Name: Anastasis에서 Vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서에 의해 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 20 min 16 s
Description: 배우세요 CaspaseTracker 바이오센서를 이용하여 Drosophila melanogaster에서 아나스타시스를 감지하고 추적하는 방법을. 이 기술은 살아있는 동물에서 세포 사멸 역전을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 초파리 이미지 그림 3C와 비디오 원고;에 감사 대런 Obbard J. 마리 하드 윅, 웨이드 깁슨, 그리고 가치에 대 한 내용은이 원고 헤더 M. 양고기. 이 작품으로는 선생님 에드워드 Youde 기념 친교 (H.L.T.), 박사 월터 Szeto 기념 장학금 (H.L.T.) 지원 되었다 풀브라이트 생명 과학 연구 재단 친교 (H.L.T.), 및 NCI K22 부여 CA204458 (H.L.T.) 007-2009 (H.L.T.), 부여 합니다. 호 람 탕 Shurl 및 생명 과학 연구 재단 (2014-2017)의 케이 Curci 재단 연구원 이었다.

CaspaseTracker 바이오 센서의 1) 준비
<ol><li>CO2, 파리 anesthetize를 사용 하는 붓 비행 음식과 신선한 효 모 반죽과 같은 유리병에 7 ~ 10 caspase 민감한 Gal4 (DQVD)19 처녀 암컷과 7 10 G-추적53 Gal4 기자 젊은 남성 파리 (또는 반대로) 전송. 참고: 크로스 (DQVD)에 민감한 Caspase Gal4 및 G-추적 파리의 CaspaseTracker 자손 파리를 생산할 예정 이다. Caspase-에민감한 (DQVA)19 Gal4 크로스 고 G-추적 파리 부정적인 제어 파리 (내용 참조)을 제공 합니다. 신선한 효 모 반죽 그래서 그 자손의 수를 증가 계란 생산을 향상 시키기 위해 단백질 소스 역할을 합니다. 처녀 여성 및 젊은 남성 파리 그들의 고기54에 따라 선택 합니다.</li>
	<li>3 ~ 7 일, 십자가 동안 섭씨 18도 (oC)에서 파리를 품 어 그리고 파리 18 ° c.에 새로운 십자가를 설정 하는 새로운 유리병에 전송 계속 때까지 자손 파리 eclose 18 ° C에서 원래 유리병을 품 어. 참고: 원래 유리병에 자손의과 밀을 피하기 위해 새로운 튜브에 부모 파리를 전송. 부모 파리 신선한 음식과 처음 2-3 스위치에 효 모 반죽으로 자손을 생산할 수 있는 그리고 생산성 크게 줄어 시간. 파리를 높이 18 ° C CaspaseTracker 바이오 센서의 일반적인 신호를 줄일 수 있습니다 (내용 참조).</li>
	<li>선택 자손 다음 실험에 대 한 올바른 고기54 파리. 참고: 여기 caspase 민감한 Gal4 및 G-추적 transgenes CyO 분산 균형 두 번째 염색체에 있습니다. Caspase Gal4 민감하고 G-추적의 두 transgenes는 (CyO) 없이 비 곱슬 날개 자손을 선택 합니다.</li>
</ol>CaspaseTracker 바이오 센서 파리에 과도 세포 죽음 유도의 응용 프로그램 2)
<ol><li>10 ~ 20 새로 eclosed 여성 oogenesis 여 계란 약 실 생산을 허용 하도록 18 ° C에서 1 일 신선한 비행 음식과 신선한 효 모 반죽과 새로운 유리병에 파리를 전송 합니다. 참고: 남성 파리 여성을 유지 계란 약 실 생산 향상 시킬 수 있습니다.</li>
	<li>차가운 충격, 전송에 의해 apoptosis를 받 다 계란 챔버를 유도 하기 위해 여성 1 h-7 ° C에 배치 됩니다 새 빈 유리병 날아갑니다. 참고: 차가운 충격 유도 플라즈마 막 파열55,56세포 손상.</li>
	<li>유도 단백질 기아에 의해 apoptosis를 받 다 계란 챔버, 전송 여성 파리 18 ° C에서 8% 자당 및 1% 한 천은 식품과 새로운 유리병에 3 일. 참고: 단백질 기아 (비 단백질 음식) 계란 챔버 apoptosis57,,5859 와 autophagy60,61을 트리거할 수 있습니다. 스위치 이동 8% 자당 및 1% 한 천은 식품 새로운 유리병에 매일 비행 음식을 자당의 최적의 상태를 유지 합니다.</li>
