Anastasis에서 Vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서에 의해 감지

이 절차의 전반적인 목표는 Drosophila melanogaster를 모델로 사용하여 살아있는 동물에서 카스파아제 활성화 후 세포 사멸 과정의 역전을 감지하고 추적하는 것입니다. 사멸 자극에 대한 반응으로 세포는 전통적으로 세포 사멸로 이어지는 돌이킬 수 없는 연쇄 반응으로 간주되어 온 세포사멸(apoptosis)과 같은 프로그래밍된 세포 사멸을 겪습니다. 하지만 흥미롭게도, 사멸 자극이 제거된 후에는, 일부 죽어가는 세포는 심지어 말기에도 세포의 사멸 과정을 역전시킬 수 있습니다.

새로 발견된 아나스타시스(anastasis)라는 세포 회복 현상을 통해서입니다. Live cell microscopecopy는 apoptotic dying cell이 plasmid membrane blebbing, nuclear condensation 및 cell shrinkage와 같은 고유한 형태학적 특징을 나타내는 것을 보여줍니다. 일반적으로 이러한 세포는 사멸할 것으로 예상됩니다.

그러나 죽어가는 세포를 새로운 배지로 씻고 배양한 후에는 아나스타시스를 겪고 회복하며 나중에 분열할 수 있습니다. 살아있는 동물에서 아나스타시스를 감지하고 추적하기는 어려운데, 그 이유는 회수된 세포가 주변의 건강한 세포와 형태학적으로 구별할 수 없기 때문입니다. 이 문제를 해결하기 위해 포유류의 CaspaseTracker 바이오센서 시스템이 개발되어 세포사멸의 특징인 실행 또는 카스파아제 활성화 후 세포 사멸 과정을 역전시키는 세포를 식별하고 추적했습니다.

이 바이오센서 시스템은 caspase activatable transactivator, rtTA 및 Cre LoxP 기반 rtTA activity reporter의 두 가지 구성 요소로 구성됩니다. 카스파아제 활성이 없는 건강한 세포에서 rtTA는 카스파아제로 절단할 수 있는 DEVD 링커를 통해 원형질막 앵커에 연결됩니다. 테더링된 rtTA는 세포질에서 핵으로 전위할 수 없기 때문에 rtTA 리포터는 비활성 상태로 유지됩니다.

그러나 세포 사멸 유도에 대한 반응으로 활성화되면 카스파제는 DEVD 링커를 절단하여 rtTA가 핵으로 전위되어 rtTA 리포터를 활성화하도록 합니다. 일단 핵에 들어가면 rtTA는 tet 반응 요소(TRE)에 결합하여 Cre 재조합효소의 일시적인 발현을 유발하여 CAG 프로모터와 적색 형광 단백질 DsRed의 암호화 서열 사이의 정지 코돈 카세트를 제거하는 비가역적 재조합 이벤트를 유발합니다. 그 결과 DsRed의 영구적인 발현이 이루어지며, 이는 자손뿐만 아니라 caspase 활성을 경험한 후에도 살아 있을 수 있는 세포에 대한 영구 형광 마커 역할을 합니다.

Live cell confocal microscopy는 일시적인 세포 사멸 유도 후 CaspaseTracker 바이오센서 세포가 회복 중 및 회복 후에 DsRed를 발현하므로 흰색 화살표로 표시된 복구되지 않은 세포 및 세포 사멸 자극에 노출되지 않은 대조군 바이오센서 세포와 구별된다는 것을 보여줍니다. 세포사멸(apoptosis)과 같은 프로그램된 세포 사멸은 만연하고 대대적인 세포 파괴에 의해 실행되기 때문에 일반적으로 되돌릴 수 없는 것으로 간주됩니다. 그러나 우리는 죽어가는 세포가 사이토크롬 c 방출 후, 카스파제-3 활성화, DNA 손상, 원형질막 기포, 세포 수축 및 세포사멸체 형성 후와 같이 돌이킬 수 없는 지점으로 간주되어 온 후기 단계에서도 실제로 회복할 수 있음을 발견했습니다.

우리는 이러한 세포 사멸 과정의 역전을 아나스타시스(anastasis)라고 명명했는데, 이는 그리스어로 생명으로 살아나는 것을 의미합니다. Live Cells Microscopy를 사용하여 배양된 세포에서 아나스타시스를 관찰할 수 있습니다. 그러나 회복된 사멸 세포는 세포 사멸을 전혀 시도하지 않은 정상적인 건강한 세포처럼 보일 수 있기 때문에 살아있는 동물에서 아나스타시스를 관찰하는 것은 기술적으로 어렵습니다.

