Name: 셀룰로오스 종이 디스크와 벌거 벗은 눈 색채 면역 측정법에 그들의 응용 프로그램에 항체의 결합 공유 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 학습하세요 셀룰로오스 종이 디스크에 항체를 공유 결합 고정하는 방법을. 글루타르알데히드 가교 반응을 활용한 저비용 면역측정법으로 IgG 검출이 가능하며 현장 진단에 활용됩니다.

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셀룰로오스 종이 디스크 1. 손톱 아민 기능성 그룹 <ol><li> 구멍 펀치를 사용하여 6.0 mm (중간 흐름 여과지)의 직경 급 1 위 셀룰로오스 종이로 만든 1cm × 1cm, 100 종이 디스크의 차원과 정사각형 종이 한 장을 준비합니다. </li><li> 용지에 디스크 -NH 2기를 유도 퓸 후드에서 50 ml의 유리 병에 1 ml의 APS에 10 ml의 아세톤을 혼합한다. 새롭게 준비 APS 시약 혼합물에 종이 디스크를 추가하고, 실온 (32)의 궤도 교반 (200 rpm으로) 5 시간 동안 배양한다. 주의 : 흄 후드에서 APS 및 아세톤을 처리합니다. </li><li> 유기 폐기물 용기에 50 ml의 유리 병에서 과잉 용액을 경사 분리한다. </li><li> 유리 병에 아세톤 10 mL를 추가 잘 혼합하고 반응 APS 및 기타 불순물을 제거하기 위해 디 캔트 완전히. 이 단계를 두 번 반복합니다. </li><li> 3 시간 동안 110 ℃로 오븐에서 종이 타월과 장소에서 용지 디스크 확산. 허용종이 디스크는 냉각합니다. 실온에서 50 mL의 원심 분리 튜브 내의 디스크 저장한다. </li><li> 아래의 (그림 3A)에 설명 된 바와 같이, 셀룰로오스 정사각형 종이에 아민 그룹의 접목을 확인하기 위해 적외선 분광기 (FTIR)를 푸리에 변환을 사용합니다. <ol><li> 컴퓨터를 켜고 FTIR 분광 악기를 엽니 다. </li><li> FTIR 스펙트럼을위한 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> &#39;측정 → 초기화&#39;로 이동합니다. &#39;BS : KBr을&#39;의 직사각형 : 초기화가 완료되면 &#39;램프 적외선&#39;과 &#39;레이저&#39;는 녹색으로 바뀝니다. </li><li> 사각형 아래에 &#39;데이터&#39;를 선택하고 &#39;% 투과율&#39;, &#39;햅 - 겐젤&#39;, &#39;45&#39;, &#39;4.0&#39;및 &#39;최소 400, 최대 : 4000&#39;선택 &#39;측정 모드&#39;를 들어, &#39;아포 다 이즈&#39;, &#39; 아니. 스캔 &#39;,&#39;해상도 &#39;와&#39;범위 (cm-1) &#39;의. </li><li> &#39;측정&#39;을 클릭합니다. </li><li> 백그라운드 데이터 &#39;데이터 파일&#39;을 선택합니다. 쓰다코멘트 아래로. </li><li> 배경에 대한 기준을 얻기 위해 &#39;BKG&#39;을 클릭합니다. </li><li> 필름 샘플 홀더에 정사각형 종이를 수정합니다. </li><li> 샘플 데이터를 &#39;데이터 파일&#39;을 선택합니다. 주석을 기록합니다. </li><li> 샘플의 스펙트럼을 얻기 위해 &#39;샘플&#39;을 클릭합니다. </li><li> FTIR 분광학 응용 프로그램을 닫고 컴퓨터의 전원을 끄십시오. </li></ol></li><li> 위의 단계를 (1.6-1.1 단계) 아민 작용 등급 번호 (113) 셀룰로오스 정사각형 종이 및 디스크 (빠른 흐름 여과지)를 제조하는 반복 한 학년 제 113 정사각형 종이 (그림 3B)에 대한 FTIR 스펙트럼을 얻을 수 있습니다. </li></ol> 아민 기능화 된 셀룰로오스 종이 디스크에 항체 2. 공유 결합 고정화 <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54111/54111fig1.jpg" /> 두 가지 다른 방법에 의해 항체 고정화 1. 공유 결합도.를했다. 요오드 산화를 통해 아민 작용 셀룰로오스 종이 디스크에 고정 항체. 탄수화물 잔기의 알데히드 작용기를 생성하는과 요오드 산 나트륨에 의해 산화했다. 그리고, 산화 된 항체는 아민 기능화 셀룰로오스 종이 디스크 상에 로딩 하였다. B한다. 항체는 다음 글루 타르 알데히드를 통해 아민 작용 셀룰로오스 종이 디스크에 고정되었다. 아민 작용 화 셀룰로스 종이 디스크 페이퍼 디스크에 알데히드기를 도입 0.05 % 글루 타르 알데히드 수용액에 침지 하였다. 세척 후, 항체 알데히드 작용 종이 디스크에로드 하였다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54111/54111fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol><li> 요오드 산화 (그림 1A)를 통해 아민 작용 셀룰로오스 종이 디스크에 항체를 고정. <ol><li> 2.5 mM의 나트륨 perioda 1 μl를 혼합0.1 mg을 2 μL와 TE / ㎖의 토끼의 IgG-FITC 항 인간 및 1.5 ㎖의 튜브를 100mm의 pH를 5.5 초산 완충액 7 μL, 30 분 동안 어두운 데에서 상기 혼합물을 배양한다. 참고 : 필요한 경우 더 산화 된 항체를 준비하기 위해이 볼륨 비율을 따릅니다. 