	<li>스트레스 파리를 복구할 수 있도록 18 ° C에서 3 일 동안 신선한 비행 음식과 신선한 효 모 반죽과 새로운 유리병 다시 전송. 굶 어과 설명된62으로 난소에서 계란 챔버를 굶 어-복구 파리를 해 부. 참고: 난소를 초파리 해 부, anesthetize CO2, 파리 하 고 2 쌍이 집게를 사용 하 여 비행 머리를 제거 하는 집게는 파리의 난소를 제거 하는 복 부의 기지를 사용 하 여.</li>
</ol>3) 고정 및 이미징에 대 한 해 부 계란 챔버의 얼룩
<ol><li>1 mL 원심 분리기 튜브를 0.5 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 주위와 함께 해 부 계란 챔버를 전송 합니다. 진정 알 수 있습니다. 참고: 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 물 또는 끝의 플라스틱 표면에 붙어 계란 챔버를 방지 하기 위해 PBS에 용 해 된 플라스틱 피 펫 팁 코트. 빨간 형광 성 단백질 (RFP, 일컬어 DsRed)의 photobleaching을 피하기 위해 어둠 속에서 다음 절차를 수행 및 계란 약 실에서 녹색 형광 단백질 (GFP).</li>
	<li>Pipetting, PBS를 제거 한 다음 0.5 mL 4 %paraformaldehyde 실내 온도 20 ~ 30 분 동안 어둠에 계란 챔버를 해결 하기 위해 PBS에 적용. 참고: 이에 다음 인큐베이션 단계 부드러운 회전을 적용 합니다.</li>
	<li>Pipetting, 여는 paraformaldehyde를 제거 하 고 다음 씻어 0.5 mL PBST와 계란 챔버 (PBS + 0.1% 트라이 톤 X-100) 3 번. 참고: 장시간된 고정 RFP 및 GFP 신호를 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>실 온에서 1 ~ 2 h에 대 한 PBST와 계란 챔버를 품 어 또는 달걀 챔버를 permeabilize 부드러운 회전으로 4 ° C에서 하룻밤. 참고: PBST 비 BSA 코팅된 플라스틱 표면에 붙어 계란 챔버를 방지할 수도 있습니다.</li>
	<li>Pipetting, 여는 PBST를 제거 하 고 0.5 mL PBST에 블루 핵 Hoechst 염료의 10 μ g/mL의 핵에 대 한 얼룩을 실 온에서 1 ~ 2 h에 대 한 계란 챔버에 적용. NOTE1: 이것은 일반적인 신호 증가 핵 염료와 장기간된 부 화를 하지 마십시오. NOTE2: 핵 없이 Hoechst 얼룩을 대체 접근 200를 추가 하는 μ 안티 표백 장착 에이전트 DAPI (자료 참조)와 하룻밤63, 프로토콜 3.8에 설명 된 대로 조직 유리 커버 슬립에 장착 하기 전에 품 어. NOTE3: photobleaching을 피하기 위해 어둠에는 얼룩 및 다음 절차를 수행.</li>
	<li>Pipetting, 여 핵 염료를 제거 하 고 0.5 mL PBST 3 번, 10 ~ 20 분 부 화 각 세척 단계 사이 부드러운 회전으로 1 mL 원심 분리기 튜브에 계란 약 실을 씻어을 적용 합니다.</li>
	<li>미세 피 펫과 모든 PBST를 제거 하 고 다음 적용 200 μ 안티 표백 장착 에이전트 (참조 자료) 계란 챔버 튜브의 바닥에 침 몰 될 때까지 또는 하룻밤 4 ° C에서 3 시간 실내 온도에 계란 챔버를 품 어를. 참고: 장착 에이전트 흡수 완전히 조직 관의 바닥에 싱크.</li>
	<li>안티 표백 하는 200 μ와 그들을 전송 하 여 스테인드 계란 챔버 탑재 20 x 20 m m 미리 청소 유리 커버 슬립와 계란 실 커버 하 고 인감 넣어 유리 슬라이드에 커버 슬립, pipetting으로 이미징 미리 청소 유리 슬라이드에 에이전트를 설치 커버 슬립의 가장자리에 매니큐어. NOTE1: 전 유리 슬라이드와 커버 슬립 물 또는 70% 에탄올으로 청소. NOTE2: 바 셀 린 유리 슬라이드와 커버 슬립 overcompression에 의해 계란 챔버를 파괴 하지 않으려면 사이 적용 합니다.</li>
	<li>형광 또는 confocal 현미경, 20 배, 나 0.8 사용 하 여 사용 하 여 계란 약 실 이미지 핵 얼룩에 대 한 흥분 빛 파장 405 nm와 계획 Apochromat 목표 (감지 방출 ~ 461 nm), 561 RFP (지속적인 또는 최근 caspase 활동) 신호 (nm 검색 방출 ~ 590 nm), 및 488 nm (caspase 활동) 과거 GFP 신호 (방출 감지 ~ 518nm). 참고: 현미경20,64에 대 한 우리의 게시 프로토콜을 참조 하십시오.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

