95 ° C </td></tr><tr><td rowspan="2"> (40) 사이클 </td><td> 15 초, 95 ° C </td></tr><tr><td> 1 분, 60 ° C </td></tr></tbody></table> 표 2. 정량적 RT-PCR 열 프로파일 5. 면역 염색 <ol><li> 2.5 단층 배양 해결 갓 실온에서 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 / PBS를 제조 ㎖로. </li><li> 실온에서 30 분 동안 2.5 ml의 0.1 % 트리톤 X-100 / PBS에서 샘플 Permeabilize 하시려면. </li><li> 가습 챔버에 샘플을 전송합니다. 37 ° C에서 30 분 동안 완충액 (0.1 % 비이 온성 계면 활성제 / PBS 10 % 정상 염소 혈청)을 차단하는 2.5 ml의 샘플을 차단. </li><li> 차단 버퍼를 취소하고 버퍼 (1 : 100)를 차단에 희석 마이 오신 무거운 사슬에 800 μL 차 항체를 적용합니다. 상온에서 습윤 챔버에서 밤새 인큐베이션. </li><li> 판 3 팀을 씻으십시오ES 2.5 ml의 세척 버퍼 2 일에 (0.1 % 폴리 소르 베이트 20 / PBS)와 (10 분마다). </li><li> 세척 완충액을 제거하고 800 ㎕의 차 항체 (염소 항 - 마우스 IgG, 1 : 500 희석 된 PBS)을 적용한다. 실온에서 1 시간 동안 습윤 챔버에서 인큐베이션. </li><li> 2.5 ml의 세척 버퍼로 2 회 (10 분마다)를 씻으십시오. </li><li> 5 분 (증류수 탈 H 2 O에 희석 1 μg의 / ㎖) 800 ㎕를의 DAPI로 품어. </li><li> 10 분 동안 다시 2.5 ml의 세척 버퍼로 씻으십시오. </li><li> 2.5 ml의 PBS로 세척 버퍼를 변경하고 이미지를 캡처하는 형광 현미경을 사용합니다. </li></ol>

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C2C12 세포주 11-14 근육 생성을 연구 모델로서 이용되어왔다. 이러한 세포는 섬유 아세포와 같은 모양을 유지, 20 % 소 태아 혈청을 함유하는 배지에서 증식 신속 용이 2 % 말 혈청 (15)를 포함하는 배지에서 분화. 빠른 성장 및 분화는 근육 생성 세포 모델에서 유리한 특성이다. 여기서는 C2C12 세포 내로 cDNA의 3&#39;-UTR, 및 shRNA를 소개하는 플라스미드, 레트로 바이러스 및 렌티 바이러스 벡터의 사용을 입증한다. 형질 전환 / 전달 및 분화의 일관성 유지를위한 중요한 포인트는 아래에 강조 표시됩니다. 매일 셀 유지 보수의 세포 밀도가 매우 중요하다. 70 % 합류 - 이들 세포는 50 이하로 배양 할 필요가있다. 밤새 떠날 때 때문에 짧은 인구 배가 시간에 높은 합류 (&gt; 70 %) C2C12 문화는 자발적으로 구별합니다. 자발적으로 분화 된 세포의 비율을 작게 할 수 있지만,...

