Name: Anastasis에서 Vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서에 의해 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 20 min 16 s
Description: 배우세요 CaspaseTracker 바이오센서를 이용하여 Drosophila melanogaster에서 아나스타시스를 감지하고 추적하는 방법을. 이 기술은 살아있는 동물에서 세포 사멸 역전을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 초파리 이미지 그림 3C와 비디오 원고;에 감사 대런 Obbard J. 마리 하드 윅, 웨이드 깁슨, 그리고 가치에 대 한 내용은이 원고 헤더 M. 양고기. 이 작품으로는 선생님 에드워드 Youde 기념 친교 (H.L.T.), 박사 월터 Szeto 기념 장학금 (H.L.T.) 지원 되었다 풀브라이트 생명 과학 연구 재단 친교 (H.L.T.), 및 NCI K22 부여 CA204458 (H.L.T.) 007-2009 (H.L.T.), 부여 합니다. 호 람 탕 Shurl 및 생명 과학 연구 재단 (2014-2017)의 케이 Curci 재단 연구원 이었다.

CaspaseTracker 바이오 센서의 1) 준비
<ol><li>CO2, 파리 anesthetize를 사용 하는 붓 비행 음식과 신선한 효 모 반죽과 같은 유리병에 7 ~ 10 caspase 민감한 Gal4 (DQVD)19 처녀 암컷과 7 10 G-추적53 Gal4 기자 젊은 남성 파리 (또는 반대로) 전송. 참고: 크로스 (DQVD)에 민감한 Caspase Gal4 및 G-추적 파리의 CaspaseTracker 자손 파리를 생산할 예정 이다. Caspase-에민감한 (DQVA)19 Gal4 크로스 고 G-추적 파리 부정적인 제어 파리 (내용 참조)을 제공 합니다. 신선한 효 모 반죽 그래서 그 자손의 수를 증가 계란 생산을 향상 시키기 위해 단백질 소스 역할을 합니다. 처녀 여성 및 젊은 남성 파리 그들의 고기54에 따라 선택 합니다.</li>
	<li>3 ~ 7 일, 십자가 동안 섭씨 18도 (oC)에서 파리를 품 어 그리고 파리 18 ° c.에 새로운 십자가를 설정 하는 새로운 유리병에 전송 계속 때까지 자손 파리 eclose 18 ° C에서 원래 유리병을 품 어. 참고: 원래 유리병에 자손의과 밀을 피하기 위해 새로운 튜브에 부모 파리를 전송. 부모 파리 신선한 음식과 처음 2-3 스위치에 효 모 반죽으로 자손을 생산할 수 있는 그리고 생산성 크게 줄어 시간. 파리를 높이 18 ° C CaspaseTracker 바이오 센서의 일반적인 신호를 줄일 수 있습니다 (내용 참조).</li>
	<li>선택 자손 다음 실험에 대 한 올바른 고기54 파리. 참고: 여기 caspase 민감한 Gal4 및 G-추적 transgenes CyO 분산 균형 두 번째 염색체에 있습니다. Caspase Gal4 민감하고 G-추적의 두 transgenes는 (CyO) 없이 비 곱슬 날개 자손을 선택 합니다.</li>
</ol>CaspaseTracker 바이오 센서 파리에 과도 세포 죽음 유도의 응용 프로그램 2)
<ol><li>10 ~ 20 새로 eclosed 여성 oogenesis 여 계란 약 실 생산을 허용 하도록 18 ° C에서 1 일 신선한 비행 음식과 신선한 효 모 반죽과 새로운 유리병에 파리를 전송 합니다. 참고: 남성 파리 여성을 유지 계란 약 실 생산 향상 시킬 수 있습니다.</li>
	<li>차가운 충격, 전송에 의해 apoptosis를 받 다 계란 챔버를 유도 하기 위해 여성 1 h-7 ° C에 배치 됩니다 새 빈 유리병 날아갑니다. 참고: 차가운 충격 유도 플라즈마 막 파열55,56세포 손상.</li>
	<li>유도 단백질 기아에 의해 apoptosis를 받 다 계란 챔버, 전송 여성 파리 18 ° C에서 8% 자당 및 1% 한 천은 식품과 새로운 유리병에 3 일. 참고: 단백질 기아 (비 단백질 음식) 계란 챔버 apoptosis57,,5859 와 autophagy60,61을 트리거할 수 있습니다. 스위치 이동 8% 자당 및 1% 한 천은 식품 새로운 유리병에 매일 비행 음식을 자당의 최적의 상태를 유지 합니다.</li>
	<li>스트레스 파리를 복구할 수 있도록 18 ° C에서 3 일 동안 신선한 비행 음식과 신선한 효 모 반죽과 새로운 유리병 다시 전송. 굶 어과 설명된62으로 난소에서 계란 챔버를 굶 어-복구 파리를 해 부. 참고: 난소를 초파리 해 부, anesthetize CO2, 파리 하 고 2 쌍이 집게를 사용 하 여 비행 머리를 제거 하는 집게는 파리의 난소를 제거 하는 복 부의 기지를 사용 하 여.</li>