CaspaseTracker 듀얼 바이오 센서 시스템은 소설과 최근의 탐지를 허용 하는 독특한 도구 또는 지속적인 caspase 활동, 세포 죽음을 반대 해야 하는 셀을 추적 하 고 프로세스 caspase 활동에서 vivo에서발생 후 생존. Caspase 활동 apoptosis의 특징으로 전통적으로 생각 되었습니다, 하는 동안 성장 연구 공개 비 apoptotic caspase 활동 신경 활동79, 의 규칙 등의 다양 한 정상적인 세포 기능에 잠재적인 역할을 합니다. 80, 학습 및 메모리81,,8283,84, necropto...

프로그램 된 세포 죽음, apoptosis 등, 다세포 생물1,2,3, 부상, 원치 않는 또는 위험한 셀을 제거 하 여 배아 개발 및 정상적인 항상성에서 중요 한 역할. 생존 세포의 죽음 사이의 균형의 손실 암, 심장 마비, 면역, 등 변성4,5,6,,78치명적인 결과가 발생할 수 있습니다. Caspases는 전통적으로 "돌아올 수 없는 지점" apoptosis9,,1011, 그것으로 간주 되어 사형 집행의 활성화 트리거 신속 하 고 대규모 세포 파괴12, 13,14,,1516. 우리는 교양된 죽어가는 기본 세포와 암 세포는 원형질 막 blebbing, 셀 수축를 포함 하 여 죽음 특징 caspase 활성화, 하지만 또한 다음과 같은 중요 한 세포 뿐만 아니라 복구할 수 있습니다 입증이 일반적인 정설에 도전, 미토 콘 드 리아 조각화, cytosol, 핵 chromatin 응축이, DNA 손상, 핵 분열에 미토 콘 드리 아 시 토 크롬 c 의 릴리스 세포 phosphatidylserine (PS)의 표면 노출 및 apoptotic 시체의 형성 17 , 18 , 19 , 20 , 21. 우리 제안 그 anastasis은 기본 셀 복구 현상으로 죽어가는 세포 세포 죽음 자극17,,1819,20, 의 제거 후 복구할 수 있습니다 21. 우리가 만들어낸 용어 "Anastasis" (Αναστάσης)18, 의미 "상승 생활" 그리스어,에이 예기치 않은 셀 복구 현상 설명. Anastasis의 우리의 관찰은 추가 phosphatidylserine 외부화22,23,24, 미토 콘 드 리아 제한 후 세포의 복구를 또한 공개 최근 독립적인 학문에 의해 지원 되는 외부 멤브레인 permeabilization25, 혼합된 계보 니 같은의 활성화 (MLKL), 그리고 세포 수축26.
Anastasis 규제 메커니즘을 특성화 하는 것은 패러다임 변화 생리, 병리학, 그리고 치료 의미 있을 것 이다. Anastasis 구출 또는 왼쪽 심 실 심 실 역 중요 한 postmitotic 세포와 대체, 하기 어려운 조직 및 가능 하 게 심장 마비 반전에 대 한 계정 보존 이전에 알려지지 않은 cytoprotective 메커니즘을 나타내는 수 있습니다. 뇌 부상32후 장치 (LVADs)27,28, 과도 한 빛29,,3031, 과도 노출 또는 뉴런의 수리 후 포토 리셉터 세포의 복구를 지원 합니다. Anastasis 홍보 세포 및 조직 복구를 향상 시킬 수 있도록 하는 경우. 반대로, anastasis 생존 세포 죽음을 유도 하는 치료, 암 재발17,18을 일으키는 암 세포에 의해 사용 되는 예기치 않은 탈출 전술 수 있습니다. 따라서, 억제 anastasis 동안 암 세포 죽어 그리고 암 치료 그들의 재발을 방지 하 여 암을 치료 하는 새로운 치료 전략 수 있습니다.
Anastasis의 과정에서 우리는 일부 복구 된 셀 영구 유전 변경 취득 종양 전이 겪었다, apoptosis18,20,21 동안 DNA 손상으로 인해 발생 한 발견 . DNA 손상 된 세포의 죽음 과정 반전 수 tumorigenesis의 메커니즘, 식도에 만성 열 상해 유도 같은 조직, 다양 한 암 위험 증가 잠재적으로 조직 상해를 반복 관찰을 기본 차적인 암 치료38, 후 매우 뜨거운 음료33,,3435, 알코올 중독36,37인 한 간 손상, 종양 진화의 소비에 의해 3940,,및 새로운 암 항 암 치료41,42,,4344 의 주기 사이 간격 동안 발생 하는 정상 조직에서의 개발 . True 이면 방지 수 anastasis 타겟팅 또는 암 개발 및 진행을 체포. 우리는 죽어가는 세균 세포 기아 유도 다시 먹이 초파리19anastasis 수술을 발견 했다.  Anastasis 생식 세포 DNA 손상에서 발생 하면, 그것은 유전 질병의 개발을 촉진 하는 환경 스트레스를 장기간 관찰에 대 한 계정 수 있습니다. 예를 들어 기근 transgenerational 상속 질병 당뇨병, 관상 심장 질환45등의 개발에 기여 한다. 따라서, 이해 anastasis 전략 개발이 잠재적인 메커니즘으로 인 한 상속 질병의 예방에 대 한 발생할 수 있습니다.