근긴장 이상증 (DM)는 여러 시스템, 특히 심장과 골격 근육 (1)에 영향을 미치는 염색체 우성 질환이다. 이 질병, DM1과 DM2의 두 하위 유형이 있습니다. DM1 더 일반적이며 DM2 2보다 더 심한 표현이 있습니다. DM1 근본적인 유전 적 변이는 3 &#39;비 번역 영역 DM 단백질 키나제 유전자 (DMPK) 3 (UTR)에있는 CUG 삼중 반복의 확장이다. 영향을받지 않는 개인의 CUG 반복 수는 대조적으로 (37)에 5,은 50 개 이상으로 증가하고, 때로는 최대 DM1 환자 4 천에 달라집니다. 그 결과, 같은 RNA 결합 단백질, muscleblind 형 1 (MBNL1) CUGBP 및 Elav 같은 가정 한 (Celf1) misregulated이다. 때문에 확장 된 CUG 반복에 격리에 MBNL1 대체 스 플라이 싱 (5)을 조절하는 능력을 잃게된다. Celf1 반면에, 6,7-을 조절한다. Celf1 과발현 근육 손실과 연관된MBNL1 기능의 손실에 기인되지 않고 약점. DMPK 3&#39;-UTR CUG 확장, MBNL1 상실 및 과발현 Celf1 포함 DM1 관련 변화를 시뮬레이션 동물 모델이 수립되었다. 그러나, 근육 아세포에서 DM1을 모델링 특히 DM1 관련 세포 및 분자 이벤트를 해부에 대한 효율적인 대안을 제공합니다. C2C12 근육 모세포 세포주 제 부상 C3H 마우스 근육 분리 널리 근육 조직 분화 8,9을 연구하기 위해 사용되었다. C2C12 세포는 급속 소 태아 혈청 (FBS)을 함유 미디어 증식 용이 FBS가 소모 될 때 분화를 겪는다. 그러나,이 근육 모세포 분화 모델을 사용하여 두 가지 과제를 제시한다 : C2C12 세포는 종종 유전자 형질 전환 / 바이러스 형질 도입에 대해 내성이고; 세포 처리 및 분화 과정에 약간의 차이는 myotube 형성에 표시된 변경 될 수 있습니다. 우리 연구실은 정기적으로 교류 등 C2C12의 근육 아세포를 사용엘 모델과 효과적으로 C2C12 세포주 (10)에 플라스미드 형질 전환, 레트로 바이러스 전달 및 렌티 바이러스 전달에 의해 유전자를 제공하는 프로토콜을 개발했다. 비디오에서 우리는 / 형질 C2C12 세포를 형질 도입 및 DM1의 근원 세포 모델을 확립 차별화 일관성을 유지하기위한 최적화 과정을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM, 고포도</td>당 <td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신-글루타민 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>인슐린 소 췌장 Sigma</td><td>Aldrich</td><td>I6634-100MG</td><td> 분화 매체</td></tr><tr><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12150</td><td>분화 매체</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE&nbsp; HD 형질주입 시약</td><td>Promega</td><td>E2311&nbsp;</td><td>transfection용</td></tr><tr><td>G418 황산염&nbsp;</td><td>골드 바이오테크놀러지&nbsp;</td><td>약물 내성 선택을 위한</td> <td>G-418-10</td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>sc-108071</td><td>약물 내성 선택을 위한</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris 단백질 겔, 1.0 mm, 15 well</td><td>Life Technologies</td><td>웨스턴</td><td>블롯용</td></tr><tr><td>NP0323BOX NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>웨스턴 블롯을 위한</td> <td>Life Technologies</td><td>NP00061</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>웨스턴 블롯에 대한</td> <td>Life Technologies</td><td>NP0002</td></tr><tr><td>Amersham Protran 지원 0.2 NC, 300mm x 4m</td> 웨스턴 <td>블롯에 대한</td><td>GE 헬스케어 생명 과학</td><td>10600015</td></tr><tr><td>MF 20</td><td>발달 Hybridoma Bank</td><td>MF 20</td><td>일차 Ab 면역 염색을 위한</td></tr><tr><td>염소 항 마우스 IgG (H+L) 2차 항체, Texas Red-X conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T-862</td><td>2차 Ab 면역염색</td></tr><tr><td>qRT-PCR MasterMix</td><td>AnaSpec</td><td>05-QPRT-032X</td><td>for qRT-PCR</td></tr><tr><td>TriPure 분리 시약</td><td>Roche</td><td>11667165001</td><td>RNA 분리용</td></tr><tr><td>CUG-BP1 항체 (3B1)</td><td>santa cruz</td><td>sc-20003</td><td>primary Ab western blot</td></tr><tr><td>Actin 항체</td><td>santa cruz</td><td>sc-1615</td><td>goat polyclonal IgG for loading control</td></tr><tr><td>293T Ecopack</td><td>클론텍</td><td>631507레</td><td>트로바이러스 제제를 위한 세포</td></tr><tr><td>pMSCV-puro</td><td>클론텍</td><td>634401</td><td>레트로바이러스 제제를 위한 빈 레트로바이러스 벡터</td></tr><tr><td>pMSCV-Celf1Flag-puro</td><td>하우스 구성</td> 레<td>트로바이러스 제제에 사용되는 Celf1Flag를 인코딩하는 레트로바이러스 벡터</td><td>사용 불가</td></tr> 디<tr><td>디에 트로노의</td><td>psPAX2</td> 선물은 <td>렌티바이러스 제제에</td> <td>사용할 수 없음</td></tr><tr><td>디디에 트로노로부터의</td> <td>pMD2.G</td> 선물은 <td>렌티바이러스 제제에</td><td>사용할 수 없습니다</td></tr>. <tr><td>M.S. 마하데반으로부터</td><td>GFP-CUG5</td> 선물은 <td>참조 10에서</td> <td>사용할 수 없습니다</td>.</tr><tr><td>M.S. Mahadevan의</td> <td>GFP-CUG200</td> 선물은 <td>참조 10&nbsp에서 사용할</td> <td>수 없습니다</td>.</tr><tr><td>트리톤&nbsp; X-100</td><td>시그마 Aldrich</td><td>X100</td><td>면역 염색</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>면역 염색</td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp; 20</td><td>면역염색을 위한</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td></tr><tr><td>DAPI</td> 면역<td>염색을 위한</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td></tr></tbody></table>