</ol>3) 고정 및 이미징에 대 한 해 부 계란 챔버의 얼룩
<ol><li>1 mL 원심 분리기 튜브를 0.5 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 주위와 함께 해 부 계란 챔버를 전송 합니다. 진정 알 수 있습니다. 참고: 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 물 또는 끝의 플라스틱 표면에 붙어 계란 챔버를 방지 하기 위해 PBS에 용 해 된 플라스틱 피 펫 팁 코트. 빨간 형광 성 단백질 (RFP, 일컬어 DsRed)의 photobleaching을 피하기 위해 어둠 속에서 다음 절차를 수행 및 계란 약 실에서 녹색 형광 단백질 (GFP).</li>
	<li>Pipetting, PBS를 제거 한 다음 0.5 mL 4 %paraformaldehyde 실내 온도 20 ~ 30 분 동안 어둠에 계란 챔버를 해결 하기 위해 PBS에 적용. 참고: 이에 다음 인큐베이션 단계 부드러운 회전을 적용 합니다.</li>
	<li>Pipetting, 여는 paraformaldehyde를 제거 하 고 다음 씻어 0.5 mL PBST와 계란 챔버 (PBS + 0.1% 트라이 톤 X-100) 3 번. 참고: 장시간된 고정 RFP 및 GFP 신호를 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>실 온에서 1 ~ 2 h에 대 한 PBST와 계란 챔버를 품 어 또는 달걀 챔버를 permeabilize 부드러운 회전으로 4 ° C에서 하룻밤. 참고: PBST 비 BSA 코팅된 플라스틱 표면에 붙어 계란 챔버를 방지할 수도 있습니다.</li>
	<li>Pipetting, 여는 PBST를 제거 하 고 0.5 mL PBST에 블루 핵 Hoechst 염료의 10 μ g/mL의 핵에 대 한 얼룩을 실 온에서 1 ~ 2 h에 대 한 계란 챔버에 적용. NOTE1: 이것은 일반적인 신호 증가 핵 염료와 장기간된 부 화를 하지 마십시오. NOTE2: 핵 없이 Hoechst 얼룩을 대체 접근 200를 추가 하는 μ 안티 표백 장착 에이전트 DAPI (자료 참조)와 하룻밤63, 프로토콜 3.8에 설명 된 대로 조직 유리 커버 슬립에 장착 하기 전에 품 어. NOTE3: photobleaching을 피하기 위해 어둠에는 얼룩 및 다음 절차를 수행.</li>
	<li>Pipetting, 여 핵 염료를 제거 하 고 0.5 mL PBST 3 번, 10 ~ 20 분 부 화 각 세척 단계 사이 부드러운 회전으로 1 mL 원심 분리기 튜브에 계란 약 실을 씻어을 적용 합니다.</li>
	<li>미세 피 펫과 모든 PBST를 제거 하 고 다음 적용 200 μ 안티 표백 장착 에이전트 (참조 자료) 계란 챔버 튜브의 바닥에 침 몰 될 때까지 또는 하룻밤 4 ° C에서 3 시간 실내 온도에 계란 챔버를 품 어를. 참고: 장착 에이전트 흡수 완전히 조직 관의 바닥에 싱크.</li>
	<li>안티 표백 하는 200 μ와 그들을 전송 하 여 스테인드 계란 챔버 탑재 20 x 20 m m 미리 청소 유리 커버 슬립와 계란 실 커버 하 고 인감 넣어 유리 슬라이드에 커버 슬립, pipetting으로 이미징 미리 청소 유리 슬라이드에 에이전트를 설치 커버 슬립의 가장자리에 매니큐어. NOTE1: 전 유리 슬라이드와 커버 슬립 물 또는 70% 에탄올으로 청소. NOTE2: 바 셀 린 유리 슬라이드와 커버 슬립 overcompression에 의해 계란 챔버를 파괴 하지 않으려면 사이 적용 합니다.</li>
	<li>형광 또는 confocal 현미경, 20 배, 나 0.8 사용 하 여 사용 하 여 계란 약 실 이미지 핵 얼룩에 대 한 흥분 빛 파장 405 nm와 계획 Apochromat 목표 (감지 방출 ~ 461 nm), 561 RFP (지속적인 또는 최근 caspase 활동) 신호 (nm 검색 방출 ~ 590 nm), 및 488 nm (caspase 활동) 과거 GFP 신호 (방출 감지 ~ 518nm). 참고: 현미경20,64에 대 한 우리의 게시 프로토콜을 참조 하십시오.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

CaspaseTracker 듀얼 바이오 센서 시스템은 소설과 최근의 탐지를 허용 하는 독특한 도구 또는 지속적인 caspase 활동, 세포 죽음을 반대 해야 하는 셀을 추적 하 고 프로세스 caspase 활동에서 vivo에서발생 후 생존. Caspase 활동 apoptosis의 특징으로 전통적으로 생각 되었습니다, 하는 동안 성장 연구 공개 비 apoptotic caspase 활동 신경 활동79, 의 규칙 등의 다양 한 정상적인 세포 기능에 잠재적인 역할을 합니다. 80, 학습 및 메모리81,,8283,84, necropto...

