Name: RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 학습하세요 표적 RNA 시퀀싱 방법을 통해 유전자 발현, 돌연변이 및 대안적 스플라이싱을 분석하는 기술을. 맞춤형 프로브를 활용한 하이브리드화 및 캡처 과정을 통해 비용 효율적인 고속 분석이 가능합니다.

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기술 지원을 해주신 Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto, Eric Samorodnitsky에게 특별한 감사를 드립니다. 또한 우리 팀에 대한 행정적 지원을 해주신 Jenny Badillo에게도 감사드립니다. 오하이오 슈퍼컴퓨터 센터(Ohio Supercomputer Center, OSC)가 디스크 공간, 처리 용량 및 분석 실행을 위한 지원을 제공해 준 것에 대해 감사의 뜻을 전합니다. 이 작업에 대한 행정적 지원에 대해 오하이오 주립대학교 웩스너 메디컬 센터(Ohio State University Wexner Medical Center)의 종합 암 센터(CCC)에 감사드립니다. S.R.과 팀은 미국 암 학회(American Cancer Society, MRSG-12-194-01-TBG), 전립선암 재단(Prostate Cancer Foundation Young Investigator Award), NHGRI(NHGRI, UM1HG006508-01A1), 포어 암 연구 재단(Fore Cancer Research Foundation), 미국 폐 협회(American Lung Association) 및 펠로토니아(Pelotonia)의 지원을 받고 있습니다.

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S.R.은 임상 시험 수행을 위해 Novartis 및 Ariad Pharmaceuticals로부터 자금을 지원합니다. SR 직계 가족은 Johnson and Johnson의 주식을 소유하고 있습니다.

RNAseq 캡처 RNAseq 및 마이크로 어레이 사이의 중간 전략은 사체의 선택된 부분을 평가하기위한 접근이다. 캡처의 이점은 유전자 변형의 데스크탑 시퀀서, 높은 처리량, 및 검출에 선정 신속한 처리 시간 감소를 포함한다. 이 방법은, 비 코딩 RNA를 (23)의 특성을 단일 염기를 검출하도록 구성 될 수있는 RNA의 스 플라이 싱을 조사하고 유전자 융합체 또는 구조적 재 배열 (24)을 식별하기 위해, 4-6 변종. 또한,이 방법은 파라핀 블록 (24, 25)에 포르말린으로 고정 후의 임베디드 한 임상 샘플 또는 처리에 적용될 수있다. 마이크로 어레이에 비해 RNAseq 캡처 몇 가지 중요한 이점이 있으며, 실시간 정량 PCR, 생거 시퀀싱 및 DNA 시퀀싱. 마이크로 어레이 인해 크로스 하이브리드 및 프로브의 결합이 아닌 특정 높은 배경에 의해 제한된다. 리터와 유전자의 정량고도로 발현 유전...

전체 전사체 또는 RNA 염기서열분석(RNAseq)은 모든 RNA 산물을 평가하기 위한 편향되지 않은 염기서열분석 방법입니다. targeted RNAseq(Capture)의 목표는 표준 RNAseq에 비해 감도 증가, 동적 범위 증가, 비용 또는 규모 감소, 처리량 증가를 통해 선택된 전사체를 집중적으로 평가하는 것입니다. 표준 RNAseq와 유사하게, 표적 농축 접근법은 유전자 발현, mRNA, microRNA (miRNA), lncRNA1, 기타 비암호화 RNA2, 유전자 융합3 및 돌연변이4-6과 같은 여러 RNA 종을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
Capture는 상보적인 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 포함하여 염기서열분석을 위한 cDNA 라이브러리를 풍부하게 합니다. RNAseq Capture의 근거는 상보적 올리고뉴클레오티드 또는 프로브를 샘플에 하이브리드화한 다음 상대적 존재량을 측정하는 마이크로어레이 접근법과 유사합니다. 마이크로어레이 기술의 경우, 발현은 이러한 프로브에 결합하는 전사체에 대해 측정된 상대 신호를 기반으로 합니다. 따라서 마이크로어레이는 범위, 비특이적 결합으로 인한 잠재적인 배경 잡음 및 프로브의 교차 혼성화에 의해 제한됩니다. 또한, 어레이는 RNAseq1에 비해 발현이 낮고 높게 발현된 전사체에 대한 동적 범위가 제한적입니다. 마이크로어레이는 RNAseq에 비해 비용이 절감되고 처리량이 높기 때문에 널리 사용됩니다. 
여기에서는 전사체를 평가하기 위한 RNAseq와 마이크로어레이 접근법 사이의 중간 지점을 제공하는 RNAseq 캡처 방법을 보여줍니다. RNAseq Capture는 중간 처리량, 더 큰 동적 범위 및 감도를 제공하며 데스크톱 시퀀서에서 빠른 처리를 위해 확장되었습니다. RNAseq Capture는 또한 저장 공간 및 데이터 처리 측면에서 감소된 컴퓨팅 리소스를 필요로 합니다.

