스트라이프 분석은 해리 해마 신경 세포를 사용하여 단백질 기판의 매력적인 또는 혐오감 활동을 연구하는

스트라이프 분석(stripe assay)의 전반적인 목적은 안내 분자와 같은 특정 단백질이 뉴런을 유인하거나 반발시키는 능력을 평가하는 것입니다. 이 방법은 뉴런이 외부 세포 환경에 반응하여 어떻게 이동하거나 축삭을 뻗는지와 같이, 축삭 안내 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 실험에서 다수의 뉴런을 시각화할 수 있으며, 많은 성장 원추(growth cones)를 동시에 분석할 수 있다는 점입니다.

준비 과정에서, 4~8개의 실리콘 매트릭스를 물에 넣고 5분 동안 끓입니다. 층류 후드 내에서 줄무늬 면이 위로 향하게 하여 완전히 자연 건조시키십시오. 이 과정은 약 1시간이 소요됩니다.

후드 내부에서 작업을 계속합니다. 압축 공기나 점착 테이프를 사용하여 매트릭스의 줄무늬가 있는 면에 묻은 먼지를 제거합니다. 그런 다음 각 매트릭스를 줄무늬 면이 아래로 향하게 하여 별도의 6cm 플라스틱 접시에 조심스럽게 배치합니다.

손가락 하나를 사용하여 각 매트릭스를 단단히 누릅니다. 매트릭스와 디쉬 사이에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 매트릭스가 부착되지 않은 경우, 이 과정을 반복하십시오.

부착이 완료되면 배양 접시 바닥면에 스트라이프 위치를 표시합니다. PBS에 형광 표지된 재조합 단백질을 준비합니다. 스트라이프가 표시된 접시당 25 µL씩 준비합니다.

혼합물을 상온에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 각 디쉬에 대해 희석된 단백질 25 µL를 22게이지 주입기에 채운 후 매트릭스 측면의 작은 구멍을 통해 주입합니다. 공기 방울이 매트릭스로 주입되면 단백질의 디쉬 결합을 방해할 수 있으므로 주의하십시오.

이제 세포 배양 인큐베이터에서 37°C로 30분 동안 디쉬를 배양합니다. 배양 후, 각 매트릭스의 상단 슬롯에 300 µL의 PBS를 넣습니다. 그런 다음, 결합되지 않은 재조합 단백질을 모두 제거하기 위해 각 매트릭스 측면에 위치한 작은 구멍을 통해 PBS를 흡입하여 제거합니다.

단백질이 건조될 수 있으므로 PBS를 완전히 흡입하지 마십시오. 이 PBS 세척 과정을 총 3회 수행합니다. 다음으로, 각 디쉬에서 매트릭스를 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 제어 단백질 약 100 µL를 줄무늬 영역 전체에 즉시 추가하여 각 디쉬에 교차 코팅을 형성합니다. 다음으로 디쉬를 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그동안 얼음 위에서 laminin과 PBS를 20 µg/mL 농도로 해동합니다.

30분 후, 디쉬를 PBS로 3회 세척합니다. 그다음 각 디쉬에 약 100 µL의 차가운 laminin을 코팅하고 디쉬를 다시 인큐베이터에 넣어 1시간 동안 둡니다. 1시간 후, 다시 PBS를 사용하여 디쉬를 3회 세척합니다.

세 번째 세척 후, 각 디시에 배양액 약 150 µL를 추가합니다. 그런 다음, 다음 단계에 필요할 때까지 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 디시를 배양합니다. 공여체 E15.5 마우스를 안락사시킨 후, 수술용 가위로 머리의 정중앙선을 따라 피부와 두개골을 시상면으로 절개하고 마이크로 스패튤라를 사용하여 뇌를 걷어냅니다.

뇌를 3 mL의 HBSS가 들어 있는 60 mL 페트리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 접시 내에서 메스를 사용하여 피질, 해마 및 선조체를 포함하는 대뇌 반구를 절제합니다. 그다음 뇌막을 조심스럽게 제거하여 해마 영역을 분리합니다.

절제한 해마 조직을 얼음 위에 둔 2 mL의 HBSS 용액이 들어 있는 15 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 8개의 디쉬에 뉴런을 배양하는 데는 배아 3개에서 얻은 6개의 해마로 충분합니다. 모든 해마 조직을 수집한 후, HBSS를 흡입하여 제거하고 2 mL의 trypsin-EDTA로 교체합니다.

그 다음 튜브를 37 °C 항온수조에서 15분 동안 배양합니다. 이어서 500 µL의 fetal bovine serum을 첨가하여 trypsin 활성을 중화시킵니다. 그런 다음 혼합물을 100 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 제거하고 펠렛(pellet)을 2 mL의 배양 배지로 세척합니다. 그다지 혼합물을 다시 원심 분리하고 배지를 새 배지로 교체합니다. 이제 팁 끝을 자른 1 mL 파이펫 팁을 사용하여 부드럽게 파이펫팅(trituration)함으로써 조직을 분리합니다.

파이펫 팁 끝으로 조직을 약 10회 정도 위아래로 옮기며 흘려줍니다. 그런 다음 자르지 않은 1 mL 팁을 사용하여 단일 세포 현탁액을 얻을 때까지 파이펫팅을 반복합니다. 이제 80~100 µm 메쉬 세포 스트레이너로 현탁액을 밀어내어 단일 세포를 분리합니다.

그 후 여과된 현탁액을 150 Gs에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 흡입하여 제거한 뒤 펠릿을 2 mL의 배양 배지에 다시 현탁합니다. 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정하고, 미리 준비된 스트라이프 플레이트 각각에 150 µL의 배양 배지에 포함된 10,000개의 신경세포를 분주합니다. 현탁액을 조심스럽게 떨어뜨려 스트라이프 영역 전체를 덮도록 합니다.

E15.5 생쥐의 해마에서 분리된 뉴런을 형광 표지된 대조 단백질 FC 스트라이프 위에 도말하여 24시간 동안 배양하거나, FLRT2 FC와 표지되지 않은 대조 FC 스트라이프가 교대로 배치된 곳에 도말하여 배양하였습니다. 두 경우 모두 뉴런은 응집되었으며 축삭을 다발 형태로 뻗어냈습니다. FC 대조군에서 뉴런은 고르게 분포되었으며 축삭을 무작위 방향으로 뻗어냈습니다. 이와 대조적으로, FLRT2 FC 스트라이프와 함께 배양했을 때 축삭은 FLRT2 FC 영역으로 자라는 것을 피하였습니다.

따라서 신장하는 축삭은 주로 FC 스트라이프 상에서 성장했습니다. 고배율 확대 영상에서는 축삭이 FLRT2 FC 스트라이프의 경계를 따라 성장하지만, FLRT2 영역 내부로는 확장되지 않는 것을 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 권장 단백질을 이용해 스트라이프 카펫을 제작하는 방법과 해리된 해마 뉴런을 사용하여 유인 또는 반발 활성을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.

숙달되면 이 기술은 적절하게 수행했을 때 5시간 이내에 완료할 수 있습니다.