프로그램 된 세포 죽음, apoptosis 등, 다세포 생물1,2,3, 부상, 원치 않는 또는 위험한 셀을 제거 하 여 배아 개발 및 정상적인 항상성에서 중요 한 역할. 생존 세포의 죽음 사이의 균형의 손실 암, 심장 마비, 면역, 등 변성4,5,6,,78치명적인 결과가 발생할 수 있습니다. Caspases는 전통적으로 "돌아올 수 없는 지점" apoptosis9,,1011, 그것으로 간주 되어 사형 집행의 활성화 트리거 신속 하 고 대규모 세포 파괴12, 13,14,,1516. 우리는 교양된 죽어가는 기본 세포와 암 세포는 원형질 막 blebbing, 셀 수축를 포함 하 여 죽음 특징 caspase 활성화, 하지만 또한 다음과 같은 중요 한 세포 뿐만 아니라 복구할 수 있습니다 입증이 일반적인 정설에 도전, 미토 콘 드 리아 조각화, cytosol, 핵 chromatin 응축이, DNA 손상, 핵 분열에 미토 콘 드리 아 시 토 크롬 c 의 릴리스 세포 phosphatidylserine (PS)의 표면 노출 및 apoptotic 시체의 형성 17 , 18 , 19 , 20 , 21. 우리 제안 그 anastasis은 기본 셀 복구 현상으로 죽어가는 세포 세포 죽음 자극17,,1819,20, 의 제거 후 복구할 수 있습니다 21. 우리가 만들어낸 용어 "Anastasis" (Αναστάσης)18, 의미 "상승 생활" 그리스어,에이 예기치 않은 셀 복구 현상 설명. Anastasis의 우리의 관찰은 추가 phosphatidylserine 외부화22,23,24, 미토 콘 드 리아 제한 후 세포의 복구를 또한 공개 최근 독립적인 학문에 의해 지원 되는 외부 멤브레인 permeabilization25, 혼합된 계보 니 같은의 활성화 (MLKL), 그리고 세포 수축26.
Anastasis 규제 메커니즘을 특성화 하는 것은 패러다임 변화 생리, 병리학, 그리고 치료 의미 있을 것 이다. Anastasis 구출 또는 왼쪽 심 실 심 실 역 중요 한 postmitotic 세포와 대체, 하기 어려운 조직 및 가능 하 게 심장 마비 반전에 대 한 계정 보존 이전에 알려지지 않은 cytoprotective 메커니즘을 나타내는 수 있습니다. 뇌 부상32후 장치 (LVADs)27,28, 과도 한 빛29,,3031, 과도 노출 또는 뉴런의 수리 후 포토 리셉터 세포의 복구를 지원 합니다. Anastasis 홍보 세포 및 조직 복구를 향상 시킬 수 있도록 하는 경우. 반대로, anastasis 생존 세포 죽음을 유도 하는 치료, 암 재발17,18을 일으키는 암 세포에 의해 사용 되는 예기치 않은 탈출 전술 수 있습니다. 따라서, 억제 anastasis 동안 암 세포 죽어 그리고 암 치료 그들의 재발을 방지 하 여 암을 치료 하는 새로운 치료 전략 수 있습니다.
Anastasis의 과정에서 우리는 일부 복구 된 셀 영구 유전 변경 취득 종양 전이 겪었다, apoptosis18,20,21 동안 DNA 손상으로 인해 발생 한 발견 . DNA 손상 된 세포의 죽음 과정 반전 수 tumorigenesis의 메커니즘, 식도에 만성 열 상해 유도 같은 조직, 다양 한 암 위험 증가 잠재적으로 조직 상해를 반복 관찰을 기본 차적인 암 치료38, 후 매우 뜨거운 음료33,,3435, 알코올 중독36,37인 한 간 손상, 종양 진화의 소비에 의해 3940,,및 새로운 암 항 암 치료41,42,,4344 의 주기 사이 간격 동안 발생 하는 정상 조직에서의 개발 . True 이면 방지 수 anastasis 타겟팅 또는 암 개발 및 진행을 체포. 우리는 죽어가는 세균 세포 기아 유도 다시 먹이 초파리19anastasis 수술을 발견 했다.  Anastasis 생식 세포 DNA 손상에서 발생 하면, 그것은 유전 질병의 개발을 촉진 하는 환경 스트레스를 장기간 관찰에 대 한 계정 수 있습니다. 예를 들어 기근 transgenerational 상속 질병 당뇨병, 관상 심장 질환45등의 개발에 기여 한다. 따라서, 이해 anastasis 전략 개발이 잠재적인 메커니즘으로 인 한 상속 질병의 예방에 대 한 발생할 수 있습니다.
