광 안정성 시아닌 염료를 사용하여 파장 변환 DNA 혼성화 프로브의 합성

이 실험의 전반적인 목표는 한 염료 변형 DNA 가닥에서 다른 염료로 에너지 전달을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 분자 생물학 분야의 핵심 질문에 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어 살아있는 세포의 siRNA 처리 및 무결성을 실시간으로 모니터링하여 RNA 간섭을 수행합니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 형광이 닿고 색상 변화를 쉽게 모니터링 할 수 있어 명확한 결과를 얻을 수 있다는 것입니다. 따라서 거짓 긍정 결과가 제거됩니다. 이 절차를 시작하고 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 적절한 시약을 자기 교반 막대와 환류 콘덴서가 장착된 20ml의 둥근 바닥 플라스크에 추가합니다.

그런 다음 영점 0 6 밀리리터의 피 페리딘을 첨가하십시오. 그리고 반응 혼합물을 섭씨 80도에서 4시간 동안 가열합니다. 반응이 실온으로 냉각된 후 여과를 통해 생성된 침전물을 수집합니다.

그리고 디 에틸 에테르로 세 번 씻으십시오. 다음으로, 100 밀리리터의 디 에틸 에테르를 상층액에 첨가하십시오. 그리고 여과에 의해 생성 된 침전물을 수집합니다.

디 에틸 에테르로 세 번 세척 한 후, 침전물을 첫 번째 여과에서 분리 된 고체와 결합하십시오. DNA 합성기에 연결된 컴퓨터를 사용하여 원하는 DNA 염기서열과 결합 방법을 입력합니다. 제조업체 프로토콜의 프롬프트를 따릅니다.

다음으로, 첫 번째 면의 1마이크로 몰로 변형된 제어된 주입 유리가 포함된 컬럼을 신디사이저에 장착합니다. 이제 DNA 합성기에서 합성을 시작합니다. DNA 가닥의 정밀 검사 후, 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 적절한 리젠트를 다이에틸화된 알카인, 변형된 DNA 샘플에 추가합니다.

샘플을 섭씨 60도에서 1점 5시간 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 10ml 튜브로 옮깁니다. 실온으로 냉각한 후 150마이크로리터의 영점 0 5몰 EDTA 이나트륨 염 용액과 450마이크로리터의 영점 3몰 아세트산 나트륨 용액을 DNA 샘플에 추가합니다.

그런 다음 샘플에 10ml의 에탄올을 추가합니다. 그리고 섭씨 영하 32도에서 16시간 동안 유지하십시오. 다음으로, 1,000 번 G.It.It에서 15 분 동안 샘플을 원심 분리하십시오.

생성된 DNA 펠릿을 2밀리리터의 차가운 80% 에탄올로 세척합니다. 그런 다음 동결 건조기를 사용하여 감압된 압력으로 펠릿을 건조시킵니다. 260 나노 미터와 459 나노 미터의 염료를 확인하여 HP LC.Monitor로 조잡한 DNA 펠릿을 정제하십시오.

또는 염료 2의 경우 542 나노 미터. 두 파장 채널에서 흡수를 보여주는 분획을 수집합니다. 단일 가닥 흡수 분광법 측정의 경우, 200 밀리몰의 염화나트륨과 50 밀리몰의 인산나트륨 완충액만 포함하는 빈 측정값을 기록합니다.

다음으로, 미리 준비된 DNA1 용액을 1cm의 석영 유리 큐벳으로 옮깁니다. 흡수를 기록합니다. 그런 다음 염료 흡수의 최대 값을 결정하십시오.

단일 가닥 형광 분광법 측정의 경우, Dye one의 여기파 길이를 사용하여 200 밀리몰 염화나트륨과 50 밀리몰 인산나트륨만 포함하는 빈 측정값을 기록합니다. 그런 다음 DNA1 용액이 있는 큐벳을 분광계에 넣습니다. 형광 스펙트럼을 기록합니다.

이중 가닥, 형광 분광법 측정을 수행하려면 DNA1 및 DNA2 용액의 이중 가닥이 있는 큐벳을 분광계에 놓습니다. 그런 다음 Dye one의 여기파 길이를 사용하여 형광 스펙트럼을 기록합니다. 기록된 스펙트럼이 무엇을 보여주는지 더 잘 이해하려면 휴대용 UV 램프로 큐벳을 조사하십시오.

단일 DNA에서 이중 가닥 DNA로 형광 색상의 변화를 관찰하십시오. 기록된 흡수 스펙트럼은 단일 가닥 DNA1의 경우 465나노미터, 단일 가닥 DNA2의 경우 546나노미터의 최대값을 보여줍니다. DNA1 및 DNA2의 어닐링된 이중 가닥은 469 및 567 나노미터 모두에서 최대를 보여줍니다.

두 흡수 최대값 모두 bathaohromic shift를 보여줍니다. 그리고 가장 작은 분광 변화는 이중 나선 DNA 구조 내에서 염료 간의 흥분 상호 작용의 결과입니다. 해당 형광 스펙트럼은 단일 가닥 DNA1에 대해 537나노미터에서 최대값을 나타냅니다.

단일 가닥 DNA의 경우 607나노미터에서2. 그리고 615 나노 미터에서 DNA1 및 DNA2의 어닐링 된 이중 가닥. DNA1과 DNA2의 이중 가닥은 염료 1이 선택적으로 여기되지만 염료 2의 방출 최대치만 보여주며, 이는 에너지 전달이 염료 1에서 염료 2로 효율적으로 발생한다는 것을 입증합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 A면이 있는 알카인 표지 DNA 가닥의 몇 가지 촉매 반응에 의해 DNA를 합성적으로 변형하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.