Anastasis의 발견을 활용 하 고 혁신적인 치료법 개발을 직접, 원인 anastasis 살아있는 동물에서의 결과 공부 하 고 필수적 이다. 그러나, 그것은 기술적으로 확인 하 고 anastatic 셀에 추적 vivo에서, 세포 죽음 과정에서 발견 된 셀 표시 정상적인 건강 한 세포 형태학 상으로 구별할 고 아무 biomarker anastasis의 도전 확인 아직17,,1821. 이러한 문제를 해결 하려면 우리는 새로운 비보에 caspase 바이오 센서를 식별 하 여46, caspase의 활성화19,후 apoptosis를 생존 하는 셀 추적 "CaspaseTracker"19, 지정을 최근 개발 된 apoptosis10,14각 인이 고 "실시간" caspase 바이오 센서 등 배설물12,47, Apoliner48, 캘리포니아-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 iCasper52에서 구별 는 온가 caspase 활동 감지, CaspaseTracker 바이오 센서 또한 기능을 영구적으로 셀 익스프레스 caspase 활동 정도 능력. 따라서, CaspaseTracker 바이오 센서는 caspase 중재의 세포 죽음 과정 비보후 anastasis의 장기 추적을 하면 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>CONSUMABLES AND REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 마운팅 매체</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>Antifade 마운팅 매체</td></tr><tr><td>Vectashield 마운팅 매체 (DAPI 포함)</td><td>Vector Products</td><td>H-1200</td><td>Antifade 마운팅 매체 with DAPI</td></tr><tr><td></td><td>Forceps Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Dumont 핀셋 생물학 등급, 스테인레스 스틸</td></tr><tr><td>행잉 드롭 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>유리 슬라이드</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>분자 프로브</td><td>H1399</td><td>DNA 염색</td></tr><tr><td>Mitotracker 레드 CMXRos&nbsp;</td><td>분자 프로브</td><td>M-7512</td><td>미토콘드리아 염색</td></tr><tr><td>Cleaved caspase-3 (Asp175) 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>#9661</td> caspase-3 <td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BAS)</td>의 활성 단편을 위한 염색<td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td> 면역 염색 인산염 완충 식염<td>수를 위한 차단제</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VWR</td><td>114-056-101</td><td>Triton&trade 세척 및 면역 염색용 매체</td></tr><tr><td>; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>세포 투과 용 세제</td></tr> <tr><td> Name </td> <td>Company </td> <td>카탈로그 번호 </td> <td>Comments</td></tr> <tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM780 컨 포칼 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>N / A</td><td>이미징</td></tr><tr><td>Carl Zeiss 실체현미경 Stemi 2000&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>드로소필 해부</td></tr><tr><td>AmScope 광섬유 듀얼 구스넥 현미경 조명기, 150W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316&nbsp;</td><td>광원</td></tr></tbody></table>