Anastasis의 발견을 활용 하 고 혁신적인 치료법 개발을 직접, 원인 anastasis 살아있는 동물에서의 결과 공부 하 고 필수적 이다. 그러나, 그것은 기술적으로 확인 하 고 anastatic 셀에 추적 vivo에서, 세포 죽음 과정에서 발견 된 셀 표시 정상적인 건강 한 세포 형태학 상으로 구별할 고 아무 biomarker anastasis의 도전 확인 아직17,,1821. 이러한 문제를 해결 하려면 우리는 새로운 비보에 caspase 바이오 센서를 식별 하 여46, caspase의 활성화19,후 apoptosis를 생존 하는 셀 추적 "CaspaseTracker"19, 지정을 최근 개발 된 apoptosis10,14각 인이 고 "실시간" caspase 바이오 센서 등 배설물12,47, Apoliner48, 캘리포니아-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 iCasper52에서 구별 는 온가 caspase 활동 감지, CaspaseTracker 바이오 센서 또한 기능을 영구적으로 셀 익스프레스 caspase 활동 정도 능력. 따라서, CaspaseTracker 바이오 센서는 caspase 중재의 세포 죽음 과정 비보후 anastasis의 장기 추적을 하면 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>CONSUMABLES AND REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 마운팅 매체</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>Antifade 마운팅 매체</td></tr><tr><td>Vectashield 마운팅 매체 (DAPI 포함)</td><td>Vector Products</td><td>H-1200</td><td>Antifade 마운팅 매체 with DAPI</td></tr><tr><td></td><td>Forceps Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Dumont 핀셋 생물학 등급, 스테인레스 스틸</td></tr><tr><td>행잉 드롭 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>유리 슬라이드</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>분자 프로브</td><td>H1399</td><td>DNA 염색</td></tr><tr><td>Mitotracker 레드 CMXRos&nbsp;</td><td>분자 프로브</td><td>M-7512</td><td>미토콘드리아 염색</td></tr><tr><td>Cleaved caspase-3 (Asp175) 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>#9661</td> caspase-3 <td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BAS)</td>의 활성 단편을 위한 염색<td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td> 면역 염색 인산염 완충 식염<td>수를 위한 차단제</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VWR</td><td>114-056-101</td><td>Triton&trade 세척 및 면역 염색용 매체</td></tr><tr><td>; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>세포 투과 용 세제</td></tr> <tr><td> Name </td> <td>Company </td> <td>카탈로그 번호 </td> <td>Comments</td></tr> <tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM780 컨 포칼 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>N / A</td><td>이미징</td></tr><tr><td>Carl Zeiss 실체현미경 Stemi 2000&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>드로소필 해부</td></tr><tr><td>AmScope 광섬유 듀얼 구스넥 현미경 조명기, 150W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316&nbsp;</td><td>광원</td></tr></tbody></table>

anastasis에서 vivo에서 caspasetracker 바이오 센서에 의해 감지

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (그리스어 "생활에 상승")은 그것에 의하여 일반적으로 본질적으로 가역 적인 것으로 간주 하는 단계의 세포 죽음 프로세스에 뒤집을 수 있는 세포 죽어 최근에 발견 된 세포 복구 현상. Anastasis 홍보 수 원리 구조 또는 보존 부상을 cardiomyocytes 등 신경, 조직 복구를 촉진 함으로써 대체 하기 어려운 세포. 반대로, 억제 anastasis 암 세포에 항 암 치료 후 apoptosis를 겪고 수 있습니다 암 세포 죽음 고 재발의 가능성을 줄일 수 있습니다. 그러나, 이러한 연구 anastasis 살아있는 동물에서 받아야 하는 셀의 운명을 추적 하기 위한 도구의 부족에 의해 방해 되어 있다. 복구 후 그들의 형태학 상으로 정상적인 외관에도 불구 하 고 세포 죽음 프로세스를 반전 하는 셀을 식별 하는 도전이입니다. 이 어려움을 극복 하기 위해 우리 초파리 및 식별 하 고 영구적으로 anastatic 세포 생체 외에서 또는 vivo에서추적할 수 있는 포유류 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템을 개발 했습니다. 여기, 우리는 생성 및 감지 하 고 세포 죽음 자극에 과도 노출 후에 초파리 melanogaster anastasis 추적 CaspaseTracker 듀얼 바이오 센서 시스템의 사용에 대 한 vivo에서 프로토콜을 제시. 기존의 바이오 센서 프로토콜 수 레이블 셀 적극적으로 겪고 apoptotic 세포 죽음, 그러나 CaspaseTracker 바이오 센서 caspase 활성화-단계의 apoptosis의 각 인 후 회복 된 셀 라벨 영구적으로 수 고 동시에 활성 apoptotic 프로세스를 식별 합니다. 이 바이오 센서는 직접 또는 간접적으로 관련 된 caspase 활동 세포 죽음의 다른 형태를 시도 하는 셀의 복구를 추적할 수도 있습니다. 따라서,이 프로토콜을 수 있습니다 이러한 세포와 생물 학적 기능, 분자 메커니즘, 생리 및 병리학 결과 및 치료 의미의 미래 연구를 촉진 하는 그들의 자손의 운명을 지속적으로 추적 anastasis입니다. 우리는 또한 그 비 apoptotic caspase 활동 비보를 표시 하는 anastasis 받아야 하는 셀을 구별 하는 적절 한 컨트롤을 논의.