<table><tbody><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>분자 생물학 등급 에탄올</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock 24 x 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 시약 키트 v2 (300- 주기)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 데스크탑 시퀀서</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2301</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; 유니버설 블로킹 올리고 - TS-p5</td><td>IDT</td><td>127040822</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; 유니버설 블로킹 올리고 - TS-p7(6nt)</td><td>IDT</td><td>127040823</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; 유니버설 블로킹 올리고 - TS-p7(8nt)</td><td>IDT</td><td>127040824</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&reg; AMP레그; XP - PCR 정제 비즈&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>다이나비드&reg; M-270 Streptavidin</td><td>Life Technologies</td><td>65305</td><td></td></tr><tr><td>COT 인간 DNA, 형광 측정 등급, 1 mg</td><td>Roche 응용 과학</td><td>05480647001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; 분석 튜브&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; dsDNA HS 분석 키트</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap&reg; EZ 하이브리드화 및 세척 키트&nbsp; (24 또는 96 반응)</td><td>로슈 님블젠&nbsp;</td><td>05634261001 또는 05634253001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; 2.0 형광측정기&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution)</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Life Technologies</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch&trade; 96&ndash의 열 순환기; Well Fast Rection Module</td><td>Biorad</td><td>185-1196</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ 혼성화 및 세척 키트,</td><td>Roche Applied Science</td><td>05634253001</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II, Reverse Transcription 200 U/&#956; l</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP - 40 ml</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>RNA 스크린 테이프 사다리</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5578</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape 샘플 버퍼</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5577</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>DYNAMAG -96 SIDE EACH</td><td>Life Technologies</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>KAPA 핫스타트 레디믹스</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>My Block Mini Dry Bath</td><td>Benchmark</td><td>BSH200</td><td></td></tr><tr><td>D1000 시약</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067- 5583</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>022829861&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

rna 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA 서열 (RNAseq)는 유전자 발현 돌연변이 유전자 융합체, 및 비 암호화 RNA를 검출하고 특성화하는 데에 이용 될 수있는 다목적 방법이다. 1 억 순서 읽고 등의 mRNA 및 비 암호화 RNA를 여러 RNA 제품을 포함 할 수있다 - 표준 RNAseq (30)가 필요합니다. 우리는 타겟 RNAseq (캡처) 바탕 화면 시퀀서를 사용하여 선택 RNA 제품에 초점을 맞춘 연구를 허용하는 방법을 보여줍니다. RNAseq 캡처 그렇지 않으면 기존의 RNAseq 방법을 사용하여 놓칠 수있다, 주석이 달려 있지 않은 저, 또는 일시적으로 표현 된 성적 증명서를 특성화 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 세포 라인, 리보솜 RNA 고갈, cDNA 합성, 바코드 라이브러리, 바탕 화면 시퀀서에 하이브리드 및 목표 성적 증명서의 캡처 및 다중 서열의 준비에서 RNA의 추출을 설명합니다. 또한 품질 관리 평가, 정렬 검출 융합 유전자 발현의 정량화 및 단일 NUC의 식별을 포함하는 연산 파이프 라인을 분석, 개요leotide 변형. 이 분석은 유전자 발현, 유전자 융합, 돌연변이의 특성을 타겟팅 사체 서열을 허용한다.