과 요오드 산 나트륨 및 토끼 항 - 인간 IgG-FITC의 농도를 최적화하기 위해 체적 비율을 변경한다. </li><li> (이 pH 7.4 PBS) 40 μL의 최종 부피의 50 mM 인산염 완충 식염수를 30 μL로 상기 항체 용액을 희석. </li><li> 세 아민 관능 매체 흐름 여과지 디스크 및 (섹션 1에서 설명) 세 아민 기능화 패스트 플로우 페이퍼 디스크를 준비한다. <ol><li> 로드 각 매체 흐름 여과지 디스크에과 요오드 산 나트륨으로 산화 토끼 항 - 인간 IgG-FITC 5 μL를 각각의 빠른 흐름 여과지 디스크에 8 μL. 실온에서 1 시간 동안 어둠 속에서 이들 페이퍼 디스크를 유지한다. </li></ol></li><li> 세척 버프 0.2 ml의 종이 디스크의 각을 씻으십시오ER (50mM 트리스 0.15 M 염화나트륨 및 0.05 %의 계면 활성제, pH를 7.4로 버퍼). 세탁 세 번 반복합니다. </li><li> 각 셀룰로스 페이퍼 디스크 (32) 상에 항체의 존재를 확인하기 형광 분자 이미 저를 통해 형광 이미지의 사진. (S3 그림도 S1)로서 제어부 (요오드 산 나트륨의 부재 하에서 항체를 동일한 농도로 처리) 빈 페이퍼 디스크를 사용한다. 참고 실험 최적화 최적화 및 기타 모든 파라미터들의 농도를 해결해야 할 하나의 파라미터의 농도를 변경. 높은 형광 강도는 셀룰로스 페이퍼 디스크에 고정화 캡쳐 항체의 양을 증가시킨다. </li></ol></li><li> 글루 타르 알데히드 (그림 1B)를 통해 아민 작용 셀룰로오스 종이 디스크에 항체를 고정. <ol><li> 세 APS 처리 매체 흐름 여과지 디스크 및 세 빠른 흐름 여과지 디스크를 추가 (DES실온에서 공전 교반하면서 1 시간 동안 0.05 %의 글루 타르 알데히드를 포함의 50 mM PBS (PH 7.4) 2 ㎖에 1 장)에 cribed. 주의 : 흄 후드에서 글루 타르 알데히드를 처리합니다. </li><li> 이 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에 세 개의 디스크를 각각 배치합니다. 각 튜브에 탈 이온수 (DI) 물 1 ML을 추가하고 10 초 동안 튜브를 흔들. 피펫으로 흡입하여 물을 제거합니다. 어떤 반응 글루 타르 알데히드를 제거하기 위해 두 번 더 반복합니다. </li><li> 로드 (5) 각각의 알데히드 - 관능 매체 흐름 여과지 디스크에 25 μg의 / ㎖의 토끼 항 - 인간 IgG-FITC (포획 항체)의 μL, 각각 알데히드 - 관능 빠른 흐름 여과지 디스크에 8 μL를 추가한다. 실온에서 약 20 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션. 이어서, 항체를 제거하지 않고 각각 종이 디스크로의 50 mM PBS (PH 7.4)의 10 μL를 추가 아민 알데히드 반응을 40 분 동안 배양한다. </li><li> 종이 타월 위에 세척 버퍼의 0.2 ml의 종이 디스크를 씻으십시오. 반복두 번 씻는다. </li><li> 각 셀룰로스 종이 디스크 (33)에 대한 항체의 존재를 확인하기 위해, 이미 저 분자량 형광을 형광 영상 사진. 대조군으로 빈 종이 디스크를 사용합니다. 참고 :도 4에서, &#39;0&#39;글루 타르 알데히드의 부재하에 FITC 항체를 동일한 농도로 처리 하였다 백지 디스크을 나타내며; 도 5a에서, 빈 종이 디스크는 글루 타르 알데히드로 처리되지만-FITC 항체 페이퍼 디스크에로드되지 않았다. </li></ol></li><li> 10 분 동안 37 ° C에서 (섹션 2.1 및 2.2)에서 용지 디스크를 닦아냅니다. </li><li> 블로킹 완충액 15 μL와 페이퍼 디스크를 차단하고 실온에서 10 분 동안 (10 % 0.15 M NaCl로 50 mM 트리스 완충액, pH 7.4의 분유 탈지). </li><li> 로드 및 5 μL의 PBS 과산화 효소 접합 염소 항 - 토끼 IgG를 8 μL (1 : 10,000) 각각 매체 흐름 및 고속 유동 여과지 디스크 상에. 알을 품다실온에서 어두운 곳에서 30 분간. </li><li> 종이 타월 위에 세척 버퍼의 0.2 ml의 종이 디스크를 씻으십시오. 세탁 세 번 반복합니다. 주 :이 결과가 버퍼에 의해 영향을받지 않는 것처럼 세척 완충액을 제거 할 필요가 없다. </li><li> 각 디스크에 3,3 &#39;, 5,5&#39;- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB)과 과산화수소 용액 10 ㎕의 혼합물을로드. </li><li> 배양의 5 분 후 디지털 카메라 나 스마트 폰으로 종이 디스크의 이미지를 가져 가라. 참고 :도 5b에, &#39;0&#39;항체 HRP (홀스 래 디쉬 퍼 옥시다아제) FITC 항체의 부재 접합체를 로딩 하였다 글루 타르 알데히드로 처리 한 페이퍼 디스크, 약자. </li></ol> 3. IgG의 검출을위한 ELISA를 종이 기반 <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54111/54111fig2.jpg" /> 종이 기반의 ELISA FO 그림 2. 도식 표현R IgG의 검출. 캡처 항체는 공유 글루 타르 알데히드를 통해 알데히드 기능화 된 셀룰로오스 종이 디스크에 고정되었다. 셀룰로오스 종이 디스크 블록킹 완충액 (blocking buffer). 대상의 IgG는 HRP 컨쥬 게이트 신호 항체를 로딩 한 다음, 디스크에 첨가 하였다. 