시간 경과 라이브 셀 현미경은 배양된 세포20로 anastasis 신뢰할 수 있는 방법, 그것은 복구 된 셀 표시 형태학 상으로 구별할 수 있기 때문에 셀 동물, anastasis 받은 식별 하는 도전 정상적인 건강 한 세포에서 세포 죽음 시도 하지는. 예를 들어 인간의 자궁암 HeLa 세포 세포 죽음에 대 한 응답에서 apoptosis1,,214, 세포 수축 량, 핵 응축 등 플라즈마 멤브레인 blebbing의 형태학 상 특징을 표시 1µM staurosporine17 (그림 1A, 그림 1B i-ii) 자극 신선한 매체에 세...

Anastasis는 vivo에서 감지 하는 세포 죽음 프로세스를 반대로 세포 형태학 상으로 정상적인 건강 한 세포와 구별할 수 있기 때문에 기술적으로 도전적 이다. 여기 우리는 감지 하 고 우리의 새로 개발 된 vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템을 사용 하 여 라이브 동물에서 anastasis 받아야 하는 셀 추적에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Anastasis에서 Vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서에 의해 감지

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

이 절차의 전반적인 목표는 Drosophila melanogaster를 모델로 사용하여 살아있는 동물에서 카스파아제 활성화 후 세포 사멸 과정의 역전을 감지하고 추적하는 것입니다. 사멸 자극에 대한 반응으로 세포는 전통적으로 세포 사멸로 이어지는 돌이킬 수 없는 연쇄 반응으로 간주되어 온 세포사멸(apoptosis)과 같은 프로그래밍된 세포 사멸을 겪습니다. 하지만 흥미롭게도, 사멸 자극이 제거된 후에는, 일부 죽어가는 세포는 심지어 말기에도 세포의 사멸 과정을 역전시킬 수 있습니다.새로 발견된 아나스타시스(anastasis)라는 세포 회복 현상을 통해서입니다. Live cell microscopecopy는 apoptotic dying cell이 plasmid membrane blebbing, nuclear condensation 및 cell shrinkage와 같은 고유한 형태학적 특징을 나타내는 것을 보여줍니다. 일반적으로 이러한 세포는 사멸할 것으로 예상됩니다.그러나 죽어가는 세포를 새로운 배지로 씻고 배양한 후에는 아나스타시스를 겪고 회복하며 나중에 분열할 수 있습니다. 살아있는 동물에서 아나스타시스를 감지하고 추적하기는 어려운데, 그 이유는 회수된 세포가 주변의 건강한 세포와 형태학적으로 구별할 수 없기 때문입니다. 이 문제를 해결하기 위해 포유류의 CaspaseTracker 바이오센서 시스템이 개발되어 세포사멸의 특징인 실행 또는 카스파아제 활성화 후 세포 사멸 과정을 역전시키는 세포를 식별하고 추적했습니다.이 바이오센서 시스템은 caspase activatable transactivator, rtTA 및 Cre LoxP 기반 rtTA activity reporter의 두 가지 구성 요소로 구성됩니다. 카스파아제 활성이 없는 건강한 세포에서 rtTA는 카스파아제로 절단할 수 있는 DEVD 링커를 통해 원형질막 앵커에 연결됩니다. 테더링된 rtTA는 세포질에서 핵으로 전위할 수 없기 때문에 rtTA 리포터는 비활성 상태로 유지됩니다.그러나 세포 사멸 유도에 대한 반응으로 활성화되면 카스파제는 DEVD 링커를 절단하여 rtTA가 핵으로 전위되어 rtTA 리포터를 활성화하도록 합니다. 일단 핵에 들어가면 rtTA는 tet 반응 요소(TRE)에 결합하여 Cre 재조합효소의 일시적인 발현을 유발하여 CAG 프로모터와 적색 형광 단백질 DsRed의 암호화 서열 사이의 정지 코돈 카세트를 제거하는 비가역적 재조합 이벤트를 유발합니다. 그 결과 DsRed의 영구적인 발현이 이루어지며, 이는 자손뿐만 아니라 caspase 활성을 경험한 후에도 살아 있을 수 있는 세포에 대한 영구 형광 마커 역할을 합니다.Live cell confocal microscopy는 일시적인 세포 사멸 유도 후 CaspaseTracker 바이오센서 세포가 회복 중 및 회복 후에 DsRed를 발현하므로 흰색 화살표로 표시된 복구되지 않은 세포 및 세포 사멸 자극에 노출되지 않은 대조군 바이오센서 세포와 구별된다는 것을 보여줍니다. 