Name: 광 안정성 시아닌 염료를 사용하여 파장 변환 DNA 혼성화 프로브의 합성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 배우세요 광 안정성 시아닌 염료를 이용한 DNA 혼성화 프로브 합성법을. 구리 촉매 클릭 화학으로 염료를 결합시켜 DNA 하이브리드화 시 형광 색 변화를 실시간 관찰할 수 있습니다.

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독일 연구 협회 (DFG, 1386 / 17-1 워싱턴)에 의해 재정 지원 연구 교육 그룹 (DFG에 의해 자금) GRK 2039 및 KIT는 기꺼이 인정한다.

주의 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 합성에 사용 된 화학 물질 중 일부는 독성 및 발암 성이다. 일반적으로, 실험실 코트를 입고 안전 안경, 장갑 등의 유기 화학 실험실에 필요한 모든 적절한 안전 방법을 사용하십시오. 염료의 1. 합성 . 두 염료가 반응 동일한 유형으로 합성 할 수있다 (2) 이러한 반응의 개요를 보여줍니다 :합니다. <ol><li> 1- (3- 아지도 프로필)의 합성 -4- (2- (1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 피리딘 -1- 윰 아이오다 이드 (염료 1) <ol><li> 1- (3- 아이오도 프로필) -4- 메틸 -1- 윰 아이오다 이드의 합성 (도 2a는, 단계 a) <ol><li> 녹여 466 mg의 4- 피 콜린 및 5.91 g 20 ML의 헤드 스페이스 바이알에 아세토 니트릴 10 ㎖에 1,3- diiodopropane 및 격벽 캡으로 단단히 밀봉. </li><li> 16 시간 동안 85 ° C까지 가열한다. </li><li> 그 후, RT로 냉각 회전 증발기를 사용하여 감압하에 용매를 제거 할 수있다. </li><li> 잔류 오일을 에틸 아세테이트 20 ㎖를 첨가하고 3 분 동안 120 W의 초음파 욕에서 혼합물을 처리한다. </li><li> 여과하여 형성된 침전물을 수집하고, 에틸 아세테이트로 5 회 세척 하였다. 진공 O의 /의 N에서 고체 제품을 건조시킵니다. </li></ol></li><li> 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 -1- 이움의 합성 (도 2a, b) 단계 <ol><li> 900 mg의 1- (3- 아이오도 프로필)을 20 ㎖ 헤드 스페이스 바이알에서 아세토 니트릴 12 ㎖ 중의 -4- 메틸 -1- 윰 아이오다 이드를 용해 나트륨 아 지드 376 ㎎을 추가하고, 격벽 캡으로 밀​​봉한다. </li><li> 16 시간 동안 85 ° C까지 가열한다. </li><li> 그 후, RT로 냉각 감압하에 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거 할 수있다. </li><li> 잔류 물에 디클로로 메탄 15 ML을 추가합니다. </li><li> 여과 제거하고, 생성 된 침전물을 버린다. </li><li> 썩어을 사용하여 감압하에 용매를 제거진 증발기 갈색 오일로서 생성물을 얻었다. </li></ol></li><li> 1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드의 합성 (도 2a를 참조하면, 단계 c) <ol><li> 불활성 기체 (아르곤) 하에서, 환류 응축기가 장착 된 플라스크 둥근 바닥 50 ml를 10 ml의 절대 디메틸 포름 아미드 1.45 g 인돌 -3- 카르 브 알데히드, 1.52 g의 탄산 칼륨 및 2.70 g의 디메틸 카보네이트를 녹인다. </li><li> 19 시간 동안 130 ℃에서 혼합물을 교반한다. </li><li> 다음, 실온으로 냉각 얼음의 혼합물을 부어 할 수 있습니다. </li><li> 수성 층을 150 ㎖의 에틸 아세테이트로 3 회 추출한다. </li><li> 유기 층을 합하여 물로 세척하고 황산나트륨상에서 건조하고이를 감압하에 회전 증발기를 사용하여 50 ℃에서 용매를 제거한다. </li></ol></li><li> 커플 링 1- (3- 아지도 프로필) -4- (2- (1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 피리딘 -1- 윰 아이오다 이드 (염료 1) (도 2a, 단계 d) <ol><li> 아르곤 하에서 수분의 배제에 따라 작업 할 수 있습니다. Dissol환류 응축기를 갖춘 플라스크 둥근 바닥 20 ㎖에 4 ㎖의 에탄올 중의 90 mg의 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 -1- 이움 및 48 mg의 1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드를했습니다. </li><li> 4 시간 동안 80 ° C로 0.07 ㎖의 피 페리 딘과 열을 추가합니다. </li><li> RT로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 여과하여 생성 된 침전물을 수집하고, 디 에틸 에테르로 3 회 세척 하였다. </li><li> 상층 액에 디 에틸 에테르를 추가하고 여과에 의해 생성 된 침전물을 수집합니다. 