anastasis에서 vivo에서 caspasetracker 바이오 센서에 의해 감지

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (그리스어 "생활에 상승")은 그것에 의하여 일반적으로 본질적으로 가역 적인 것으로 간주 하는 단계의 세포 죽음 프로세스에 뒤집을 수 있는 세포 죽어 최근에 발견 된 세포 복구 현상. Anastasis 홍보 수 원리 구조 또는 보존 부상을 cardiomyocytes 등 신경, 조직 복구를 촉진 함으로써 대체 하기 어려운 세포. 반대로, 억제 anastasis 암 세포에 항 암 치료 후 apoptosis를 겪고 수 있습니다 암 세포 죽음 고 재발의 가능성을 줄일 수 있습니다. 그러나, 이러한 연구 anastasis 살아있는 동물에서 받아야 하는 셀의 운명을 추적 하기 위한 도구의 부족에 의해 방해 되어 있다. 복구 후 그들의 형태학 상으로 정상적인 외관에도 불구 하 고 세포 죽음 프로세스를 반전 하는 셀을 식별 하는 도전이입니다. 이 어려움을 극복 하기 위해 우리 초파리 및 식별 하 고 영구적으로 anastatic 세포 생체 외에서 또는 vivo에서추적할 수 있는 포유류 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템을 개발 했습니다. 여기, 우리는 생성 및 감지 하 고 세포 죽음 자극에 과도 노출 후에 초파리 melanogaster anastasis 추적 CaspaseTracker 듀얼 바이오 센서 시스템의 사용에 대 한 vivo에서 프로토콜을 제시. 기존의 바이오 센서 프로토콜 수 레이블 셀 적극적으로 겪고 apoptotic 세포 죽음, 그러나 CaspaseTracker 바이오 센서 caspase 활성화-단계의 apoptosis의 각 인 후 회복 된 셀 라벨 영구적으로 수 고 동시에 활성 apoptotic 프로세스를 식별 합니다. 이 바이오 센서는 직접 또는 간접적으로 관련 된 caspase 활동 세포 죽음의 다른 형태를 시도 하는 셀의 복구를 추적할 수도 있습니다. 따라서,이 프로토콜을 수 있습니다 이러한 세포와 생물 학적 기능, 분자 메커니즘, 생리 및 병리학 결과 및 치료 의미의 미래 연구를 촉진 하는 그들의 자손의 운명을 지속적으로 추적 anastasis입니다. 우리는 또한 그 비 apoptotic caspase 활동 비보를 표시 하는 anastasis 받아야 하는 셀을 구별 하는 적절 한 컨트롤을 논의.