세포사멸(apoptosis)과 같은 프로그램된 세포 사멸은 만연하고 대대적인 세포 파괴에 의해 실행되기 때문에 일반적으로 되돌릴 수 없는 것으로 간주됩니다. 그러나 우리는 죽어가는 세포가 사이토크롬 c 방출 후, 카스파제-3 활성화, DNA 손상, 원형질막 기포, 세포 수축 및 세포사멸체 형성 후와 같이 돌이킬 수 없는 지점으로 간주되어 온 후기 단계에서도 실제로 회복할 수 있음을 발견했습니다.우리는 이러한 세포 사멸 과정의 역전을 아나스타시스(anastasis)라고 명명했는데, 이는 그리스어로 생명으로 살아나는 것을 의미합니다. Live Cells Microscopy를 사용하여 배양된 세포에서 아나스타시스를 관찰할 수 있습니다. 그러나 회복된 사멸 세포는 세포 사멸을 전혀 시도하지 않은 정상적인 건강한 세포처럼 보일 수 있기 때문에 살아있는 동물에서 아나스타시스를 관찰하는 것은 기술적으로 어렵습니다.따라서 우리는 살아있는 동물에서 아나스타시스를 감지하고 추적하기 위해 CaspaseTracker 바이오센서 시스템을 개발했습니다. CaspaseTracker 시스템의 초파리 버전은 카스파제 활성화 가능한 사용 전사 인자인 GAL4와 G-TRACE로 알려진 GAL4 활성 리포터의 두 가지 구성 요소로 구성된 이중 바이오센서입니다. 카스파아제 활성이 없는 세포에서 효모 전사 인자인 GAL4는 카스파제 절단 가능한 DQVD 링커를 통해 원형질막 앵커 도메인에 연결됩니다.카스파아제 활성화 시, 활성화된 카스파제는 DQVD 링커를 절단하여 GAL4를 방출한 다음 핵으로 전위하여 G-TRACE 리포터를 활성화합니다. 핵 GAL4는 특정 업스트림 활성화 서열(약칭 UAS)에 결합하여 RFP의 일시적인 발현을 유발하며, 이는 카스파제와 GAL4 활성이 멈추고 RFP 단백질이 분해될 때까지 최근 또는 현재 카스파제 활성의 보고자 역할을 합니다. GAL4는 또한 FLP 재조합효소의 발현을 유발하며, 이는 유비퀴틴(Ubiquitin), 약칭 Ubi, promoter와 핵 표적 GFP의 코팅 서열 사이의 정지 카세트를 제거하는 재조합 이벤트를 유발합니다.그 결과 핵 GFP가 영구적으로 발현되며, 이는 카스파아제 활성을 경험했지만 살아 있는 세포와 그 자손의 영구적인 마커 역할을 합니다. 그러므로, 이 시스템은 일시적인 RFP 신호에 의해 진행 중이거나 최근의 카스파제 활성을 가진 세포와 영구적인 GFP 신호에 의한 과거의 카스파제 활성을 가진 세포를 식별할 수 있다. 대조군 바이오센서는 카스파제 절단 부위에 돌연변이 DQVA를 가지고 있으며, 이는 카스파제 활성에 둔감합니다.Caspase에 민감한 GAL4 처녀 암컷 파리를 G-TRACE 어린 수컷 파리와 교배하거나 그 반대로 CaspaseTracker 파리를 생성했습니다. 카스파아제 활성화 후 세포 사멸 과정의 가역성을 테스트하기 위해 파리는 먼저 추위 쇼크 또는 단백질 결핍과 같은 일시적인 세포 사멸을 유발하는 환경 스트레스에 노출됩니다. 그런 다음 스트레스를 받은 파리는 회복을 위해 정상적인 배양 조건으로 다시 옮겨집니다.조직은 대조군, 스트레스를 받거나 회복된 파리로부터 난소의 난실에서 얻었습니다. 샘플은 CaspaseTracker 바이오센서의 형광 신호를 감지하기 위해 컨포칼 현미경 검사를 받았습니다. 먼저, 마취되고 최근에 폐쇄된 카스파제에 민감한 DQVD GAL4는 이산화탄소를 사용하여 날아가고, 붓으로 7-10마리의 처녀 암컷을 작은 효모 페이스트 덩어리가 있는 신선한 식품 바이알로 옮깁니다.암컷을 7-10 마리의 어린 G-TRACE GAL4 리포터 수컷과 짝짓기하십시오. 새로 닫힌 처녀 파리는 애벌레 먹이의 잔해인 화살표로 표시된 짙은 녹색 태변을 보여줍니다. 새로 닫힌 파리는 성숙한 파리보다 더 큰 경향이 있습니다.수컷은 원으로 표시된 복부가 더 어둡고 암컷보다 작은 경향이 있습니다. GAL4 활성은 온도에 따라 증가하기 때문에 자손의 CaspaseTracker 바이오센서의 비특이적 신호를 줄이기 위해 십자가를 섭씨 18도로 설정합니다. 3일에서 7일마다 생산성이 떨어질 때까지 성충을 효모 페이스트가 들어 있는 새 바이알로 옮깁니다.자손이 닫히면 파리를 Caspase-sensitive GAL4 및 G-TRACE의 두 이식유전자와 연결하여 CaspaseTracker 자손 파리로 기능합니다. 두 삽입 모두 Curly-O에 의해 균형을 이룹니다. 