디 에틸 에테르로 3 회 씻는다. </li><li> 침전물을 결합합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 1- (3- 아지도 프로필)의 합성 -4- (2- (1- 메틸 -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드 (염료 2) <ol><li> 1- (3- 아이오도 프로필) -4- 메틸 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드의 합성 (도 2b는, 단계 a) <ol><li> 녹여 715 mg의 4- 메틸 퀴놀린 및 5.91 g 20 ML의 헤드 스페이스 바이알에 아세토 니트릴 10 ㎖에 1,3- diiodopropane 및 격벽 캡으로 단단히 밀봉. </li><li> 열16 시간 동안 85 ° C이다. </li><li> 그 후, RT로 냉각 감압하에 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거 할 수있다. </li><li> 남은 오일을 에틸 아세테이트 20 ㎖를 첨가하고 3 분 동안 120 W의 초음파 욕에서 혼합물을 처리한다. </li><li> 여과하여 형성된 침전물을 수집하고, 에틸 아세테이트로 5 회 세척 하였다. 진공 O의 /의 N에서 고체 제품을 건조시킵니다. </li></ol></li><li> 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 퀴놀린 -1- 이움의 합성 (도 2b를 참조하면, 단계 b) <ol><li> 900 mg의 1- (3- 아이오도 프로필)을 20 ㎖ 헤드 스페이스 바이알에서 아세토 니트릴 12 ㎖ 중의 -4- 메틸 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드를 용해 나트륨 아 지드 333 ㎎을 추가하고, 격벽 캡으로 밀​​봉한다. </li><li> 16 시간 동안 85 ° C까지 가열한다. </li><li> 그 후, RT로 냉각 감압하에 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거 할 수있다. </li><li> 잔류 물에 디클로로 메탄 15 ML을 추가합니다. </li><li> 여과 제거하고, 생성 된 침전물을 버린다. </li><li> 용매 유를 제거파인더 갈색 오일로서 생성물을 수득하는 회전 증발기를 사용하여 압력을 감소시켰다. </li></ol></li><li> 1- 메틸 -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드의 합성 (도 2b를 참조하면, 단계 c) <ol><li> 불활성 기체 (아르곤) 하에서, 환류 응축기가 장착 된 플라스크 둥근 바닥 50 ml를 10 ml의 절대 디메틸 포름 아미드 1.45 g -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드, 0.996 g의 탄산 칼륨 및 1.77 g의 디메틸 카보네이트를 녹인다. </li><li> 19 시간 동안 130 ℃에서 혼합물을 교반한다. </li><li> 다음, 실온으로 냉각 얼음의 혼합물을 부어 할 수 있습니다. </li><li> 수성 층을 150 ㎖의 에틸 아세테이트로 3 회 추출한다. </li><li> 유기 층을 합하여 물로 세척하고 황산나트륨상에서 건조하고이를 회전 증발기를 사용하여 감압하에 용매를 제거한다. </li></ol></li><li> 1- (3- 아지도 프로필)에 커플 링 -4- (2- (1- 메틸 -2- 프 피닐 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드 (도 2b를 참조하면, 단계 d) <ol><li> 인수에서 작업에 수분의 배제 아래. 