Name: 개구리와 도롱뇽의 생활 난 모세포에서 거대한 Lampbrush 염색체의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 학습하세요 개구리와 도롱뇽 난모세포에서 거대한 Lampbrush 염색체를 분리하는 방법을. 면역염색 및 형광원위잡종을 위한 이 기술은 전사 활성과 염색체 구조 연구에 필수적입니다.

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이 간행물에 보고된 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립일반의학연구소(National Institute of General Medical Sciences)의 지원을 받았습니다(수상 번호 R01 GM33397). 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. J.G.G.는 미국 암 학회(American Cancer Society)의 발달 유전학 교수입니다.

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개구리와 도롱뇽의 손으로 고립 GVS에서 &quot;생활&quot;LBCs의 첫 번째 관찰은 형광 면역 염색 전에 FISH 전에 미국의 생물 학자 윌리엄 Duryee, 위상차 및 DIC 현미경의 도입 전에 (19)에 의해 거의 80 년 전에 만들어졌다. 실제와 방식으로이를 해결하기 위해, 그들의 기본 형태를 파괴하지 않고 분자 기술을 적용, 유리 슬라이드에 LBCs를 연결하는 기술의 개별 유전자 레벨에 필요한 개발에서 염색체 구조와 전사의 세부 사항을 조사하는 LBCs의 장점. 이러한 목표를 달성하기 위해 거의 모든 기술은 조사에서 종과 실물 보존 및 분자 특성 사이에 타협에 약간의 적응이 필요합니다. 예를 들어, GVS 및 꼬리 양서류 LBCs이 때문에 거대한 크기와 GV 내용을 적절한 매질에 분산되는 용이성과 작업 할 비정상적 쉽다. 유ntil 그러나 최근 약간 어려운 분자 세부 세포 학적 기능의 부의 상관 관계를 만들고, 자신의 게놈에 대한 알려져있다. 반대로, Xenopus의의 LBC...

대부분의 척추 동물은, 유대류와 태반 포유류의 주목할만한 예외로 큰 노른자위의 계란을 생산하고 있습니다. 그들의 때로는 거대한 크기에도 불구하고,이 계란은 여성의 난소에있는 동안 아직 최종 차원에 도달 한 세포이다. 난소 계란 난자라고 각각은 일반적으로 단순히 새싹 소포 또는 GV으로 초기 19 세기부터 알려진 하나의 거대한 핵을 포함하고 있습니다. 일반 실험실 개구리, Xenopus의의 laevis의 및 Xenopus의의 tropicalis의 1 난 모세포는 1.2 mm 및 0.8 mm 각각 (그림 1)의 최대 직경에 도달한다. 직경 0.4 mm (그림 2, 3) -이 두 개구리의 성숙한 난자에서 GVS는 0.3이다. 도롱뇽은 일반적으로 더 큰 난자와 GVS 있습니다. 멕시코 아 홀로 틀, Ambystoma mexicanum의 완전히 성숙 난자는 직경이 2mm 이상이며, GV는 약 0.5 mm이다. 따라서, 이러한 핵 육안 및 캔을 쉽게 볼 수 있습니다전형적인 체세포 핵으로 불가능한 다양한 방법으로 조작 될 수있다. 마찬가지로 현저한은 GV, 19 세기 말에 이미 인식 사실 내 염색체의 거대한 크기이다. Ambystoma 다른 도롱뇽의 개별 염색체의 길이는 최대 1mm (그림 4, 5)이 될 수 있습니다. 100 μm의 이상 최대 길이로, 그들은 대부분의 생물의 일반적인 체세포 염색체를 난쟁이하지만 Xenopus의의 사람들은 작은 상당한 있습니다. 한 쌍의 측면 루프 백 (그림 5) - 난자의 염색체의 중요한 특징은 자신의 가장 특징적인 형태 학적 특징 중 하나에 이르게 자신의 특별한 전사 활동이다. 각 루프는 적극적으로 RNA를 합성 하나 또는 몇 전사 단위로 구성되어 있습니다. 루프는 난자가 피상적 후 이름이 &quot;lampbrush&quot;염색체에지도 퍼지 모양을 염색체 제공등유 램프 굴뚝을 청소하기 이전 시대에 사용 된 브러쉬에 유사. 이 이 논문의 초점은 LBCs 핵 세포 소기관 (핵소체, 히스톤 궤적 기관 및 얼룩을) 연구 고립 GVS의 사용에 있습니다. 두 아니라 다른 기술을 설명한다. 첫번째, 일반적인 기술에서, GVS 간단히 부착 난황을 제거하는 세정 보석의 집게를 이용하여 식염수에서 격리하고, 핵막은 보석의 집게 다시 제거된다. LBCs 핵 세포 소기관을 포함하는 젤라틴 내용은 유리 현미경 슬라이드 나 커버 슬립 상에 침강한다. 이러한 제제는 위상차 또는 DIC 현미경으로 직접 관찰 할 수있다. 또한, 준비는 슬라이드 또는 커버 슬립에 LBCs와 세포 기관을 연결하는 원심 분리 될 수있다. 이러한 준비 후, 주로 면역 및 fluorescen하여 핵산 및 단백질 분자의 상세한 분석을 위해 처리 될 수있다현장 하이브리드 (FISH)에서 t. 3-7 두 번째 기술은 광유에서 GV의 분리를 포함한다. 8 오일 절연 GVS는 많은 시간 동안 전사적으로 활성 상태로 유지 한 핵 내용이 가능한 한 실물되고 싶어 연구를위한 잠재적으로 유용하다. 핵 &quot;SAP&quot;의 굴절률이 LBCs 및 기타 핵 세포 소기관 (그림 3)에 가까운이기 때문에 9, 10는, 현미경 기술은 석유 고립 GVS와 도전이 될 수 있습니다. 마지막으로, 그들의 크기와 조작의 용이성, GVS는 핵 봉투에 대한 연구에 이상적인 재료입니다. 핵 기공 단지는 최초의 수륙 양용 GV 봉투 (11)과 최근 수퍼 해상력의 관찰 전자 현미경 연구에서 설명 된 것과 동일한 재료를 사용하고 있습니다. 12, 13