따라서 우리는 살아있는 동물에서 아나스타시스를 감지하고 추적하기 위해 CaspaseTracker 바이오센서 시스템을 개발했습니다. CaspaseTracker 시스템의 초파리 버전은 카스파제 활성화 가능한 사용 전사 인자인 GAL4와 G-TRACE로 알려진 GAL4 활성 리포터의 두 가지 구성 요소로 구성된 이중 바이오센서입니다. 카스파아제 활성이 없는 세포에서 효모 전사 인자인 GAL4는 카스파제 절단 가능한 DQVD 링커를 통해 원형질막 앵커 도메인에 연결됩니다.

카스파아제 활성화 시, 활성화된 카스파제는 DQVD 링커를 절단하여 GAL4를 방출한 다음 핵으로 전위하여 G-TRACE 리포터를 활성화합니다. 핵 GAL4는 특정 업스트림 활성화 서열(약칭 UAS)에 결합하여 RFP의 일시적인 발현을 유발하며, 이는 카스파제와 GAL4 활성이 멈추고 RFP 단백질이 분해될 때까지 최근 또는 현재 카스파제 활성의 보고자 역할을 합니다. GAL4는 또한 FLP 재조합효소의 발현을 유발하며, 이는 유비퀴틴(Ubiquitin), 약칭 Ubi, promoter와 핵 표적 GFP의 코팅 서열 사이의 정지 카세트를 제거하는 재조합 이벤트를 유발합니다.

그 결과 핵 GFP가 영구적으로 발현되며, 이는 카스파아제 활성을 경험했지만 살아 있는 세포와 그 자손의 영구적인 마커 역할을 합니다. 그러므로, 이 시스템은 일시적인 RFP 신호에 의해 진행 중이거나 최근의 카스파제 활성을 가진 세포와 영구적인 GFP 신호에 의한 과거의 카스파제 활성을 가진 세포를 식별할 수 있다. 대조군 바이오센서는 카스파제 절단 부위에 돌연변이 DQVA를 가지고 있으며, 이는 카스파제 활성에 둔감합니다.

Caspase에 민감한 GAL4 처녀 암컷 파리를 G-TRACE 어린 수컷 파리와 교배하거나 그 반대로 CaspaseTracker 파리를 생성했습니다. 카스파아제 활성화 후 세포 사멸 과정의 가역성을 테스트하기 위해 파리는 먼저 추위 쇼크 또는 단백질 결핍과 같은 일시적인 세포 사멸을 유발하는 환경 스트레스에 노출됩니다. 그런 다음 스트레스를 받은 파리는 회복을 위해 정상적인 배양 조건으로 다시 옮겨집니다.

조직은 대조군, 스트레스를 받거나 회복된 파리로부터 난소의 난실에서 얻었습니다. 샘플은 CaspaseTracker 바이오센서의 형광 신호를 감지하기 위해 컨포칼 현미경 검사를 받았습니다. 먼저, 마취되고 최근에 폐쇄된 카스파제에 민감한 DQVD GAL4는 이산화탄소를 사용하여 날아가고, 붓으로 7-10마리의 처녀 암컷을 작은 효모 페이스트 덩어리가 있는 신선한 식품 바이알로 옮깁니다.

암컷을 7-10 마리의 어린 G-TRACE GAL4 리포터 수컷과 짝짓기하십시오. 새로 닫힌 처녀 파리는 애벌레 먹이의 잔해인 화살표로 표시된 짙은 녹색 태변을 보여줍니다. 새로 닫힌 파리는 성숙한 파리보다 더 큰 경향이 있습니다.

수컷은 원으로 표시된 복부가 더 어둡고 암컷보다 작은 경향이 있습니다. GAL4 활성은 온도에 따라 증가하기 때문에 자손의 CaspaseTracker 바이오센서의 비특이적 신호를 줄이기 위해 십자가를 섭씨 18도로 설정합니다. 3일에서 7일마다 생산성이 떨어질 때까지 성충을 효모 페이스트가 들어 있는 새 바이알로 옮깁니다.

자손이 닫히면 파리를 Caspase-sensitive GAL4 및 G-TRACE의 두 이식유전자와 연결하여 CaspaseTracker 자손 파리로 기능합니다. 두 삽입 모두 Curly-O에 의해 균형을 이룹니다. 따라서 곱슬곱슬하지 않은 날개 달린 파리는 두 가지 형질전환 유전자를 모두 가질 것입니다.

음성 대조군의 경우, 카스파제에 민감하지 않은 DQVA GAL4 암컷과 G-TRACE GAL4 리포터 수컷 사이의 교배종에서 이중 이식유전자 자손을 수집하거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 실험적 교배에서 10-20마리의 새로 폐쇄된 암컷 파리 코호트를 효모 페이스트가 있는 새로운 바이알로 이동합니다. 일부 수컷을 추가하면 암컷의 난자 생산에 도움이 됩니다.