c2c12 근육 모세포의 세포에 근긴장 성 이영양증 1 모델링

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

근긴장 이상증 1 (DM1)는 근육 영양 장애의 일반적인 형태입니다. 여러 동물 모델이 DM1 설립되었지만 그들은 세포 및 분자 이벤트를 공부하기위한 효율적인 세포의 대안을 제공하기 때문에, 근원 세포 세포 모델은 여전히​​ 중요하다. C2C12 근육 모세포의 세포가 광범위하게 유전자 형질 전환, 형질 도입 또는 바이러스에 근육 생성, 저항을 연구하는 데 사용되었다하더라도, C2C12 세포의 연구를 방해한다. 여기, 우리는 C2C12의 근육 아세포 및 심근 분화의 유도에 유전자를 도입하는 일상적인 유지 보수, 형질 전환 및 전달 절차를 포함하는 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 종합적으로, 이러한 절차는 최선의 형질 전환 / 전달 효율뿐만 아니라 일관성있는 차별화 된 성과를 가능하게한다. 근긴장 성 이영양증의 연구뿐만 아니라 다른 근육 질환에 유익 할 DM1 근육 모세포 셀 모델 확립에 기재된 프로토콜.

C2C12 세포는 GFP-CUG5 또는 GFP-CUG200로 형질했다. 약제 내성의 선택 후, 안정한 풀을 GFP 발현 (도 1a)에 의해 시각화 될 수있는 확립 하였다. 차별화 된 근육 아세포에서 Myotube 형성은 10 (그림 1B)를 면역 염색 중쇄를 미오신에 의해 검출되었다. myotube 형성의 정량은 융합 지수는 2.6 ± 1.1 %로 35.4 ± 4.1 %로 감소하고, myotube 영역이 GFP-CUG200 (그림 1C)에 이상 CUG 확장에 의해 2.7 ± 0.8 %로 35.6 ± 2.2 %로 감소되었음을 보여 주었다. 융합 인덱스 및 myotube 영역 핵의 총수 및 각각 myotubes 의해 덮여 전체 화상 영역의 비율로 나눈 myotubes (≥ 2 핵)의 핵의 총 개수로 계산 하였다. 실시간 RT-PCR (10)는 ...

이 프로토콜에서는, 우리는 최적화 된 C2C12 세포의 유지 보수, 유전자 형질 전환 / 전달 및 심근 분화를 포함한 근긴장 성 이영양증 1 근원 세포 모델을 설정하는 절차를 제시한다.