따라서 곱슬곱슬하지 않은 날개 달린 파리는 두 가지 형질전환 유전자를 모두 가질 것입니다.음성 대조군의 경우, 카스파제에 민감하지 않은 DQVA GAL4 암컷과 G-TRACE GAL4 리포터 수컷 사이의 교배종에서 이중 이식유전자 자손을 수집하거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 실험적 교배에서 10-20마리의 새로 폐쇄된 암컷 파리 코호트를 효모 페이스트가 있는 새로운 바이알로 이동합니다. 일부 수컷을 추가하면 암컷의 난자 생산에 도움이 됩니다.잘 먹은 파리를 하루 동안 섭씨 18도로 옮겨 난소가 OO 발생을 통해 난실을 생성하도록 합니다. 그런 다음 난자가 세포사멸을 겪도록 유도하려면 냉 충격을 사용하십시오. 파리를 먹이가 없는 새 바이알로 옮기고 섭씨 7도에서 한 시간 동안 얼립니다.난실 세포사멸을 유도하는 또 다른 방법은 3일 동안 섭씨 18도에서 8%의 자당과 1%의 한천 먹이를 파리에게 가두어 단백질 결핍을 사용하는 것입니다. 이 방법을 사용할 때 단백질이 없는 식품 바이알을 매일 교체하십시오. 두 가지 방법 중 하나로 파리에게 스트레스를 가한 후 정상적인 서식지 상태로 되돌리고 3일 동안 효모 페이스트를 묻힌 음식을 먹여 회복할 수 있도록 합니다.나중에 이 파리를 해부하여 난실과 난소를 분리합니다. 마취 후 두 쌍의 집게를 사용하여 머리를 제거합니다. 그런 다음 복부 기저부에 있는 파리를 당겨 난소를 제거합니다.난자가 피펫 팁에 달라붙지 않도록 플라스틱 피펫 팁에 1% BSA를 물 또는 PBS에 용해시켜 난소를 채취할 준비를 합니다. 난자를 해부한 후 약 1/2 밀리리터의 PBS와 함께 준비된 팁에 모으십시오. 그런 다음 1ml 원심분리기 튜브에 옮기고 계란이 가라앉도록 합니다.형광 태그의 광 표백을 방지하기 위해 저조도 또는 완전히 어두운 조건에서 절차를 계속하십시오. PBS를 흡입하고 PBS에 함유된 4% 파라포름알데히드 500마이크로리터를 원심분리기 튜브에 넣습니다. 계란을 실온에서 20-30분 동안 부드럽게 회전시키며 고정시킵니다.장기간 고정하면 난자 챔버에서 형광 단백질의 신호가 고갈되므로 피하십시오. 고정되면 PFA를 제거하고 500마이크로리터의 PBS-T로 난자를 세 번 세척합니다. 그런 다음 PBS-T로 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 부드럽게 회전하여 난실을 투과화합니다.다음 날 아침, Hoechst와 같은 파란색 핵 염료 5마이크로그램이 포함된 PBS-T 500마이크로리터를 난자 챔버에 추가합니다. 실온에서 1-2시간 동안 부드럽게 회전하며 배양하되 더 이상은 그렇지 않으면 신호가 비특이적이 됩니다. 다음으로, 난자 챔버를 PBS-T로 세척당 10분 동안 3회 세척합니다.그런 다음 미세 피펫을 사용하여 모든 PBS-T를 흡인하고 200마이크로리터의 표백 방지 실장제를 도포합니다. 조직은 장착제를 완전히 흡수하기 전에 상단에 떠 있습니다. 제제의 난실을 섭씨 4도에서 3시간에서 하룻밤 동안 배양합니다.장착제를 완전히 흡수한 후 조직이 튜브 바닥으로 가라앉고 장착할 준비가 됩니다. 시작하려면 유리 슬라이드나 커버 슬립에 바셀린을 바르면 과도한 압축으로 계란 챔버가 파괴되지 않습니다. 얼룩진 달걀 챔버를 장착하려면 200마이크로리터의 장착제를 유리 슬라이드에 옮기고 20제곱밀리미터 유리 커버 슬립으로 덮습니다.매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하고 컨포칼 현미경을 사용하여 진행합니다. 건강한 CaspaseTracker 파리의 난소에는 CaspaseTracker 바이오센서 활성이 없었으며, 이는 녹색 및 적색 형광이 부족한 것으로 나타났습니다. 그러나 파리를 3일 동안 단백질 결핍과 같은 세포 사멸을 유발하는 환경 스트레스에 노출시킨 후, 난실은 RFP 및 GFP 바이오센서 신호를 유도하는 카스파아제 활성화와 함께 세포 사멸 과정을 거쳤습니다.대조적으로, 카스파제에 민감하지 않은 DQVA 파리에서 카스파제 절단 부위의 돌연변이는 바이오센서 민감도를 폐지했으며, 이는 바이오센서 신호가 카스파제 활성에 의존한다는 것을 나타냅니다. 그런 다음 굶주리고 카스파제에 민감한 바이오센서 파리에게 3일 동안 단백질 음식을 제공했습니다. 