잘 먹은 파리를 하루 동안 섭씨 18도로 옮겨 난소가 OO 발생을 통해 난실을 생성하도록 합니다. 그런 다음 난자가 세포사멸을 겪도록 유도하려면 냉 충격을 사용하십시오. 파리를 먹이가 없는 새 바이알로 옮기고 섭씨 7도에서 한 시간 동안 얼립니다.

난실 세포사멸을 유도하는 또 다른 방법은 3일 동안 섭씨 18도에서 8%의 자당과 1%의 한천 먹이를 파리에게 가두어 단백질 결핍을 사용하는 것입니다. 이 방법을 사용할 때 단백질이 없는 식품 바이알을 매일 교체하십시오. 두 가지 방법 중 하나로 파리에게 스트레스를 가한 후 정상적인 서식지 상태로 되돌리고 3일 동안 효모 페이스트를 묻힌 음식을 먹여 회복할 수 있도록 합니다.

나중에 이 파리를 해부하여 난실과 난소를 분리합니다. 마취 후 두 쌍의 집게를 사용하여 머리를 제거합니다. 그런 다음 복부 기저부에 있는 파리를 당겨 난소를 제거합니다.

난자가 피펫 팁에 달라붙지 않도록 플라스틱 피펫 팁에 1% BSA를 물 또는 PBS에 용해시켜 난소를 채취할 준비를 합니다. 난자를 해부한 후 약 1/2 밀리리터의 PBS와 함께 준비된 팁에 모으십시오. 그런 다음 1ml 원심분리기 튜브에 옮기고 계란이 가라앉도록 합니다.

형광 태그의 광 표백을 방지하기 위해 저조도 또는 완전히 어두운 조건에서 절차를 계속하십시오. PBS를 흡입하고 PBS에 함유된 4% 파라포름알데히드 500마이크로리터를 원심분리기 튜브에 넣습니다. 계란을 실온에서 20-30분 동안 부드럽게 회전시키며 고정시킵니다.

장기간 고정하면 난자 챔버에서 형광 단백질의 신호가 고갈되므로 피하십시오. 고정되면 PFA를 제거하고 500마이크로리터의 PBS-T로 난자를 세 번 세척합니다. 그런 다음 PBS-T로 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 부드럽게 회전하여 난실을 투과화합니다.

다음 날 아침, Hoechst와 같은 파란색 핵 염료 5마이크로그램이 포함된 PBS-T 500마이크로리터를 난자 챔버에 추가합니다. 실온에서 1-2시간 동안 부드럽게 회전하며 배양하되 더 이상은 그렇지 않으면 신호가 비특이적이 됩니다. 다음으로, 난자 챔버를 PBS-T로 세척당 10분 동안 3회 세척합니다.

그런 다음 미세 피펫을 사용하여 모든 PBS-T를 흡인하고 200마이크로리터의 표백 방지 실장제를 도포합니다. 조직은 장착제를 완전히 흡수하기 전에 상단에 떠 있습니다. 제제의 난실을 섭씨 4도에서 3시간에서 하룻밤 동안 배양합니다.

장착제를 완전히 흡수한 후 조직이 튜브 바닥으로 가라앉고 장착할 준비가 됩니다. 시작하려면 유리 슬라이드나 커버 슬립에 바셀린을 바르면 과도한 압축으로 계란 챔버가 파괴되지 않습니다. 얼룩진 달걀 챔버를 장착하려면 200마이크로리터의 장착제를 유리 슬라이드에 옮기고 20제곱밀리미터 유리 커버 슬립으로 덮습니다.

매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하고 컨포칼 현미경을 사용하여 진행합니다. 건강한 CaspaseTracker 파리의 난소에는 CaspaseTracker 바이오센서 활성이 없었으며, 이는 녹색 및 적색 형광이 부족한 것으로 나타났습니다. 그러나 파리를 3일 동안 단백질 결핍과 같은 세포 사멸을 유발하는 환경 스트레스에 노출시킨 후, 난실은 RFP 및 GFP 바이오센서 신호를 유도하는 카스파아제 활성화와 함께 세포 사멸 과정을 거쳤습니다.

대조적으로, 카스파제에 민감하지 않은 DQVA 파리에서 카스파제 절단 부위의 돌연변이는 바이오센서 민감도를 폐지했으며, 이는 바이오센서 신호가 카스파제 활성에 의존한다는 것을 나타냅니다. 그런 다음 굶주리고 카스파제에 민감한 바이오센서 파리에게 3일 동안 단백질 음식을 제공했습니다. 회수된 파리의 난실은 RFP 일시적인 카스파제 리포터를 발현하지 않았으며, 이는 최근 또는 진행 중인 카스파제 활동이 없음을 나타냅니다.