마지막으로, TMB과 과산화수소 혼합물 솔루션은 컬러 판독에 대한 각 용지 디스크에로드했습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54111/54111fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol><li> 20 ㎖의 유리 병 (50 mM의 PBS 완충액, pH 7.4의 제조) 0.05 % 글루 타르 알데히드 용액 5 mL를 추가한다. 이 솔루션 15 아민 기능화 중간 흐름 필터 종이 디스크를 담그고 실온에서 진탕 1 시간 동안 유지한다. <ol><li> 동시에, 단계를 반복 3.1 다른 15 알데히드 작용 빠른 흐름 필터 종이 디스크를 준비합니다. 주의 : 연기에 글루 타르 알데히드를 처리후드. </li></ol></li><li> 페이퍼 디스크에서 미 반응의 글루 타르 알데히드를 제거하고, 또 다른 15 mL의 원심 분리 튜브에 15 mL의 원심 분리 튜브 내의 15 중간 흐름 여과지 디스크, 15 빠른 흐름 여과지 디스크를 배치했다. 각 튜브에 DI 물 5 ㎖를 추가하고 10 초 동안 튜브를 흔들. 피펫으로 흡입하여 물을 제거합니다. 어떤 반응 글루 타르 알데히드를 제거하기 위해 두 번 반복합니다. </li><li> 37 ° C 오븐에서 용지 디스크를 닦아냅니다. </li><li> 5 μL를 각각 매체 흐름 및 고속 유동 여과지 디스크, 각각 0.025 ㎎ / ㎖ 마우스 IgG-Fc 단편 항체 8 μL를 추가하고, 20 분 동안 배양한다. </li><li> 항체를 제거하지 않고 각각 종이 디스크로의 50 mM PBS (PH 7.4) 10 μl를 첨가하고 아민 알데히드 반응을 40 분 동안 배양한다. </li><li> 종이 타월 위에 세척 버퍼의 0.2 ml의 종이 디스크를 씻으십시오. 세탁 세 번 반복합니다. </li><li> 37 ° C의 오븐에서 페이퍼 디스크를 건조. </li><li> w 용지 디스크를 차단실온에서 10 분간 차단 완충액 15 μL의 제 i. </li><li> 종이 타월 위에 세척 버퍼의 0.2 ml의 각 용지 디스크를 씻으십시오. 세탁 세 번 반복합니다. </li><li> IgG의 표준을 실행합니다. <ol><li> 로드 IgG를 다양한 농도 10 μL (예를 들어, 0, 10, 125, 250, 500 ng를 / PBS에서의 ㎖) 중으로의 각 디스크에. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. </li></ol></li><li> 종이 타월 위에 세척 버퍼의 0.2 ml의 종이 디스크를 씻으십시오. 세탁 세 번 반복합니다. </li><li> 로드 (10) HRP 접합 마우스 IgG-Fc 단편 항체 (1 : 10,000, 10 mM의 PBS, pH 7.4의)의 μL 및 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 종이 타월 위에 세척 버퍼의 0.2 ml의 종이 디스크를 씻으십시오. 세탁 세 번 반복합니다. 주 :이 결과가 버퍼의 존재에 의해 영향을받지 않는 것처럼 세척 완충액을 제거 할 필요가 없다. </li><li> 각각의 디스크 상에 TMB의 10 μl의 혼합물과 과산화수소를로드합니다. </li><li> 티배양의 5 분 후 디지털 카메라 나 스마트 폰으로 모든 종이 디스크 아케 이미지. 참고 : 그림 6A에서 &#39;0&#39;캡처 항체 고정화 처리 한 종이 디스크를 의미하고, IgG의 혈청없이 항체 HRP / TMB 솔루션입니다. </li><li> J. 이미지로 이미지에서 각각 종이 디스크의 강도를 분석 <ol><li> &#39;이 .tif&#39;형식으로 단계 3.15에서 촬영 한 이미지를 변환합니다. </li><li> 열기 &#39;이미지 J&#39;소프트웨어. </li><li> &#39;파일 → 열기&#39;로 이동하여 분석 할 이미지를 선택합니다. </li><li> 모양 버튼 &#39;타원형&#39;를 선택합니다. </li><li> &#39;이미지 → 형 → 32 비트&#39;로 이동합니다. </li><li> &#39;편집 → 반전&#39;로 이동합니다. </li><li> &#39;→ 측정 분석&#39;으로 이동합니다. </li><li> 복사 및 스프레드 시트의 데이터를 분석 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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변성 셀룰로오스 종이 디스크의 친 화성 정제 된 염소 항 - 마우스 IgG-FC 캡쳐 항체의 직접적인 코팅은 IgG의 농도를 검출 하였다. 결과는 포획 항체의 추가 고정은 재현성이 요구되는 것으로 나타났다. 실란 기술이 성공적 셀룰로오스 종이 디스크 (34)에 아민 작용기를 도입하는 데 사용 하였다. APS의 농도는 항체의 고정화에 영향을 미친다. 따라서, 아세톤 APS의 양도 최적화 하였다. 아세톤 10 ㎖ 중의 APS 1 ㎖ 글루 타르 알데히드 가교 결합제를 통해 항체의 고정화 아민기를 이식을위한 최적의 농도였다. 항체는 요오드 산화 및 글루 타르 알데히드 가교 방법에 의해 셀룰로오스 종이 디스크 상에 그래프트 하였다. 우리의 결과는 글루 타르 알데히드 가교 방법에 의해 고정화 된 항체의 결합 능력은 메드 대한 요오드 산화법보다 것을 알았다IUM 흐름 빠른 흐름 여과지 디스크. 또한, 글루 타르 알데히드 가교 방법으로 셀룰로오스 종이 디스크에 고정 된 포획 항체는 자신의 기능을 보유하고 용지 텍싱 15 ...