<table><tbody><tr><td>파라포름알데히드 (시약 등급, 결정성)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>많은 프로토콜에서의 경고에도 불구하고, 집중된 용액은 RT</td></tr><tr><td>에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이</td>트에서 무기한으로 저장될 수 있습니다. <td>시그마-알드리치</td><td>A5040-100G</td><td>때때로 MS-222</td></tr><tr><td>Ethicon RB-1 1/2 원형 테이퍼 포인트 3-0 봉합사</td><td>VWR&nbsp;</td><td>95057-000</td><td></td></tr><tr><td>파라플라스트(파라핀 왁스)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3558-1KG</td><td></td></tr><<tr><td>em>p-페닐렌디아민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>젤라</td>틴 <td>식료품점</td><td></td><td>상업용 녹스 젤라틴 작동 미세</td></tr><tr><td>ProLong Gold 퇴색 방지 마운트제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>골드 씰 커버 유리&nbsp; 22 x 22 mm #1 1/2 (두께 0.16 - 0.19 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63786-01</td><td>이 커버슬립은 초해상도 현미경 검사에 권장되는 두께입니다</td></tr>. <tr><td>Dumont 펜치 #5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72700-D</td><td></td></tr><tr><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx 파라핀 오일 (빛)&nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>PX0047-1</td><td>오일</td></tr><tr><td>접착제 in sitetu PCR 및 혼성화 챔버(25 &micro; L)</td><td>BioRad</td><td>Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers</td></tr><tr><td>Silicone Isolators</td><td>Grace-Biolabs</td><td>카탈로그 링크에서 선택</td><td></td></tr><tr><td>http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html Coplin jars 및 염색 접시</td><td>전자 현미경 과학</td><td>카탈로그 링크</td><td>에서 선택http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx</td></tr></tbody></table>

개구리와 도롱뇽의 생활 난 모세포에서 거대한 lampbrush 염색체의 분리

Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

우리는 개구리와 도롱뇽의 난자 또는 unlaid 계란에서 발견 된 거대한 전사적으로 활성 lampbrush 염색체 (LBCs)를 공부하는 방법을 설명합니다. 개인 LBCs의 최대 길이는 1mm 될 수 있으며 직경 0.5 mm로, 거대한 핵 자체를 상주합니다. 염색체의 크기가 커서 빛의 광학 현미경으로 활성 유전자 비할 관측을 허용하지만, 동시에 특별한 기술은 핵을 단리 핵막을 제거하고, 현미경 슬라이드 상 염색체 확산 필요하다. 또한 새싹 소포 (GV)라는 난자의 핵은 핵 굴지의 부분 겔을 허용하고 LBCs의 섬세한 구조를 보존하는 매체에 격리됩니다. 이 단계는 보석의 겸자를 사용하여 해부 현미경을 수동으로 수행된다. 다음으로, 핵 봉투는 보석의 집게 다시 수동으로 제거됩니다. 핵 내용은 신속하게 분산 외장 물감 매체로 전송굴지 젤 노변 장치 및 손상되지 않은 LBCs는 현미경 슬라이드에 정착 할 수 있습니다. 미세한 세부 사항은 브라운 운동에 의해 가려하고 있지만이 시점에서 LBCs 및 기타 핵 세포 소기관은, 위상차 또는 미분 간섭 대비 현미경으로 볼 수 있습니다. 고해상도 현미경 관찰 또는 분자 분석을 위해, 전체 제조는 슬라이드에 단단히 섬세한 LBCs를 연결하는 원심 분리된다. 파라 포름 알데히드에 대한 간단한 고정 후 면역 염색으로 또는 현장 하이브리드에 따른다. LBCs는 전사적으로 활성 상태에있는 자신의 거대한 크기는 촛점 또는 초해 현미경을 사용하여 개별 유전자 수준의 분자량 분석을 허용한다.