플라스크 둥근 바닥 구비 한 20ml에 90 mg의 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 퀴놀린 -1- 이움 및 59.7 mg을 1- 메틸 -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 카브 알데하이드 4 ml의 에탄올에 녹여 환류 응축기. </li><li> 4 시간 동안 80 ° C로 0.06 ㎖의 피 페리 딘과 열을 추가합니다. </li><li> RT로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 여과에 의해 생성 된 침전물을 수집하고 디 에틸 에테르로 3 회 세척한다. </li><li> 상층 액에 디 에틸 에테르를 추가하고 여과에 의해 생성 된 침전물을 수집합니다. 디 에틸 에테르로 3 회 씻는다. </li><li> 침전물을 결합합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> DNA의 가닥 2. 합성 주 : DNA 합성기에서 M. Caruthers (11)에 의해 설명 된 것처럼 DNA 가닥의 합성은 고체상에서 포스 방법을 사용하여 수행된다. 신디사이저의 기능은 합성 절차 전에 테스트하고, 시약 경우 갱신됩니다필요한. <ol><li> Prearrangements <ol><li> amidite 희석제 (추가 건조 아세토 니트릴) 1.2 ㎖에 시판되는 2&#39;-O-프로 파르 길 - deoxyuridinephosphoramidite (CU)를 녹인다. 신디사이저의 유리 병에 유리 병에 솔루션을 이동 신디사이저로 조입니다. </li><li> 더 아르곤 가스 누출이 없음을 확인 (제조업체의 지침에 따라)는 &quot;누설 테스트&quot;를 수행합니다. 은 &quot;누설 테스트가&quot;실패하면 더 단단히 유리 병에 나사. </li><li> 고상 합성 챔버에 연결 튜브를 작성하여 프라임 구리 용액. </li><li> 아세토 니트릴로 모든 라인을 씻으십시오. </li></ol></li><li> DNA 가닥의 합성 <ol><li> 제조 업체의 프로토콜의 지시에 따라 DNA 서열과 결합 방법을 입력 연결된 컴퓨터를 사용합니다. CU를 빌딩 블록의 커플 링 공정은 통상 7 펄스를 40 초에 비해 (각 펄스가 16 μL 임) (7) 펄스 168 초 소요빌딩 블록으로서 포스. </li><li> 제 1베이스 1 μmol으로 수정 고상과 CPG (제어 세​​공 유리)를 포함하는 열을 탑재 신디사이저로 (DNA 합성은 &#39;5&#39;3에서 수행된다). </li><li> DNA의 합성 (11)의 합성을 시작합니다. </li></ol></li><li> 합성 된 DNA 가닥의 정밀 검사 <ol><li> 진공 O의 /의 N에서 합성 된 DNA 가닥과 열을 건조시킵니다. </li><li> 열을 열고 반응 유리 병에 CPG를 해제하기 위해 협공을 사용합니다. 올리고 뉴클레오티드를 탈 보호 및 CPG에서 DNA 가닥을 해제 농축 암모니아 수용액의 700 μl를 추가합니다. </li><li> 18 시간 동안 50 ° C까지 바이알을 닫고 붕괴되는 것을 방지하기 위해, 반응 용기에 보안 덮개를 적용하고, 가열. </li><li> 30 분 동안 30 ° C에서 감압 (100 밀리바)에서 원심 분리하여 암모니아를 제거합니다. </li><li> CPG에서 여과를 시작 원심 분리기 용기를 11,000 XG FO에R 3 분. 상등액을 취하여 0.45 ㎛의 세공 크기를 갖는 원심 분리 장치로 옮긴다. 4 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 한편 3 분 동안 11,000 XG에 20 초 원심 분리기의 CPG, 소용돌이에 두 번 증류수 300 μl를 추가합니다. 4 분 동안 1,000 XG에서 원심 장치와 원심 분리기에 뜨는을 전송합니다. 두 번이 세척 절차를 반복합니다. </li><li> 0.1 밀리바 25 ° CO / N에서 원심 분리하여 결합 된 수용액에서 물을 제거합니다. </li></ol></li></ol> 3. &quot;클릭&quot;절차 <ol><li> (0.1 [(1- 벤질 -1H- 1,2,3- 트리아 졸 -4- 일) 메틸] 아민 - 50 μL 이중 증류수, 나트륨 아스 코르 베이트 용액을 25 μL (물 중 0.4 M), 34 ㎕의 트리스 추가 DMSO의 M /을 tBuOH 3 : 아 지드의 1) 114 μL (0.01 DMSO에서 M /을 tBuOH 3 : 1) 및 테트라 키스 17 μL (아세토 니트릴), 구리 (I) 헥사 플루오로 포스페이트 용액 (0.1 DMSO에서 M /을 tBuOH 3 : 1) 동결 건조 된 알킨 변성 DNA 샘플이다. </l난&gt; <li> 1.5 시간 동안 60 ℃에서 샘플을 인큐베이션. </li><li> 실온으로 냉각. </li><li> 150 μL 나 2 EDTA (물에 0.05 M) 및 10 ML 튜브에 DNA 샘플 및 전송에 450 ㎕의 아세트산 나트륨 (물에 0.3 M)를 추가합니다. </li><li> 10 ml의 에탄올 (100 %)를 추가하고 16 시간 동안 -32 ℃에서 보관하십시오. </li><li> (15) 1000 XG에 분, 상층 액을 제거하기위한 원심 분리기 용기. </li><li> 2 ml의 차가운 에탄올 (80 %)와 DNA-펠렛을 씻으십시오. </li><li> 감압 건조 펠렛. </li></ol> 4. HPLC 정제 참고 : 분리하기 전에 DNA 가닥이 HPLC가 제대로 작동하는지 확인, 충분한 용매를 사용할 수 있으며 열은 깨끗합니다. 