중요한 것은 회수된 난실은 GFP만 발현되어 카스파아제 활성화 후 세포 사멸 과정을 역전시켰음을 나타냅니다. 아나스타시스는 일시적인 세포 사멸을 유도하는 온도 스트레스 후 생체 내에서도 관찰됩니다. 저온 쇼크에 대한 반응으로 죽어가는 난실은 RFP 및 GFP 바이오센서 마커를 발현하며, 이는 RFP 신호로 표시되는 최근 또는 진행 중인 카스파제 활성과 GFP 신호로 표시되는 과거 카스파제 활성을 나타냅니다.

그러나, 3일 동안 정상적인 배양 상태로 돌아와 스트레스를 해소한 후, 회복된 파리의 난실은 GFP 카스파제 리포터만 표시했는데, 이는 이러한 난실의 세포가 카스파제 활성화 후 시점에서 아나스타시스를 겪었음을 나타냅니다. 특히, GFP CaspaseTracker 신호는 난자 챔버 내의 여러 세포 유형이 세포 사멸 과정을 역전시키고 난모세포 및 간호사 세포와 같은 생식선 세포, 체세포 여포 세포를 포함하여 카스파제의 손상을 복구할 수 있음을 보여줍니다. 흥미롭게도, GFP는 또한 동일한 난소 사슬에 있는 그것의 연합되는 난실과 함께 줄기세포를 포함하는 germarium에 있는 세포를 레테르를 붙였습니다.

따라서 이러한 GFP 양성 난자는 아나스타시스를 거친 줄기세포에서 유래했을 수 있습니다. 다음은 환경 스트레스에 노출되지 않고 CaspaseTracker 바이오센서 활성을 표시하는 조직을 보여주는 이미지입니다. 이들은 해부되고 새로 닫힌 Day 0 암컷 파리의 입 부분, 앞창자, 작물, 중창자, 뒷창자, Malpighian tubules, 항문, 난관 및 난소입니다.

컨포칼 현미경 검사는 RFP에 의해 표시된 최근의 카스파제 활성과 GFP에 의해 표시된 과거의 카스파제 활성을 보여줍니다. 확대된 이미지는 F-actin 염색과 함께 국소화된 시신경엽, 심장, Malpighian tubules, hindgut, 난실의 근육 벽에서 최근 또는 현재 진행 중이거나 과거의 카스파아제 활동을 보여줍니다. 난관(oviduct)과 같은 일부 조직은 과거의 카스파아제 활동만 보여줍니다.

이러한 바이오센서 활동은 배아 발달 또는 정상적인 항상성 동안 잠재적인 마취 활동을 암시합니다. 또한 현재 또는 과거의 비세포사멸 카스파아제 활성을 나타낼 수 있습니다. 자세한 내용은 원고를 참조하기 바란다.

생체 내 CaspaseTracker 바이오센서는 카스파제 절단이 불가능한 서열 DQVA를 가진 둔감한 CaspaseTracker에 바이오센서 활성이 없기 때문에 카스파제 활성을 특이적으로 보고합니다. 여기서 유일한 신호는 색소, 큐티클 및 지방체에서 나오는 자동 형광의 비특이적 신호입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 CaspaseTracker 바이오센서 시스템을 사용하여 살아있는 동물의 아나스타시스를 감지하고 추적하는 방법에 대한 일반적인 이해를 갖게 될 것입니다.

이러한 바이오센서는 아나스타시스의 통화 및 알려진 기능에 대한 연구를 용이하게 할 수 있습니다. 그들의 도달 범위 식별은 광범위한 생리학적, 병리학적, 치료적 응용 분야를 가지고 있습니다. 이러한 바이오센서는 카스파아제 활성화 후 세포사멸의 역전을 감지할 수 있지만, 카스파아제 활성을 직간접적으로 포함하는 다른 형태의 세포 사멸을 시도한 후 세포의 회복을 감지할 수도 있습니다.

실험을 설계할 때 마취 세포와 지속적인 카스파제 활성으로 죽어가는 세포를 추적하는 형광 바이오센서 신호를 구별하기 위해 상호 제어를 포함하는 것이 매우 중요합니다. 현재 또는 과거에 알려진 apoptotic caspase 활성과 색소, 지방 및 임계로부터 비특이적 자동 형광 신호를 가진 건강한 세포. 이 원고의 PDF 버전에서 자세한 내용을 찾아보십시오.