RNAseq 캡처 개략적 강조 주요 단계가도 1에 도시되어있다. 공지 된 돌연변이와 함께 4 개의 암 세포주는 RNAseq 캡처 기술의 유효성을 증명 하였다 (K562 ABL1 융합, RET 융합과 LC2와, EOL1 PDGFRalpha 융합 및 RT-으로 4 FGFR3 융합과). 네 개의 샘플을 함께 모으고 100 혈압 FASTQ 파일을 생성하는 데스크탑 시퀀서에 판독 2 배속으로 서열화 하였다. 인간 사체 1) 품질 관리 평가 2) 정렬 3) 유전자 발현의 정량 분석​​, 4) 융합 호출 및 5) 변형 호출 : FASTQ 파일 다섯 가지 주요 구성 요소를 포함하는 RNAseq 분석 파이프 라인을 통해 실행 하였다. 정렬 파일 (BAM)은 단일 염기 변이를 호출 유전자 발현을 계산하는데 사용된다. 융합은 (자신의 정렬 수행) 등 TopHat 융합 등 융합 발신자를 사용하여 ...

유전자 발현, 돌연변이 및 유전자 융합에 대해 선택된 전사체를 조사하기 위한 데이터 분석을 사용한 색인화된 cDNA 라이브러리 준비, 혼성화 및 캡처를 포함하는 표적 RNA 염기서열분석 기반 방법을 설명합니다. Targeted RNAseq를 사용하면 데스크톱 염기서열분석기에서 선택된 전사체를 비용 효율적이고 신속하게 평가할 수 있습니다.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

이 분석의 전반적인 목표는 차세대 염기서열 분석을 위해 표적 전사체를 농축하는 것입니다. 이 표적 RNA 시퀀싱 분석은 총 RNA에서 리보솜 RNA를 제거하는 것으로 시작하여, 화학적 단편화 및 상보적 DNA 합성, 바코드 라이브러리 제작, 표적 전사체의 하이브리다이제이션 및 캡처, 멀티플렉싱 시퀀싱을 거쳐 데이터 분석으로 마무리되는 다단계 절차입니다. 본 영상에서는 4개 샘플에 대한 하이브리다이제이션, 표적 캡처 및 캡처 후 PCR 증폭 절차를 시연하겠습니다.따라서 이 방법은 유전자 융합, 단일 염기 변이, 상대적 유전자 발현 및 표적 전사체와 관련된 선택적 스플라이싱의 확인과 같이 분자생물학의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 있는 모든 유전자에 맞게 맞춤 설정이 가능하다는 점입니다. 하이브리드화 절차를 시작하려면 20 °C 냉동고에서 다음 항목들을 꺼내 얼음 위에서 해동하십시오: 맞춤형 하이드레이션 프로브, Cot-1 DNA, 범용 블로킹 올리고, 그리고 어댑터 특이적 블로킹 올리고.저결합 1.5 milliliter 튜브에 500 nanograms의 DNA 샘플, 5 microliters의 Cot-1 DNA, 1 microliter의 범용 블로킹 올리고(universal blocking oligos), 0.5 microliters의 6-뉴클레오타이드 어댑터 특이적 블로킹 올리고(six nucleotide adapter specific blocking oligos), 그리고 0.5 microliters의 8-뉴클레오타이드 어댑터 특이적 블로킹 올리고(eight nucleotide adapter specific blocking oligos)를 혼합합니다. 샘플 튜브의 캡을 열고 회전 방향의 반대쪽을 향하게 하여 진공 농축기에 넣습니다. 45 degrees Celsius에서 20분 동안, 또는 액체가 완전히 증발할 때까지 건조합니다.다음으로, 건조된 내용물을 8.5 µL의 2x 하이브리다이제이션 버퍼, 3.4 µL의 하이브리다이제이션 성분 A, 그리고 1.1 µL의 nuclease-free water로 재부유시킵니다. 2.5분마다 볼텍싱하며 10분 동안 재부유시킵니다. 재부유된 물질을 0.2 mL PCR 튜브로 옮기고 써멀 사이클러를 이용하여 95 °C에서 10분 동안 인큐베이션합니다.열 순환기에서 하이브리다이제이션 샘플 튜브를 꺼내고 1.5 pmol/µL 농도로 재

targeted-rna-sequencing-assay-to-characterize-gene-expression-genomic

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 바코드 DNA 라이브러리 및 대규모 병렬 "다음 세대"염기 서열 임상 종양 표본의 주요 암 관련 변이의 검출에 대한 후속 하이브리드 기반의 엑손 캡처의 준비에 대해 설명합니다. 대상 엑손 시퀀싱 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 산출, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다.

