사용 환경 샘플에서 새로운 Faustoviruses의 분리에 대한 신속한 전략

이 새로운 분리 전략의 전반적인 목표는 새로운 바이러스 분리주의 수를 확대하여 이 새로운 바이러스 과의 범유전체(pan-genome)를 연구하고, 이들의 생태계와 인간에 대한 잠재적 병원성을 더 잘 이해하는 것입니다. 이 방법은 바이러스학 분야의 핵심 질문들에 답함으로써, 거대 바이러스 및 특히 Faustovirus 탐사에 관심이 있는 전 세계 바이러스학자들에게 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 항생제 및 항진균제 혼합물, 아메바에 맞게 조정된 새로운 기아 배지, 그리고 더 빠르고 민감한 용해 검출을 위한 유세포 분석법의 사용과 같이 여러 단계에서 새로운 개선 사항을 보여준다는 점입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 오염된 물 샘플을 수집한 후, 30 mL의 protease peptone yeast extract glucose(PYG 배지)가 담긴 75 cm² 세포 배양 플라스크에 아메바를 추가하여 숙주 세포인 V. vermiformis를 준비하고 28 °C에서 48시간 동안 배양합니다. 계수 슬라이드를 사용하여 아메바 수를 측정하고, 농도가 5 × 10⁵ ~ 10⁶ cells/mL에 도달하면 720 ×g에서 10분 동안 원심 분리하여 세포를 회수합니다.

상층액을 흡입하여 제거하고, 30 milliliters의 멸균된 Page's amoebal saline 또는 PAS를 사용하여 아메바 펠릿을 재현탁합니다. 펠릿을 두 번째로 세척한 후, 항생제와 항진균제가 포함된 30 milliliters의 기아 배지(starvation medium)를 사용하여 세포를 milliliters당 약 10⁶마리의 아메바로 재현탁합니다. 기아 배지는 아메바가 포낭 형성이나 증식 없이 생존할 수 있도록 합니다.

다음으로, 96-well flat bottom plate의 웰에 200 µL의 아메바를 분주하고 30 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음, 실온에서 물 샘플을 1분 동안 vortexing한 후, 각 샘플 25 µL를 아메바 세포에 접종하며, 두 개의 웰은 샘플을 넣지 않고 음성 대조군으로 둡니다. 증발을 방지하기 위해 1차 배양액이 담긴 플레이트를 젖은 압축 솜과 함께 봉투에 넣고, 플레이트가 들어 있는 가습 챔버를 30 °C 인큐베이터에 넣습니다.

첫 번째 접종 3일 후, 현미경 관찰 없이 방금 시연한 방법대로 1차 배양 플레이트를 아메바가 들어 있는 새로운 96-웰 플레이트에 계대 배양합니다. 30°C에서 3일 동안 배양합니다. 그다음, 이 계대 배양물을 사용하여 앞서 설명한 방식대로 세 번째 플레이트에 접종하고 2일 동안 배양합니다.

최종 공동 배양 플레이트에서 용해(lysis)를 검출하려면, 사이토미터를 켜고 제조사의 프로토콜에 따라 세척 및 린스(clean and rinse)를 수행하여 배경 노이즈를 줄입니다. 40분 동안의 완전 자동 수집을 수행하려면, 제조사 프로토콜에 따라 96-웰 플레이트에서 샘플을 자동으로 로드할 수 있도록 고속 샘플러(high throughput sampler) 또는 HTS를 실행합니다. HTS 설정을 여기에 나열된 대로 프로그래밍하는데, 여기에는 샘플 부피 150 µL, 혼합 부피 50 µL, 혼합 속도 180, 혼합 횟수 5회, 샘플 간 세척 부피 400 µL, 유속 2.5 µL/s, 기록 이벤트 수 10,000개가 포함됩니다. Home을 클릭하여 HTS가 플레이트의 위치를 파악하도록 합니다. 그다음, 아메바 군집을 게이팅(gate)하고 물리적 특성에 따른 세포 백분율을 결정하기 위해 숙주 아메바 세포가 포함된 음성 대조군 웰을 먼저 평가합니다. 이때 균질한 아메바 군집과 데브리 및 노이즈에 해당하는 더 적은 이벤트 수의 두 번째 군집이 나타나는지 확인하십시오. 이어서 acquire sample을 클릭하여 게이팅을 시작합니다.