회수된 파리의 난실은 RFP 일시적인 카스파제 리포터를 발현하지 않았으며, 이는 최근 또는 진행 중인 카스파제 활동이 없음을 나타냅니다.중요한 것은 회수된 난실은 GFP만 발현되어 카스파아제 활성화 후 세포 사멸 과정을 역전시켰음을 나타냅니다. 아나스타시스는 일시적인 세포 사멸을 유도하는 온도 스트레스 후 생체 내에서도 관찰됩니다. 저온 쇼크에 대한 반응으로 죽어가는 난실은 RFP 및 GFP 바이오센서 마커를 발현하며, 이는 RFP 신호로 표시되는 최근 또는 진행 중인 카스파제 활성과 GFP 신호로 표시되는 과거 카스파제 활성을 나타냅니다.그러나, 3일 동안 정상적인 배양 상태로 돌아와 스트레스를 해소한 후, 회복된 파리의 난실은 GFP 카스파제 리포터만 표시했는데, 이는 이러한 난실의 세포가 카스파제 활성화 후 시점에서 아나스타시스를 겪었음을 나타냅니다. 특히, GFP CaspaseTracker 신호는 난자 챔버 내의 여러 세포 유형이 세포 사멸 과정을 역전시키고 난모세포 및 간호사 세포와 같은 생식선 세포, 체세포 여포 세포를 포함하여 카스파제의 손상을 복구할 수 있음을 보여줍니다. 흥미롭게도, GFP는 또한 동일한 난소 사슬에 있는 그것의 연합되는 난실과 함께 줄기세포를 포함하는 germarium에 있는 세포를 레테르를 붙였습니다.따라서 이러한 GFP 양성 난자는 아나스타시스를 거친 줄기세포에서 유래했을 수 있습니다. 다음은 환경 스트레스에 노출되지 않고 CaspaseTracker 바이오센서 활성을 표시하는 조직을 보여주는 이미지입니다. 이들은 해부되고 새로 닫힌 Day 0 암컷 파리의 입 부분, 앞창자, 작물, 중창자, 뒷창자, Malpighian tubules, 항문, 난관 및 난소입니다.컨포칼 현미경 검사는 RFP에 의해 표시된 최근의 카스파제 활성과 GFP에 의해 표시된 과거의 카스파제 활성을 보여줍니다. 확대된 이미지는 F-actin 염색과 함께 국소화된 시신경엽, 심장, Malpighian tubules, hindgut, 난실의 근육 벽에서 최근 또는 현재 진행 중이거나 과거의 카스파아제 활동을 보여줍니다. 난관(oviduct)과 같은 일부 조직은 과거의 카스파아제 활동만 보여줍니다.이러한 바이오센서 활동은 배아 발달 또는 정상적인 항상성 동안 잠재적인 마취 활동을 암시합니다. 또한 현재 또는 과거의 비세포사멸 카스파아제 활성을 나타낼 수 있습니다. 자세한 내용은 원고를 참조하기 바란다.생체 내 CaspaseTracker 바이오센서는 카스파제 절단이 불가능한 서열 DQVA를 가진 둔감한 CaspaseTracker에 바이오센서 활성이 없기 때문에 카스파제 활성을 특이적으로 보고합니다. 여기서 유일한 신호는 색소, 큐티클 및 지방체에서 나오는 자동 형광의 비특이적 신호입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 CaspaseTracker 바이오센서 시스템을 사용하여 살아있는 동물의 아나스타시스를 감지하고 추적하는 방법에 대한 일반적인 이해를 갖게 될 것입니다.이러한 바이오센서는 아나스타시스의 통화 및 알려진 기능에 대한 연구를 용이하게 할 수 있습니다. 그들의 도달 범위 식별은 광범위한 생리학적, 병리학적, 치료적 응용 분야를 가지고 있습니다. 이러한 바이오센서는 카스파아제 활성화 후 세포사멸의 역전을 감지할 수 있지만, 카스파아제 활성을 직간접적으로 포함하는 다른 형태의 세포 사멸을 시도한 후 세포의 회복을 감지할 수도 있습니다.실험을 설계할 때 마취 세포와 지속적인 카스파제 활성으로 죽어가는 세포를 추적하는 형광 바이오센서 신호를 구별하기 위해 상호 제어를 포함하는 것이 매우 중요합니다. 현재 또는 과거에 알려진 apoptotic caspase 활성과 색소, 지방 및 임계로부터 비특이적 자동 형광 신호를 가진 건강한 세포. 이 원고의 PDF 버전에서 자세한 내용을 찾아보십시오.

detecting-anastasis-in-vivo-by-caspasetracker-biosensor

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

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Anastasis에서 Vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서에 의해 감지

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