쥐 소장 림프구의 분리 및 유세포 특성

이 절차의 전반적인 목표는 유세포 분석 또는 대체 특성 분석 수단에 사용할 수 있는 다른 소장 구획에서 단일 세포 집단을 분리하는 것입니다. 이 방법은 미생물총(microbiota)이 장 면역 체계의 발달에 어떤 영향을 미치는지와 같은 점막 면역학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 빠르고 재현 가능하며 힘든 percoll gradient가 필요하지 않다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 마우스의 등쪽을 아래로 향하게 놓고 복부에 70% 에탄올을 분사하고, 치골 교감에서 xiphoid 돌기까지 복부 정중선을 따라 피부를 순차적으로 절단하여 복막 근막을 절단하여 복막강을 노출시켜 개복강을 노출시키는 개복술을 수행합니다. 다음으로, 유문 괄약근을 횡단하여 소장과 위를 분리합니다. 복막에서 소장을 부드럽게 제거하고 장간막 지방을 떼어냅니다.

소장을 완전히 제거하려면 회장 접합부를 두 번 절개합니다. 세포 생존력을 최대화하기 위해 10% FBS를 함유한 섭씨 4도의 RPMI 배지에 분리된 소장을 놓습니다. 구부러진 집게를 사용하여 큰 지방 조각을 부드럽게 제거하고 이 과정에서 장 조직 자체가 찢어지지 않도록 주의하십시오.

장 내용물을 제거하려면 주사기에 부착된 18게이지 영양 바늘로 소장의 근위부 끝을 캐뉼레이션하고 15-20ml의 차가운 PBS로 장을 부드럽게 씻어냅니다. 가위를 사용하여 소장의 장내 쪽에 위치하며 다엽 모양의 흰색 덩어리로 나타나는 Peyer's Patches를 절제합니다. 그런 다음 5% FBS가 함유된 차가운 RPMI 배지에 넣습니다.

다음으로, 소장을 3-4인치 조각으로 자르고, RPMI를 적신 종이 타월로 각 소장 부분을 굴려 잔여 지방을 제거한 다음 둔한 메스를 사용하여 조직에서 지방을 떼어냅니다. 장간막 지방의 완전한 제거에 세심한 주의를 기울이는 것은 미세한 지방 조각으로도 세포를 죽일 수 있으므로 림프구의 생존력을 보장하는 데 매우 중요합니다. 그런 다음 구부러진 집게로 장 분절을 캐뉼링하고 조직의 말단 끝을 잡아 조직을 뒤집은 다음 한 쌍의 직선 집게를 사용하여 근위 끝에서 조직 분절을 부드럽게 제거하여 조직을 뒤집습니다.

조직 세그먼트를 30ml의 추출 매체와 교반 막대가 들어 있는 컵에 넣습니다. 뚜껑을 닫고 섭씨 37도에서 15분간 저어줍니다. 교반은 격렬해야 하지만 난류는 안 됩니다.

15분 후, 강철 여과기를 사용하여 탁하게 보여야 하는 상층액이 포함된 상피에서 조직 조각을 분리합니다. RPMI 배지에서 조직 조각을 수동으로 교반하여 잔류 추출 매체를 씻어냅니다. 그런 다음 조직을 마른 종이 타월에 놓고 여러 번 뒤집어 추출 매체에 의해 방출되지 않은 잔류 점액을 쉽게 제거할 수 있습니다.

그런 다음 조직 조각을 600마이크로리터의 소화 매체가 있는 1점 5밀리리터 튜브에 넣습니다. 조각이 더 이상 가위에 달라붙지 않고 용액이 균질하게 나타날 때까지 조직을 다집니다. 이 단계는 조직의 완전한 효소 분해를 보장하는 데 중요합니다.

조각이 더 이상 가위에 달라붙지 않고 용액이 균질해 보일 때까지 조직을 다지는 것은 세포 수율을 보장하고 결과의 재현성을 보장하는 데 매우 중요합니다. 25ml의 소화 매체가 들어 있는 컵에 다진 소장을 넣고 섭씨 37도에서 30분 동안 저어줍니다. 소화 과정의 중간쯤에 혈청학적 피펫으로 위아래로 파이프를 연결하여 큰 조직 덩어리를 분해하는 데 도움을 줍니다.

다음으로, 100마이크로미터 세포 여과기를 통해 소화 조직을 15ml 튜브로 여과합니다. 10% FBS가 함유된 20ml의 RPMI 배지로 스트레이너를 헹굽니다. 그 후, 여과된 용액을 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.

상등액을 조심스럽게 기울인 후 10% FBS를 함유한 1ml의 RPMI 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 다시 부유한 세포를 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 15ml 튜브로 여과합니다. 10% FBS가 함유된 RPMI 20ml로 여과기를 헹굽니다.

그 후, 여과된 용액을 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 디캔팅하고 2% FBS를 함유한 1ml의 RPMI 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 이 절차에서는 절제된 Peyer's Patches를 25ml의 소화 매체와 교반 막대가 있는 컵에 옮깁니다.

뚜껑을 단단히 닫고 섭씨 37도에서 10분 동안 돌립니다. 그런 다음 소화된 Peyer's Patches를 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 15ml 튜브에 여과합니다. 덩어리가 남아 있으면 1ml 주사기의 플런저의 평평한 끝을 사용하여 스트레이너를 통해 누릅니다.

그런 다음 FBS가 10% 함유된 10ml의 RPMI 배지로 스트레이너를 헹굽니다. 여과된 용액을 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 조심스럽게 디캔팅하고 2% FBS를 함유한 1ml의 RPMI 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

소장 림프구의 단일 세포 현탁액에 대한 유세포 분석을 통해 비장 세포와 유사한 전방 및 측면 산란 특성을 가진 세포의 개별 집단을 산출해야 합니다. 분리 초기 단계에서 조직이 섭씨 4도로 유지되지 않으면 림프구가 죽기 시작할 수 있으며, 그 결과 림프구 집단이 전방 산란이 낮아지고 다른 상피 세포 및 죽은 세포와 분리하기가 더 어려워집니다. 더욱이, 장간막 지방이 소장 조직에서 완전히 제거되지 않으면 림프구가 사실상 완전히 손실됩니다.

일반적으로 소장 LP 림프구에 대한 80%의 생존율을 얻을 수 있습니다. 일단 마스터하면 4개의 마우스를 처리하고 4시간 이내에 염색할 수 있는 단일 세포 현탁액을 준비할 수 있습니다. 이 과정에서 모든 장간막 지방을 완전히 제거하고 조직을 잘 다져 완전한 소화를 보장하는 것이 중요하다.

이 절차에 따라 단일 세포 현탁액은 en vitro 실험, 유전자 발현 분석 또는 채택 전달과 같은 유세포 분석 이외의 목적으로 사용하여 이러한 세포의 기능을 추가로 특성화할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 점막 면역학 연구자들이 생쥐의 장 면역 체계의 존재 발생 및 기능적 의미를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 장간막 지방을 청소하고, 상피층을 추출하고, 콜라겐 분해 효소로 조직을 소화하여 다른 소장 구획에서 단일 세포 현탁액을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.