시간 경과 라이브 셀 현미경은 배양된 세포20로 anastasis 신뢰할 수 있는 방법, 그것은 복구 된 셀 표시 형태학 상으로 구별할 수 있기 때문에 셀 동물, anastasis 받은 식별 하는 도전 정상적인 건강 한 세포에서 세포 죽음 시도 하지는. 예를 들어 인간의 자궁암 HeLa 세포 세포 죽음에 대 한 응답에서 apoptosis1,,214, 세포 수축 량, 핵 응축 등 플라즈마 멤브레인 blebbing의 형태학 상 특징을 표시 1µM staurosporine17 (그림 1A, 그림 1B i-ii) 자극 신선한 매체에 세...

Anastasis는 vivo에서 감지 하는 세포 죽음 프로세스를 반대로 세포 형태학 상으로 정상적인 건강 한 세포와 구별할 수 있기 때문에 기술적으로 도전적 이다. 여기 우리는 감지 하 고 우리의 새로 개발 된 vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템을 사용 하 여 라이브 동물에서 anastasis 받아야 하는 셀 추적에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Anastasis에서 Vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서에 의해 감지

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

이 절차의 전반적인 목표는 Drosophila melanogaster를 모델로 사용하여 살아있는 동물에서 카스파아제 활성화 후 세포 사멸 과정의 역전을 감지하고 추적하는 것입니다. 사멸 자극에 대한 반응으로 세포는 전통적으로 세포 사멸로 이어지는 돌이킬 수 없는 연쇄 반응으로 간주되어 온 세포사멸(apoptosis)과 같은 프로그래밍된 세포 사멸을 겪습니다. 하지만 흥미롭게도, 사멸 자극이 제거된 후에는, 일부 죽어가는 세포는 심지어 말기에도 세포의 사멸 과정을 역전시킬 수 있습니다.새로 발견된 아나스타시스(anastasis)라는 세포 회복 현상을 통해서입니다. Live cell microscopecopy는 apoptotic dying cell이 plasmid membrane blebbing, nuclear condensation 및 cell shrinkage와 같은 고유한 형태학적 특징을 나타내는 것을 보여줍니다. 일반적으로 이러한 세포는 사멸할 것으로 예상됩니다.그러나 죽어가는 세포를 새로운 배지로 씻고 배양한 후에는 아나스타시스를 겪고 회복하며 나중에 분열할 수 있습니다. 살아있는 동물에서 아나스타시스를 감지하고 추적하기는 어려운데, 그 이유는 회수된 세포가 주변의 건강한 세포와 형태학적으로 구별할 수 없기 때문입니다. 이 문제를 해결하기 위해 포유류의 CaspaseTracker 바이오센서 시스템이 개발되어 세포사멸의 특징인 실행 또는 카스파아제 활성화 후 세포 사멸 과정을 역전시키는 세포를 식별하고 추적했습니다.이 바이오센서 시스템은 caspase activatable transactivator, rtTA 및 Cre LoxP 기반 rtTA activity reporter의 두 가지 구성 요소로 구성됩니다. 카스파아제 활성이 없는 건강한 세포에서 rtTA는 카스파아제로 절단할 수 있는 DEVD 링커를 통해 원형질막 앵커에 연결됩니다. 테더링된 rtTA는 세포질에서 핵으로 전위할 수 없기 때문에 rtTA 리포터는 비활성 상태로 유지됩니다.그러나 세포 사멸 유도에 대한 반응으로 활성화되면 카스파제는 DEVD 링커를 절단하여 rtTA가 핵으로 전위되어 rtTA 리포터를 활성화하도록 합니다. 일단 핵에 들어가면 rtTA는 tet 반응 요소(TRE)에 결합하여 Cre 재조합효소의 일시적인 발현을 유발하여 CAG 프로모터와 적색 형광 단백질 DsRed의 암호화 서열 사이의 정지 코돈 카세트를 제거하는 비가역적 재조합

detecting-anastasis-in-vivo-by-caspasetracker-biosensor

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

아나스타시스라는 용어는 죽어가는 세포가 말기에 세포 자살 과정을 역전시키고 스스로 회복하여 궁극적으로 살아남는 현상을 말합니다. 여기에서는 아나스타시스를 겪는 세포를 검출하고 추적하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

추적 아나스타시스, 세포 사멸을 취소 세포 생존 현상에 대한 전략

엑소좀은 생체 유체 내에서 발견되는 미세소포 구조로, 잠재적으로 중요한 질병 차별적 바이오마커를 운반할 수 있습니다. 여기에서는 비균일 전기순환 구형파를 사용하여 엑소좀이 파괴된 후 엑소좀을 특이적으로 추출하고 RNA/단백질 표적 모두에 대한 엑소좀 화물을 신속하게 테스트하기 위한 새로운 방법을 사용합니다.