C2C12 근육 모세포의 세포에 근긴장 성 이영양증 1 모델링

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

이러한 근모세포 유지, 형질전환 및 형질도입 절차의 전반적인 목표는 근이영양증 및 기타 근육 질환 연구를 위한 근이영양증 단일 세포 모델을 구축하는 것입니다. 이 방법은 M1 병원성의 세부 메커니즘을 조사하는 데 유용한 M1 근모세포 세포 모델을 구축하는 데 도움이 될 수 있습니다. C2C12 근모세포의 이러한 다단계 유전자 조작을 통해 M1의 순차적 및 유전적 병리 현상을 모델링할 수 있습니다. 형질전환 24시간 전에 6-웰 플레이트의 각 웰에 7 × 10⁵개의 C2C12 세포를 분주하십시오.다음 날, 상온의 무혈청 배지 200 µL에 목적 플라스미드 DNA 2 µg을 넣고 용액을 짧게 볼텍싱합니다. 그다음, 상온의 트랜스펙션 시약 6 µL를 배지에 추가하고 즉시 30초 동안 용액을 볼텍싱합니다. 이후 해당 배지를 상온에서 30분 동안 배양합니다.배양 마지막 5분 동안, 각 웰의 배지를 2.5 mL의 신선한 무혈청 성장 배지로 교체하고, 각 웰에 200 µL의 transfection 혼합물을 추가합니다. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣고 4시간 동안 배양합니다.그 다음 현미경으로 세포의 형태 및 부착 상태의 변화를 확인합니다. 세포 독성이 관찰되면 무혈청 배지를 성장 배지로 교체하십시오. 형질전환 48시간 후, 신선한 성장 배지에 적절한 선택 항생제를 첨가하여 10일 동안 2일마다 반복합니다.플라스미드 없이 형질전환한 대조군 웰에는 살아있는 세포가 포함되지 않아야 합니다. 레트로바이러스를 준비하려면, 먼저 100 mm 플레이트에 세포 배양 배지가 들어있는 상태에서 4 × 10⁶개의 ecotropic HEK293 기반 패키징 세포를 분주합니다. 다음 날, 1 mL의 무혈청 성장 배지에 15 µg의 목적 플라스미드 DNA를 섞고 튜브를 짧게 볼텍싱합니다.다음으로, 상온의 transfection 시약 30 µL를 배지에 첨가하고, 즉시 용액을 30초 동안 vortex합니다. 상온에서 30분 후, transfection 혼합액을 ecotropic 세포에 방울방울 첨가하고 플레이트를 부드럽게 흔들어 섞어줍니다. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 옮겨 24시간 동안 배양하며, 다음 날 37 °C의 신선한 성장 배지 10 mL로 배지를 교체합니다.형질전환 48시간 후, 피펫을 사용하여 레트로 바이러스가 포함된 상층액을 50 milliliter 원추형 튜브 하나로 옮겨 4°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 그 다음, 플레이트 벽면을 따라 따뜻한 새 배지 10 milliliters를 첨가하고 배양기를 다시 넣어 배양하십시오. 형질전환 60시간 후에 두 번째 레트로 바이러스 배치를 수확하십시오.이를 48시간에 수집한 레트로바이러스와 합칩니다. 상층액을 원심 분리하여 세포 잔해를 제거하고, 레트로바이러스를 새로운 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 이제 C2C12 세포 배양의 각 웰을 실온의 PPS 3 milliliters로 세척한 후, 0.25% trypsin EDTA 500 micro liters를 첨가하여 37 °C에서 5분 동안 배양합니다.세포가 탈착되면, 각 웰에 3 mL의 성장 배지를 넣어 반응을 중화시키고, 배양액을 6~8회 피펫팅하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 분리합니다. 세포 수를 센 후, 60 mL 플레이트에 8 × 10⁵개의 세포와 3 mL의 성장 배지를 추가합니다. 그런 다음 0.5 mL의 레트로바이러스를 이용하여 세포를 감염시키고, 플레이트를 인큐베이터에 넣어 48시간 동안 배양합니다.이틀 후, 적절한 선택 항생제가 첨가된 신선한 성장 배지 3 mL를 매일 5일 동안 세포에 공급합니다. 이는 형질전환되지 않은 C2C12 대조군 배양액에 더 이상 살아있는 세포가 없을 때까지 수행합니다. C2C12 세포의 렌티바이러스 형질전환을 위해, 생물안전등급 2(BSL-2) 캐비닛 내에서 HEK293 세포 배양 배지가 담긴 100 mm 플레이트에 4 × 10⁶ 개의 293T 세포를 분주합니다.다음 날, 1 mL의 무혈청 세포 배양 배지에서 렌티바이러스 패키징 벡터와 8 µg의 적절한 렌티바이러스 전달 벡터를 혼합합니다. 혼합물을 짧게 볼텍싱한 후, 미리 데워둔 트랜스펙션 시약 36 µL를 첨가합니다. 그런 다음 배지를 다시 30초 동안 볼텍싱하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다.배양이 끝나면 transfection 혼합물을 293T 세포에 첨가하고, 플레이트를 가볍게 흔든 뒤 세포를 다시 인큐베이터로 옮깁니다. 24시간 후에 transfection 혼합물을 10 milliliters의 신선한 배양 배지로 교체합니다. 48시간 후에 렌티바이러스가 포함된 상층액을 50 milliliter 코니컬 튜브로 옮겨 4 °C에서 보관하고, 플레이트에 10 milliliters의 신선하고 따뜻한 배지를 첨가합니다.60시간 후, 두 번째 배치의 상층액을 48시간에 수집한 렌티바이러스와 합치고, 바이러스를 원심분리하여 세포 잔해를 제거합니다. 그런 다음, 앞서 시연한 것과 같이 60mm 플레이트에 배양된 30~40% 합류도의 C2C12 CUG200 세포 배양액에 0.5mL의 렌티바이러스를 첨가합니다. 형질전환 72시간 후, 렌티바이러스 상층액을 적절한 선택 항생제가 보충된 새 배지로 교체합니다.형질전환되지 않은 C2C12 CUG200 대조군 세포가 모두 사멸할 때까지 5일 동안 매일 신선한 선택 항생제가 첨가된 배지로 배양액을 교체합니다. 약제 내성 선택 후, 분화된 근모세포의 GFP 발현과 근관 형성을 다중 형광 분석으로 평가할 수 있습니다. 이 대표 실험에서 근관 형성의 정량 분석 결과, 비정상적인 CUG 확장 및 GFP CUG 200 형질전환 세포에 의해 융합 지수와 근관 면적이 유의미하게 감소함을 보여줍니다.Celf1의 상향 조절은 근이영양증 1형의 CUG 확장과도 관련이 있습니다. 또한, 웨스턴 블로팅을 통해 CUG 확장 시 Celf1 단백질 수준이 지속적으로 상승하며, 분화 과정 중 MyoD, MyoG, Mef2C의 발현이 억제됨을 확인하였습니다. 이는 CUG 확장이 근관 결함 및 근아세포 분화 장애를 유도한다는 것을 시사합니다.Western blot 분석 결과, FLAG 태그가 붙은 Celf1은 레트로바이러스 벡터가 도입된 배양 세포에서만 나타나며, 이러한 세포들에서 Celf1의 발현이 상향 조절됨을 알 수 있습니다. 실제로 Celf1이 과발현된 세포에서는 대조군 배양 세포와 비교했을 때 근관 형성(myotube formation)이 드물게 나타납니다. 이는 Celf1의 과발현이 근아세포(myoblast) 분화를 심하게 저해한다는 것을 시사합니다.또한, Celf1 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)가 존재할 때 내인성 Celf1 단백질의 수준과 이중 항생제 선택 lentiviral vector가 형질도입된 GFP CUG 200 세포의 수준이 현저히 감소합니다. 이러한 배양 세포에서 근관 형성의 회복과 함께 근관 융합 지수 및 근관 면적이 관찰되었습니다. 한편, 실시간 RTPCR 결과는 MyoD, MyoG 및 Mef2C의 발현이 Celf1 짧은 헤어핀 RNA 발현 세포에서 유의하게 증가했음을 시사하며, 이는 Celf1 넉다운(knock down)이 이들 배양 세포의 근세포 분화 결핍을 회복시켰을 가능성을 뒷받침합니다.본 실험 절차를 수행하는 동안 C2C12 세포 밀도가 70% 합류도(confluence) 미만으로 유지되는지 모니터링하는 것이 중요합니다. 세포 형질전환 후, 세포 독성을 모니터링하면서 최소 4시간에서 최대 12시간 동안 무혈청 배지로 세포를 처리하십시오.플라스미드 형질전환, 레트로바이러스 및 렌티바이러스 형질도입을 통해, 당사는 근이영양증 및 기타 근육 질환 연구에 도움이 될 근육강직성 디스트로피 세포 모델을 성공적으로 구축하였습니다.