점의 케어 테스트 (POCT) 진단 연구는 치료제에 대한 새로운 전략의 개발, 맞춤 의학 및 홈 케어 1 중요합니다. 그들은 싼 접근, 사용자 2에 익숙한로 셀룰로오스 종이 널리 면역에서 플랫폼으로 사용됩니다. 또한 셀룰로스 종이의 다공성 구조는 추가적인 에너지에 영향을주지 않고, 액체 흐름을 유발할 수있는 능력을 가지고있다. 종이 기반 bioanalysis의 기록은 초기에 가장 널리 퍼진 예는 임신과 당뇨병 테스트 스트립과 같은 면역 크로마토 그래피 테스트 3, 1952 종이 크로마토 그래피에 처음 발명 된 20 세기, 같은 찾을 수 있습니다. 이 테스트는 상대적으로 빠른 분석 시간과 저렴한 분석 (4)를 제공합니다. 그들의 단순에, 이러한 종래의 종이 스트립 시험은 널리 POCT 진단 (5)에 사용되어왔다. 비색 6 전기 포함 검출 방법화학 (7) 및 (8) 전기 화학 발광 방법은 생물학적 샘플에서 표적을 측정하기 위해보고되었다. 이러한 양적 방법 이외에, 셀룰로오스 종이에 항체를 고정화하기위한 신뢰할 수있는 방법은 진단 장치의 개발이 중요하다. 비특이적 흡착 고정화 후 목표물을 최대 결합능을 보장하기 위해 종이 기반의 장치 (9), (10)의 표면 상에 항체를 수정하기위한 주요 전략이다. 그러나, 이전의 연구 셀룰로오스 종이에 흡착되는 항체가 40 %, 섬유 (11)로부터 탈착 될 수있는 것으로 나타났다. 따라서, 셀룰로오스 상에 항체의 직접 흡착 재현 가능한 결과 (12)를 제공하지 않을 수 있습니다. 종이 표면에 그라프 트되어 항체의 공유 고정화 효과 지필 생물 검정 (13)를 개발하는 다른 방법이다. 다양한 방법이 셀룰로오스 (14) (15)의 변형에 대해보고 된 </sup&gt;. 이상적으로, 항체 고정화 (12) 후 원래의 기능을 유지해야한다. 카르 1- 시아 노 -4- 플루오로 보레이트 dimethylaminopyridinium 16과 결합; 18 UV 계 활성화 전략 17 내지 1- 플루오로 -2- 나이트로 -4- azidobenzene; 크 실로 글루칸 변성 (19)에 기초한 화학 효소 적 전략; 1,4- phenylenediisothiocyanate 링킹 에이전트 (20); 헤테로 다당류 산화 (21) 클릭 화학 (22) 양이온 포르피린 23은 공유 셀룰로오스 종이에 생체 분자를 고정하기 위해 사용되어왔다. 키토산 수정 용지가 풍부하고 27 생체 적합성 때문에 종이 기반 immunodevices 24-26을 개발하는 데 사용되었습니다. 키토산은 양이온과 음이온 셀룰로오스 (27)에 강력하게 준수합니다. 캡처 항체는 키토산 코팅 및 글루 타르 알데히드 가교를 통해 종이에 고정된다. 요오드 산화는 대위를 접목하는 또 다른 방법이다셀룰로오스 종이 (28)에 URE 항체. 이 방법에서, 소듐 페리오 데이트는 알데히드기 직접 셀룰로오스 1,2- 디 히드 록시 (글리콜) 그룹을 변환하는 종이 발견된다. 알데히드 그룹은 다당류 및 항체 (28) 사이에 공유 결합을 형성하기 위해 사용된다. 제조가 간단하지만, 완전히 요오드 산 나트륨을 세척하는 것은 어렵다. 미세 정 요오드 산 나트륨은 항체의 활성 및 안정성에 영향을 셀룰로오스 종이에 고정화 된 항체의 추가적인 산화를 일으킬 수 N을 -. (3- 디메틸 아미노 프로필) - N 다이이 미드 하이드로 클로라이드 및 N -hydroxysuccinimide 크로스 링커들도 사용되어 공유 나노 기반 분석 (29)의 발전을위한 전기 방사 폴리 L 락트산과 셀룰로오스 아세테이트 나노 파이버에 항체를 고정시킨다. 이 연구에서, 실란 커플 링 기술은 cellulos에 아민 작용기를 접목하는 데 사용전자 종이 디스크. 이 기술은 최대 세로 관류의 면역 있도록 원래의 기공 크기, 위킹 및 셀룰로스 여과지 여과 속도를 유지하도록 돕는다. 실란 커플 링 기술은 널리 다른 변형하여 생체이어서, 2 급 아민기를 갖는 기판의 표면을 기능화하는 바이오 센서에 사용되어왔다. 매트릭스 표면에 아민 기의 그 래프팅은 -OH 능성 실란 에이전트 그룹 및 매트릭스 기판 (30) 사이의 축합 반응을 포함한다. 셀룰로오스 종이 디스크 3- 아미노 프로필 트리 메 톡시 실란 (APS) 31 실란 커플 링에 의해 아민기로 작용 화 하였다. 이것은 두 가지 방법을 사용하여 공유 고정화 캡처 항체으로 이어졌습니다. 첫 번째 방법은 아민 관능 화 셀룰로스 페이퍼 디스크에 요오드 산화 캡쳐 항체의 결합을 포함했다. 두 번째 방법은 캡처 antibodi를 연결하는 가교 결합제로서 글루 타르 알데하이드를 사용아민 그룹 기능화 셀룰로오스 종이 디스크에 말이지. 포획 항체의 존재는, 형광 분자, 이미 저를 사용하여, 토끼 항 - 인간 IgG-형광 염료 (FITC)에 의해 확인 하였다. 항 - 토끼 IgG의 염소를 위해 토끼 항 - 인간 IgG-FITC의 결합 활성은 퍼 옥시 다제 기질로 평가 하였다. 과 요오드 산 나트륨, 글루 타르 알데히드 및 ​​포획 항체의 다양한 농도의 효과를 조사 하였다. 고정화 된 포획 항체의 애플리케이션 테스트가 성공적 IgG의 혈청의 검출을 수행 하였다.