전기장에 의한 해제 및 측정 (EFIRM)에 의해 Exosomal 바이오 마커의 검출

소포체 칼슘 항상성은 다양한 병리학에서 파괴됩니다.  분비된 ER 칼슘 모니터링 단백질(SERCaMP) 리포터를 사용하여 ER 칼슘 저장소의 중단을 감지할 수 있습니다.   이 프로토콜은 가우시아 루시페라아제 SERCaMP를 사용하여 ER 칼슘 항상성을 in vitro 및 in vivo에서 검사하는 방법을 설명합니다.

사용 소포체 칼슘 항상성 모니터링<em&gt; Gaussia</em&gt; 루시 페라 제 SERCaMP

카스파 제 활성의 낮은 농도를 포함하는 전체 동물의 건강한 세포를 검출하기 위해, CaspaseTracker 지정된 고감도 바이오 센서 초파리에 대해 생성 하였다. 카스파 따라 바이오 활성 데스 자극의 부재 하에서 최적 조건 하에서 사육 성인 동물의 내부 장기에 걸쳐 긴 수명이 건강한 세포에서 검출된다.

생체 내에서 바이오 센서는 초파리에서 비 세포 사멸 카스파 활동을 추적

이 프로토콜 설명 caspase 분자 형광 보완성 (BiFC); 그들의 활성화에 있는 첫걸음은 초기자 caspases의 유도 근접을 시각화 하는 데 사용할 수는 영상 기반 방법입니다.

Caspase 활성화 분자 형광 보완성을 사용 하 여 경로를 조명

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

이 프로토콜은 인간 혈액 샘플로부터 단핵구 유래 대식세포 (MDM)를 얻는 워크 플로우, 세포 생존력과 행동을 손상시키지 않고 염증성 카스파제 BiFC (BiFC) 리포터를 인간 MDM에 효율적으로 도입하는 간단한 방법, 살아있는 세포에서 염증성 카스파제 활성화를 측정하기위한 이미징 기반 접근법을 설명합니다.

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

이 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내 (마우스내) 감염, 무균 손상 및 암 모델 모두에 대한 반응으로 카스파제 활성화(카스파제-1, 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-11)를 평가하여 파이롭토시스, 세포자멸사, 괴사 및 PANoptosis와 같은 세포 사멸 경로의 개시를 결정합니다.

선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가

이 프로토콜은 종양 관련 단백질 분해 효소 활성의 생체 외 분석을 통해 현장 암 진단을 가능하게 하는 CRISPR-Cas 매개 다중 분석물 합성 소변 바이오마커 검사에 대해 설명합니다.

휴대용 진단을 위한 CRISPR-Cas 매개 다중분석물 합성 소변 바이오마커 검사

이 연구에서 제시된 프로토콜은 두 가지 방법을 통해 cAMP를 측정하는 데 있어 cAMP Difference Detector In Situ  의 효과를 보여줍니다. 한 가지 방법은 HEK-293 셀이 있는 96웰 플레이트 판독 분광 광도계를 사용하는 것입니다. 다른 방법은 형광 현미경으로 개별 HASM 세포를 보여줍니다.

In Situ Fluorescent cAMP Difference Detector를 사용한 살아있는 세포의 실시간 cAMP 역학

배우세요 CaspaseTracker 바이오센서를 이용하여 Drosophila melanogaster에서 아나스타시스를 감지하고 추적하는 방법을. 이 기술은 살아있는 동물에서 세포 사멸 역전을 연구하는 데 활용됩니다.

Anastasis에서 Vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서에 의해 감지

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