거대한 lampbrush 염색체를 검사하려면 하나는 개구리 나 도롱뇽에서 난 모세포를 분리하는 것으로 시작한다. 도 1은 개구리 제노의 난소 제거 후 완충 식염수 성숙한 난자들의 그룹을 나타낸다. 이러한 난자는 실온에서 일하기 좋은 상태로 남아 있습니다. 핵 (또는 새싹 소포는) 다음 중 하나 식염수 (그림 2) 또는 기름에, 보석상의 집게와 난자에서 (그림 3)을 제거한다. 오일 고립 된 핵의 핵 내용은 부드럽게 핵을 부수 및 위상 대비 또는 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경으로 관찰하여 조사 할 수있다. 식염수에서 격리 된 핵의 내용을 검사하기 위해, 하나는 제 보석의 집게 핵막을 제거하고 내용물을 현미경 슬라이드 상에 정착 할 수 있도록한다. 제조는 다음 t를 연결하는 원심 분리그는 염색체가 항체 (그림 4)로 염색 또는 <em...

우리는 개구리와 도롱뇽의 난자 생활에서 거대한 전사적으로 활성 lampbrush 염색체 분리에 대한 간단한 기술을 제시한다. 우리는 위상차 또는 미분 간섭 대비하는 방법과 현장 하이브리드 또는 면역 염색에서 형광을 위해 그들을 해결하는 방법에 의해 &quot;살아&quot;이러한 염색체를 관찰하는 방법에 대해 설명합니다.

개구리와 도롱뇽의 생활 난 모세포에서 거대한 Lampbrush 염색체의 분리

We describe methods for studying the giant transcriptionally active lampbrush chromosomes (LBCs) found in the oocyte, or unlaid egg, of frogs and ...

이 절차의 전반적인 목표는 양서류 난모세포에서 거대 핵 또는 생식낭(germinal vesicle)을 분리하고, 램브러시 염색체와 기타 핵 소기관들을 현미경 슬라이드 위에 펼쳐 면역염색, in situ 하이브리드화 및 기타 분자 생물학적 기법을 적용하는 것입니다. 이 방법은 염색체, 인, 기타 핵 소기관의 기본 구조뿐만 아니라 전사, 스플라이싱 및 RNA 수출의 분자적 세부 사항에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주된 장점은 면역형광법, in situ 하이브리드화 및 기타 분자 기법을 사용하여 일반적인 광학 현미경으로 염색체 구조와 전사를 쉽게 관찰할 수 있다는 점입니다.시연은 본 연구실의 박사후 연구원인 Dr. Zehra Nizami가 진행하겠습니다. 텍스트 프로토콜에서 설명한 대로, 파라핀으로 플라스틱 웰을 부착한 서브드(subbed) 유리 슬라이드로 구성된 웰 슬라이드를 준비하고 필요한 모든 용액을 조제합니다. 그런 다음, 성체 암컷 개구리나 도롱뇽에서 미리 채취한 난소 조직을 준비하고, 작은 페트리 접시에 난모세포 배양 배지를 채웁니다.분리된 조직 중 약 10~20개의 난모세포가 포함된 일부를 이 플레이트에 넣습니다. 다음으로, 단일 난모세포를 확인하고 두 쌍의 정밀 핀셋을 사용하여 난모세포와 난소 벽을 연결하는 줄기 부분을 절단합니다. 난모세포가 분리되면, 이를 생식포(germinal vesicle, GV) 분리 배지가 들어 있는 새 페트리 접시로 옮깁니다.저배율에서 어두운 색상으로 식별 가능한 난모세포의 동물극을 찾습니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 동물극 근처에 큰 구멍을 내고, GV라고도 불리는 투명한 난모세포 핵을 부드럽게 짜냅니다. 그 후, 함께 배출된 난황으로부터 GV를 굴려 분리합니다. 단단하게 붙어 있는 난황을 제거하려면, GV보다 약간 큰 직경의 팁이 달린 피펫으로 핵을 넣었다 뺐다 반복합니다. 개구리 GV를 수집한 후에는 이후 단계에 방해가 될 수 있는 핵의 경화를 방지하기 위해 즉시 분산 배지로 옮깁니다.다음으로, 두 쌍의 핀셋을 사용하여 GV 상단 근처의 핵막을 잡되, 아래로 누르지 않도록 주의합니다. 핵막을 잡은 상태에서 두 핀셋을 서로 반대 방향으로 당기면 핵 내부 물질이 밖으로 밀려 나옵니다. 이 물질을 수집하기 위해, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 팁 끝을 자른 조절 가능한 20 µL 피펫을 먼저 준비합니다.그 다음, 디쉬에서 분산액 5 µ

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