<table><tbody><tr><td>셀룰로오스 여과지, 1등급(중간 흐름 여과지)</td><td>GE Healthcare Pte Ltd Singapore&nbsp;</td><td>1001 110</td><td></td></tr><tr><td>셀룰로오스 여과지, 113등급 (빠른 흐름 여과지)</td><td>Sigma-Aldrich, Singapore</td><td>1113-320</td><td></td></tr><tr><td>글루타알데히드</td><td>Sigma-Aldrich, Singapore</td><td>G6257</td><td>Grade II, H2O</td></tr><tr><td>계면활성제</td><td>Tween-20에서 25%, Sigma-Aldrich, Singapore</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 앨범&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Singapore</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>탈지 분유</td><td>Louis Fran&ccedil; 오이스&nbsp;</td><td></td><td>Kitchen Capers, Singapore</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>Sodium periodate</td><td>Merck</td><td>106597</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>106585</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>104873</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>CALBIOCHEM</td><td></td><td></td>567441</tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>106462</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PBS, 137&nbsp 함유; mmol/L NaCl, 2.7&nbsp; mmol/L KCl, 8.0&nbsp; mmol&#8288;/&#8288; L Na2HPO4 및 1.5&nbsp; mmol/L KH2PO4는 물로 준비하고 0.1&nbsp로 pH 7.4로 조정됩니다. mol / L NaOH 또는 0.1&nbsp; mol/L HCl</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>티 Hai Chem Pte Ltd 싱가포르</td><td>9005-68</td><td></td></tr><tr><td>TMB와 과산화수소 용액의 혼합물&nbsp;</td><td>1-Step ultra TMB-ELISA 솔루션, Thermo Scientific Pierce</td><td>34029</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human IgG-FITC</td><td>TWC/Bio Pte Ltd Singapore</td><td>sc-2278</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG</td><td>TWC/Bio Pte Ltd Singapore</td><td>sc-2030</td><td></td></tr><tr><td>Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc 코팅 항체</td><td>Bethyl Laboratories, Inc</td><td>A90-131A</td><td></td></tr><tr><td>Mouse reference 혈청</td><td>Bethyl Laboratories, Inc</td><td>RS10-101-5</td><td>9.5 mg/ml</td></tr><tr><td>HRP 접합 염소 안티-마우스 IgG-Fc 검출 항체</td><td>Bethyl Laboratories, Inc</td><td>A90-131P</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fourier 변환 적외선 분광 광도계</td><td>Shimadzu IR Prestige-21&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>형광 분자 이미저</td><td>Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>NUVE FN500</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>터보 믹서 VM-2000</td><td>MYC LTD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>RGB, 무료 다운로드</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