버퍼 / 아세토 니트릴의 시작 농도 열을 씻어. <ol><li> HPLC 바이알에 이중 증류수 및 전송의 250 μL의 원유 DNA-펠렛을 녹인다. </li><li> 염료 1 및 GRADI 대한 아세토 니트릴의 15 % 0 % 아세토 니트릴 구배로 45 분 HPLC 실행 시작<html> 염료 2의 아세토 니트릴 17 % 0 % 아세토 니트릴의 엔트는 260 나노 미터 (DNA 흡수) 및 459 nm의 (염료 1) 또는 542 nm의 (염료 2)를 확인하여 실행을 모니터링합니다. 두 파장 채널에서 흡수를 보여 그 분수를 수집합니다. </li><li> 3- 하이드 록시피 콜린 산 (3HPA) 및 diammoniumhydrogencitrate로 구성된 행렬을 이용하여 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI) 질량 분석에 의해 오른쪽 대량의 수집 분수를 확인합니다. <ol><li> 물에 diammoniumhydrogencitrate 용액 (100g / L)를 100 ㎕의 아세토 니트릴과 물의 혼합물을 1 : 1 포화 3-HPA 용액 900 μL를 혼합하여 매트릭스를 준비한다. </li><li> 대상의 DNA 프로브의 1-2 μl를 피펫 공기에 건조 할 수 있습니다. </li><li> 샘플로 3 HPA는 / diammoniumhydrogencitrate 행렬의 0.2 μl를 추가하고 결정화 될 때까지 섞는다. </li><li> MALDI 질량 분석을 수행합니다. </li><li> 오른쪽 질량을 전시하는 HPLC의 분수를 결합합니다. </li></ol></li></ol>농도의 _title &quot;&gt; 5. 결​​정 주 : 농도는 DNA 염기와 염료의 흡광 계수 (ε 260)에 근거하여 UV / 비스 분광하여 260 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정된다. <ol><li> 이중 증류수 200 μL - 100의 DNA를 녹여. </li><li> 자외선은 / 마주 분광 광도계에 DNA 용액 1 μL를 적용합니다. </li><li> 260 nm에서 흡광도를 측정한다. 세 번 반복합니다. </li><li> 용액의 농도를 계산하는 평균값을 가지고. 흡광 계수의 계산, 전체 DNA 가닥의 ε의 260 나노 미터를 얻기 위해 네 천연베이스 (12)의 ε 260 나노 미터 및 (천연 딘으로 간주) 구입 빌딩 블록 CU의 ε의 260 나노 미터 (12)를 사용한다. 염료 1, 사용 ε의 260 나노 미터 = 10,200 L를 들어 * 몰 -1 * cm -1 염료 2를 사용 ε의 260 나노 미터 = 13,100 L의 * 몰 &lt;SUP&gt; -1 * cm -1. 흡광 계수 측정 한 흡광도에 기초 램버트 - 맥주의 법칙 다음, 용액의 농도를 계산한다. 13 </li></ol> 6. 샘플 준비 및 분광학 <ol><li> 단일 가닥 샘플의 제조 <ol><li> 200 mM의 염화나트륨, 50 mM의 낮잠 내가 버퍼에서 수정 된 DNA1 및 DNA2 각각 2.5 μm의 솔루션을 개별적으로 1 ml의 pH는 7을 준비합니다. </li></ol></li><li> 이중 가닥 샘플의 제조 <ol><li> 반응 용기에 200 mM의 염화나트륨, 50 mM의 NAP 나 버퍼, pH가 7 DNA2 2.5 DNA1의 μM 2.5 μM을 함유 한 용액 1 ㎖를 준비한다. </li><li> 10 분 동안 90 ° C에 안전 캡과 열로 뚜껑을 고정합니다. 그리고 난방을 끄고 RT O / N로 냉각 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 흡광 주 : 형광 스펙 대 여기 파장을 결정하려면troscopy 흡수​​ 스펙트럼이 기록됩니다. <ol><li> 단일 가닥 측정 <ol><li> 200 mM의 염화나트륨, 50 mM의 낮잠 내가 버퍼, pH는 7이 포함 된 빈 측정을 기록합니다. </li><li> 1cm 석영 유리 큐벳에 DNA1 준비된 용액을 전송하고 흡수를 기록한다. 빈 데이터에 대한 측정을 수정합니다. 