엑손 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 종양 검체에서 체세포 유전 변경을 검출

RNA 시퀀싱과 생물 정보학 분석은 마우스 EMLcells의 린-CD34 + 린-CD34- 부분 집단에서 유의 및 발현 된 전사 인자를 식별하는 데 사용되었다. 이들 전사 인자는 자기 갱신 린-CD34 +를 부분적으로 분화 된 린 - CD34- 세포 사이의 스위치를 결정하는데 중요한 역할을 할 수도있다.

RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

종양학 검체의 차세대 표적 염기서열분석을 위한 통합 시스템에 대해 설명합니다. 이 크로스 플랫폼 시스템은 저품질 및 소량 종양 생검에 최적화되어 있고, 낮은 DNA 입력을 수용하며, 잘 특성화된 다중 변이 대조군을 포함하고, 정량적 사전 분석 품질 관리 측정에 의해 정보를 얻은 새로운 변이 호출자를 특징으로 합니다.

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

여기에서 우리는 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열을 통해 부모와 체외에서 저항 모델의 transcriptomic 프로필을 분석 후보 유전자를 확인하기 위해 QRT-PCR 기반의 방법을 설립했다.

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

여기, 우리는 현장에서 교 잡 분석 결과 시퀀스를 단일 세포 수준에서 단일 뉴클레오티드 해상도 50 뉴클레오티드의 짧은의 과민 하 고 특정 검색을 가능 하 게 설명 합니다. 수동으로 또는 자동으로 수행할 수 있습니다, 분석 결과, 결합 이체, 짧은 시퀀스, 그리고 조직 컨텍스트 내에서 돌연변이의 시각화를 설정할 수 있습니다.

유전자 변형, 짧은 목표, 및 교 잡 시험 현장에서 RNA와 형태학 상 조직 맥락에서 점 돌연변이 시각화

miRNA 치료제 암 진행을 조절에 상당한 잠재력이 있다. 여기 설명 분석 접근 사용 된다 세포 주기 및 신생 중단 조합 미르 치료의 활동의 식별을 위해.

조합 미르 세포 주기 조절 및 신생 치료의 분석

여기에서, 저자들은 망막에서 전사체 및 크로마틴 접근성 프로파일을 특성화하는데 있어서 표현형 및 후속 쌍을 이룬 scRNA-seq 및 scATAC-seq 에 대한 MULTI-seq 의 유용성을 보여준다.

scRNA-Seq 및 scATAC-Seq 를 이용한 망막 유전자 발현 및 크로마틴 접근성의 다중화 분석

여기에서, 우리는 유전자 조작된 마우스 모델 유래 종양 에서 생체내에서 배아 치사되는 유전자 녹아웃을 수행하기 위한 프로토콜을 제시하고, 이어서 녹아웃이 종양 성장, 증식, 생존, 이동, 침윤 및 시험 관내 및 생체내에서 전사체에 미치는 영향을 평가한다.

악성 말초 신경 시스 종양 세포에서 Floxed 대립 유전자의 Ex vivo 절제에 의한 종양 발생에서 유전자 기능 정의

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

이 절차는 murine 골수에서 조혈 세포 기본 문화를 확립하고 진 Pulser MXCell의 electroporation 시스템을 사용 transfection하여 다음 방법을 설명합니다.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

학습하세요 표적 RNA 시퀀싱 방법을 통해 유전자 발현, 돌연변이 및 대안적 스플라이싱을 분석하는 기술을. 맞춤형 프로브를 활용한 하이브리드화 및 캡처 과정을 통해 비용 효율적인 고속 분석이 가능합니다.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

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