셀룰로오스 종이 디스크와 벌거 벗은 눈 색채 면역 측정법에 그들의 응용 프로그램에 항체의 결합 공유

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

이 보고서는 셀룰로오스 필터 종이 학년 1 위 (중간 흐름 여과지) 디스크 및 등급 번호 113 (빠른 흐름 여과지) 디스크에 캡처 항체의 공유 고정하는 두 가지 방법을 제시한다. 항체 그들에 고정되기 전에 이러한 셀룰로오스 종이 디스크는 실란 커플 링 기술을 통해 아민 작용기로 그래프트 하였다. 요오드 산 산화 및 글루 타르 알데히드 가교 방법은 셀룰로오스 종이 디스크에 포획 항체를 이식하는데 사용되었다. 고정화 후 목표물을 포획 항체의 최대 결합능을 보장하기 위해, 요오드 산 나트륨, 글루 타르 알데히드, 용지 디스크의 표면 상에 포획 항체의 다양한 농도의 영향을 조사 하였다. 요오 산화법에 비해 글루 타르 알데히드 가교제 통해 아민 - 작용 화 셀룰로스 페이퍼 디스크에 코팅 된 항체는 표적에 결합 활성을 강화 보였다. (마우스 혈청 참조)의 IgG는 글루 타르 알데히드를 통해 공유 적으로 고정화 된 항체의 애플리케이션을 테스트하기 위해이 연구를 기준 타겟으로서 사용 하였다. 새로운 종이 기반, 효소 면역 분석법 (ELISA)이 성공적으로 개발 및 IgG를 검출하기위한 검증 하였다. 이 방법은 장비를 필요로하지 않으며, IgG를 100 NG / ㎖를 검출 할 수있다. 고속 유동 여과지 매체 흐름 여과지보다 더 민감했다. 이 분석의 배양 기간은 짧았다 작은 샘플 볼륨이 필요합니다. 이 맨눈으로는 색채 면역 종래 ELISA로 식별되는 다른 대상을 검출하도록 확장 될 수있다.

<img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54111/54111fig3.jpg" /> 도 3 푸리에 치료 및 APS 처리 매체 흐름 필터 사각형 용지 (A) 및 고속 유동 필터 정사각형 종이 (B). (A)의 적외선 (FTIR) 스펙트럼을 변환. 미처리 매체 흐름 필터 사각형 종이의 스펙트럼은 APS 처리 매체가 흐르는 필터 사각형 종이의 것과 유사 하였다. 902-1,170 cm -1 1,210-1,500 cm -1 APS 처리 된 사각형 종이의 밴드에서 강도의 증가는 각각 SIOC-H 그룹의 Si-O-셀룰로오스 및 CH 변형를 지배했습니다. 1,650cm -1과 2,885cm -1에서 밴드의 증가는 각각 식염수 프로필 부분에서 -NH 2, CH...

이 원고에서는 종이 디스크에서 항체의 공유 고정을 위한 주기적 산화 및 글루타르알데히드 가교 방법이 제시되어 있습니다. 고정화된 항체의 결합 활성을 평가하였다. 이러한 결과를 바탕으로 글루타르알데히드 가교 방법을 사용하여 면역글로불린 G(IgG) 검출을 위한 새로운 종이 기반 면역 분석을 개발했습니다.