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연구

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Medicine

의학

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질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화

이 프로토콜은 전기천공법을 사용하여 마우스 근육 섬유에 형광 표지된 단백질을 도입하고 발현합니다. 전기천공법 후 회복 후 섬유가 분리됩니다. 그런 다음 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 개별 섬유를 이미지화하여 근육 구조를 시각화합니다.

DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

근육 세포는 가장 복잡한 진핵 세포 중 하나입니다. 우리는 모든 발달 단계에서 유전자 조작과 명확한 이미징을 가능하게 하는 고도로 성숙한 근섬유의 체외 분화를 위한 프로토콜을 제시합니다.

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우리는 작은 머리핀 (sh) RNA를 사용하여 C2C12 근구 세포재이상체에서 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질을 코딩하는 유전자를 안정적으로 무너뜨리는 프로토콜을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 C2C12 근강초 동안 mRNA, 단백질 및 세포 수준에서 의 녹다운 효율의 유효성을 검증하기 위한 방법을 myotube 분화로 표적화한다.

작은 헤어핀 (sh)RNA를 사용하여 C2C12 근강 세포주에서 세포 외 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자의 안정적인 녹다운

이 문서에서는, 우리는 EXON 건너뛰기 후에 dystrophin mRNA 및 단백질 수준의 회복을 평가하기 위하여 MYOD1-변환된소변 유래 세포를 사용하여 Duchenne 근이영양증 근육의 능률적인 모델링을 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다.

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신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

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인간 신경근 접합부의 광유전학 모델의 공학 및 특성화

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C2C12 근육 모세포의 세포에 근긴장 성 이영양증 1 모델링

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