그다음, 게이트를 정의하는 화살표를 사용하여 관심 있는 아메바 집단을 국소화합니다. 최소 10,000개의 이벤트를 게이팅한 후, run을 클릭하여 HTS가 전체 플레이트를 자동으로 실행하도록 합니다. 전방 산란(forward scatter) 크기 파라미터와 측방 산란(side scatter) 구조 파라미터에 따라 데이터 획득 및 분석을 수행합니다. 자세한 내용은 본문을 참조하십시오.

유세포 분석기로 용해 여부를 확인한 후, 용해된 공동 배양물을 피펫팅하여 남은 아메바를 현탁시킵니다. 각 샘플 50 µL를 슬라이드 위에 피펫팅한 후, 현탁액을 800 ×g에서 10분 동안 직접 세포원심분리(cytocentrifuge)합니다.

다음으로, 순수 메탄올을 사용하여 슬라이드를 고정한 후 상온에서 건조시킵니다. 고정 후, 슬라이드를 ESN 용액에 4초씩 세 번 담갔다가 뺀 다음, blue-azur에 6초 동안 담급니다. 마지막으로, 슬라이드를 PBS에 45초 동안 담급니다.

관찰 단계로 넘어가기 전에 슬라이드를 실온에서 건조하십시오. 새로 고정된 슬라이드를 DAPI로 염색하려면, 건조된 슬라이드에 DAPI 15 µL를 피펫으로 분주하십시오. 광학 현미경을 사용하여 1000배 배율로 슬라이드를 관찰하여 바이러스 공장(virus factories)의 존재 여부를 확인하십시오.

전자현미경 관찰을 위해, 글로우 방전(glow-discharge) 처리된 그리드 위에 양성 시료 5 µL를 점적하고 실온에서 약 20분 동안 배양합니다. 그리드를 조심스럽게 건조시킨 후, 1% 몰리브덴산 암모늄을 소량 첨가하고 10초 동안 배양합니다. 액적을 조심스럽게 제거한 후, 그리드를 5분 동안 건조시킵니다. 다음으로, 전자현미경을 200 keV로 설정합니다. 그 후 그리드를 홀더에 거치하고 홀더를 현미경 내부로 삽입합니다. 진공 개요 아이콘을 클릭하여 진공 상태를 확인합니다. 이어서 밸브를 닫고, 관찰을 시작하기 전에 스폿 크기(spot size)를 5로, 배율을 25,000배로 설정합니다. 획득 화면에서 거대 바이러스를 찾은 후, 측정 도구를 사용하여 바이러스의 크기를 측정합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 분자 생물학 및 바이러스 게놈 시퀀싱을 수행하십시오.

이 그림은 신뢰할 수 있는 음성 대조군과 비교한 두 종류의 Faustovirus 검출 결과를 보여줍니다. 용해 음성 대조군은 86%의 아메바 집단을 포함하고 있었습니다. 이와 대조적으로, 양성 샘플에서는 가장 높은 잔해 비율과 함께 아메바의 60% 이상이 용해되었습니다.

여기서 볼 수 있듯이, ESN 및 blue-azur 염색은 감염되지 않은 아메바 세포와 감염된 아메바 세포의 핵, 그리고 감염된 세포 내부의 바이러스 팩토리(virus factories)의 존재를 염색합니다. DAPI 염색 또한 아메바 내부에 바이러스 팩토리가 존재함을 확인시켜 줍니다. 이 이미지들에서 전자현미경 관찰 결과, 섬유질이 없는 정이십면체 캡시드로 구성되어 있으며 크기가 200 nanometers인 메가바이러스(mega-virus)의 전형적인 외형을 가진 Faustovirus의 존재가 드러납니다.

숙련된 후 공동 배양을 거치면, 적절히 수행했을 때 이 용해 검출 및 바이러스 특성 분석 기술은 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 아메바의 생존력을 제어하고 가능한 오염 여부를 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 거대 바이러스를 표적으로 하는 분자 생물학적 방법 등의 다른 분석을 수행하여 바이러스 과 또는 유전형과 같은 추가적인 의문점을 해결할 수 있습니다.

이 기술의 개발 이후, 바이러스학 분야의 연구자들은 해당 바이러스 과와 그들의 특정 숙주, 그리고 잠재적인 병원성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청한 후, 샘플의 수와 종류를 확대하고 최적의 숙주 세포 및 배양 조건을 선택함으로써 거대 바이러스를 쉽게 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 하수 샘플의 경우 특히 위험할 수 있으므로, 인간에게 잠재적으로 병원성인 바이러스를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.

따라서 본 절차를 수행할 때는 항상 보안 조건이 갖춰진 SB2 실험실에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.