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

본 방법론의 전체적인 목표는 셀룰로오스 매트릭스 상에서 항체와 단백질을 안정화하여 현장 진단(point-of-care diagnostics)에 유용한 육안 색도 면역 분석법의 개발을 촉진하는 것입니다. 이 방법은 현장 진단 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 셀룰로오스 상에서 단백질을 안정화하는 것을 도와 저비용의 종이 기반 진단 분석법 개발을 가능하게 한다는 점입니다.시연은 저희 연구실의 학생인 Gloria Chang이 진행하겠습니다. 먼저, 1 cm x 1 cm 크기의 정사각형 종이 한 장을 준비하십시오. 또한, 펀치를 사용하여 직경 6.0 mm의 Whatman 1번 셀룰로오스 종이 디스크 100개를 준비하십시오.종이 디스크에 아미노기를 도입하려면, 흄 후드 내의 50 mL 유리 병에 1 mL의 APS와 10 mL의 아세톤을 혼합하십시오. 새로 준비한 APS 시약 혼합물에 종이 디스크를 넣습니다. 그런 다음 실온에서 궤도 교반을 하며 혼합물 내에서 디스크를 5시간 동안 배양하십시오.50 milliliter 유리 병에서 과량의 용액을 유기 폐기물 용기로 따라냅니다. 유리 병에 10 milliliters의 아세톤을 넣고 잘 섞은 후, 반응하지 않은 APS 및 기타 불순물을 제거하기 위해 완전히 따라냅니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.종이 디스크를 페이퍼 타월 위에 펼치고 110 °C 오븐에서 3시간 동안 가열합니다. 종이 디스크를 식힌 후, 50 mL 원심분리 튜브에 넣어 실온에서 보관합니다. 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)을 사용하여 셀룰로오스 사각 종이에 아민기가 접합되었는지 확인합니다.FTIR 분광 분석 소프트웨어를 실행합니다. 측정 초기화(measurement initialize) 메뉴로 이동합니다. 직사각형 아래의 데이터(data)를 선택하고 측정 모드에서 투과율(percent transmittance)을 선택합니다.그 다음 apodization으로 Happ-Genzel을 선택하고, scan 횟수는 45, resolution은 4.0으로 설정하며, 범위를 최소 400에서 최대 4,000으로 설정합니다. measure를 클릭한 후 배경 데이터를 위한 데이터 파일을 선택합니다. BKG를 클릭하여 배경의 베이스라인을 얻습니다.다음으로, 정사각형 종이를 필름 샘플 홀더에 고정합니다. 그런 다음 샘플 데이터를 위한 데이터 파일을 선택하고 'sample'을 클릭하여 샘플의 스펙트럼을 얻습니다. FTIR 분광법 애플리케이션을 종료하고 컴퓨터 전원을 끕니다.20 mL 유리병에 0.05% glutaraldehyde 용액 5 mL를 넣습니다. 여기에 아민 기능화된 중간 유속 여과지 디스크 15개를 담그고, 실온에서 1시간 동안 흔들어 줍니다. 동시에, 이 단계를 반복하여 알데하이드 기능화된 고속 유속 여과지 디스크 15개를 추가로 준비합니다.종이 디스크에서 반응하지 않은 글루타르알데하이드를 제거하려면, 먼저 중속 유속 여과지 디스크와 고속 유속 여과지 디스크를 각각 별도의 15 milliliter 원심분리 튜브에 넣습니다. 그런 다음 각 튜브에 5 milliliter의 탈이온수를 첨가하고 튜브를 10초 동안 흔들어 줍니다. 파이펫으로 흡입하여 물을 제거합니다.반응하지 않은 glutaraldehyde를 제거하기 위해 이 과정을 두 번 반복합니다. 그런 다음 37 °C 오븐에서 종이 디스크를 건조합니다. 건조가 완료되면, medium flow 필터 종이 디스크에는 0.025 mg/mL 마우스 IgG Fc fragment 항체 5 µL를 첨가하고, fast flow 필터 종이 디스크에는 8 µL를 첨가합니다.20분 동안 배양한 후, 항체를 제거하지 않은 상태에서 각 페이퍼 디스크에 50 millimolar PBS pH 7.4를 10 microliters씩 첨가합니다. 아민 알데하이드 반응을 위해 40분 동안 배양합니다. 페이퍼 타월 위에 놓인 페이퍼 디스크를 0.2 milliliters의 세척 버퍼로 세척합니다.세척 과정을 3회 반복합니다. 오븐에서 37 °C로 종이 디스크를 건조시킨 후, 상온에서 15 µL의 블로킹 버퍼(blocking buffer)로 10분 동안 종이 디스크를 블로킹합니다. 그다음, 종이 타월 위에 놓인 각 종이 디스크를 0.2 mL의 세척 버퍼(washing buffer)로 세척합니다.세척 과정을 3회 반복합니다. 다음으로, IgG 표준 물질을 분석합니다. 다양한 농도의 IgG 10 µL를 개별 디스크에 3회 반복하여 로딩합니다.실온에서 1시간 동안 배양합니다. 페이퍼 타월 위에 놓인 페이퍼 디스크를 0.2 milliliters의 세척 완충액으로 세척합니다. 이 세척 과정을 3회 반복합니다.세척 후, HRP가 접합된 mouse IgG Fc fragment 항체 10 µL를 로딩하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 종이 타월 위에서 0.2 mL의 세척 완충액으로 종이 디스크를 세척합니다. 이 세척 과정을 3회 반복합니다.마지막으로, TMB와 과산화수소 혼합물 10 µL를 각 디스크에 로딩합니다. 5분간 배양 후 디지털 카메라나 스마트폰으로 모든 종이 디스크의 이미지를 촬영하고, 텍스트 프로토콜에서 설명한 대로 분석합니다. 여기 제시된 것은 처리하지 않은 여과지와 APS 처리된 중간 유속 여과지 및 빠른 유속 여과지의 FTIR 스펙트럼입니다.중속 여과지의 902 및 1,170 cm⁻¹ 밴드와 1,210 내지 1,500 cm⁻¹ 범위의 강도 증가, 그리고 고속 여과지의 972 내지 1,180 cm⁻¹ 범위의 특징적인 피크는 APS가 셀룰로오스 종이에 성공적으로 그라프트 되었음을 보여주었습니다. 글루타르알데히드의 농도 차이가 종이 디스크 상의 IgG FITC 고정화에 미치는 영향이 여기에 제시되어 있습니다. 글루타르알데히드의 최적 농도는 0.05%입니다. 마찬가지로, IgG FITC의 농도 차이가 종이 디스크 상의 IgG FITC 고정화에 미치는 영향이 제시되어 있습니다.IgG FITC의 부하량과 농도를 높이면 종이 디스크에 고정되는 IgG FITC의 양이 증가합니다. 하지만 고정된 IgG FITC의 농도가 높아진다고 해서 항원과의 결합 능력이 향상되지는 않습니다. 여기에 종이 기반 ELISA를 통한 IgG 정량 분석을 위한 검정 곡선이 제시되어 있습니다.이 종이 기반 분석법을 통해 육안으로 1 ng/mL IgG 농도의 항체를 검출하였습니다. 각 단계를 1시간 동안 배양했을 때, IgG 혈청 농도는 0에서 500 ng/mL까지 비색 강도와 선형 관계를 나타냈습니다. 이 영상을 시청한 후에는 면역 분석법 개발을 위해 세포 매트릭스에 항체를 고정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.우리는 처음 민감도가 제한적인 저비용 진단 분석법을 개발하던 중에 이 아이디어를 얻었습니다. 개발 이후, 이 기술은 현장 진단 분야의 연구자들이 다양한 병원균에 대한 현장용 저비용 진단 테스트 개발을 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 동영상은 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 기법을 통해 화학적으로 접합된 항체-항원 복합체를 검출하는 방법을 보여줍니다. 포획된 항체는 항체-항원 접합체의 항원의 특이적 에피토프에 결합하며, 이는 나중에 효소 결합 2차 항체를 사용하여 시각화할 수 있습니다.

화학적으로 결합된 항체-항원 접합체를 검증하기 위한 효소 결합 면역흡착제 분석

이 비디오는 글루타르알데히드와 가교된 아민 기능성 셀룰로오스 디스크를 포함하는 종이 기반 면역 분석을 보여줍니다. IgG-Fc 특이적 포획 항체의 공유 고정화에 이어 면역글로불린 G 및 양고추냉이 과산화효소 접합 검출 항체를 도입하면 면역글로불린 G의 존재를 확인하는 색상 변화가 발생합니다.

면역글로불린 G 검출을 위한 종이 기반 면역 분석

이 프로토콜은 고래류의 미오글로빈에 강하게 반응하는 두 개의 IgG 클래스 단클론 항체(mAb)의 개발을 설명합니다. 이러한 mAb는 샌드위치 형식을 기반으로 하는 콜로이드 금 면역크로마토그래피 테스트 스트립에 적용되어 고래류의 Mb를 바다표범 및 다른 동물과 구별합니다.

고래 마이오글로빈의 검출을위한 콜로이드 골드 기반 면역 크로마토 그래피 테스트 스트립의 개발

나노 입자 기반 광학 프로브는 라만 및 UV-Vis 분광법을 사용하여 항원을 검출하기 위한 매개체로 설계되었습니다. 여기에서는 향후 다중화 기능을 통합하는 방식으로 UV-Vis/Raman 분광법 면역분석을 위해 이러한 프로브를 준비하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

자외선 VI와 라만 분광학 면역 플랫폼 제조

두 슬라이드를 간단 하 게 스냅 하 여 교차 reactivity 무료 다중화 샌드위치 immunoassays를 수행 하기 위한 스냅 칩 기술을 설명 합니다. 스냅 기구 시 약 microarray microarray에서 안정적으로 전송 하는 데 사용 됩니다. 어떤 생 화 확 적인 반응을 교차 오염 없이 다른 시 약의 colocalization를 요구에 대 한 스냅 칩을 사용할 수 있습니다.

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이 작은 동물에 반대로 탄수화물 항 체 순환의 분석에 대 한 인쇄 glycan 배열 (PGA) 기술의 잠재력을 보여줍니다.

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Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

소분자 화합물의 신속하고 정량적 검출을 위한 측면 흐름 면역크로모그래피 스트립 개발

이 프로토콜은 항원 검출을 위해 IgY 항체를 사용하여 분석용 라텍스 비드를 제조하는 방법론을 설명합니다.

달걀 노른자 항체를 기반으로 한 세포 측정 비드 분석의 표준화

긴급한 뎅기열 진단 요구 사항을 해결하기 위해 임상 혈청/혈액 샘플에서 뎅기열 NS1 항원 농도를 정량화하기 위한 스마트폰 앱 통합 뎅기열 NS1 종이 기반 분석 장치(DEN-NS1-PAD)를 소개합니다. 이 혁신은 자원이 제한된 환경에서도 다양한 의료 환경에서 임상적 의사 결정을 지원함으로써 뎅기열 관리를 향상시킵니다.

뎅기열 NS1 항원의 비색 및 정량적 검출을 위해 스마트폰 애플리케이션과 결합된 휴대용 종이 기반 면역분석

여기에서는 양자점 나노비드(QDNB)의 제조 및 QDNB 기반 측면 유동 면역분석 스트립을 사용한 질병 바이오마커 검출을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 테스트 결과는 UV 조명 아래에서 정성적으로 평가할 수 있으며 형광 스트립 리더를 사용하여 15분 이내에 정량적으로 측정할 수 있습니다.

Quantum Dots Nanobeads를 기반으로 한 형광 측면 유동 면역분석법

우리는 cell-free 합성 생물학의 원리와 인간 및 동물 혈청에서 항체 반응의 맞춤형 검출을 위한 dot-blot 기술을 기반으로 최근에 개발된 면역분석 플랫폼에 대해 설명합니다.

Cell-free Dot Blot은 인간 및 동물 혈청에서 항체 반응을 검출하기 위한 실용적이고 적응 가능한 면역분석 플랫폼입니다.

학습하세요 셀룰로오스 종이 디스크에 항체를 공유 결합 고정하는 방법을. 글루타르알데히드 가교 반응을 활용한 저비용 면역측정법으로 IgG 검출이 가능하며 현장 진단에 활용됩니다.

셀룰로오스 종이 디스크와 벌거 벗은 눈 색채 면역 측정법에 그들의 응용 프로그램에 항체의 결합 공유

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