염료의 흡수 최대 값을 결정한다. </li><li> DNA2에 대해 반복합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 형광 분광법 <ol><li> 단일 가닥 측정 <ol><li> 200 mM의 NaCl을, 내가 버퍼 50 mM의 낮잠을 포함하는 빈 측정을 기록, 산도 = 7; 염료 (1)의 여기 파장을 사용. </li><li> 1cm 석영 유리 큐벳에 DNA1 용액을 전송. </li><li> 형광 스펙트럼을 기록합니다. </li></ol></li><li> 두 가닥 측정 <ol><li> 석영 유리 큐벳에 이중 가닥 용액을 전송. </l난&gt; <li> 염료 (1)의 여기 파장을 이용한 형광 스펙트럼을 기록한다. </li></ol></li></ol></li><li> 시각화 실험 주의 : 적절한 눈 보호는 눈에 자외선 손상을 방지하기 위해 착용한다! <ol><li> , 기록 된 스펙트럼이 표시 무엇의 더 나은 이해를 얻을 휴대용 자외선 램프 (그림 5)와 큐벳을 조사합니다. 이중 가닥 DNA에 하나의 형광 색상의 변화를 관찰한다. </li></ol></li></ol>

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<li>Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Duplex+Stability+for+Wavelength-Shifting+Fluorescent+DNA+Probes%3A+Energy+Transfer+vs+Excition+Interactions+in+DNA+%26%2334%3BTraffic+Lights%26%2334%3B%2C+Photochem%5BTitle%5D)+AND+%22Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA &#34;Traffic Lights&#34;, Photochem.</a> Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).</li>
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이 프로토콜은 아 지드 수정 형광 염료에 의해 CuAAC 통해 DNA 후 합성 레이블의 전체 과정을 보여줍니다. 이 염료 및 알킨 변성 DNA의 합성뿐만 아니라, 표시 순서를 포함한다. 염료의 합성은 네 단계를 따른다. 모든 제품은 그들의 양전하로 비교적 간단 침전에 의해 수득 할 수 있고 시간 소모적 컬럼 크로마토 그래피는 필요하지 않다. 중앙 커플 링 단계 이전에 아 지드 기능의 도입은 네 대신 5 개의 연속 반응 단계에 염료의 합성을 단축. 1,3- diiodopropane 대신 알킬화 공정은 아펠 반응 및 요오 작용기로 수산기 함수 변환 다음 Finkelstein 반응을위한 3 iodopropanol의 적용을 회피 하였다. 게시 된 절차에 비해 이러한 변화는 우리가 더 큰 규모와 시간의 짧은 기간에 염료를 합성 할 수 있습니다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt;인가 염료는 우수한 광 안정성 아니라 고상 DNA 합성 및 후 처리시 ...

분자 이미징은 살아있는 세포 내에서 생물학적 과정을 이해하기위한 기본적인 기술을 나타냅니다. 1-3 화학적 생물학적 응용 프로그램에 대한 형광 핵산 ​​기반 프로브의 개발이 확대 연구 분야가되고있다. 이 형광 프로브는 세포 이미징에 적합한 도구가 될 몇 가지 요구 사항을 충족해야합니다. 첫째, 적용 염료가 높은 양자 수율과 형광을 전시한다, 큰 스톡스 &#39;변화는, 그리고 가장 중요한 것은, 높은 photostabilities는 생체 내 이미징의 장기를 허용합니다. 그리고 둘째로, 그들은 신뢰할 수있는 형광 판독을 표시해야합니다. 종래 발색단 소광-시스템은 형광 농도의 간단한 변경에 의해 하나의 형광 색의 판독에 기초한다. (4)이 접근법으로 인해 세포 내 성분 또는 낮은 신호대 잡음비의 형광도에 위양성 혹은 위음성 결과의 위험을 부담 때문에 다른 COM에 의해 원치 않는 담금질에ponents. 4 최근 개의 상이한 발색단을 사용하여 이중 형광 색 판독을 표시 &quot;DNA 신호등&quot;의 개념을보고 하였다. 5-6 개념은 형광 변화 셉터 염료 도너 염료의 에너지 전달 (ET)에 기초 컬러 (도 1 참조). 이는보다 안정적인 판독이 가능하여 형광 이미징 프로브를위한 강력한 도구를 제공합니다. 형광 염료를 가진 올리고 뉴클레오티드 라벨링 두 가지 방법에 의해 달성 될 수있다. 염료는 상응하는 개질 된 포스 빌딩 블록을 사용하여 고상에서 화학적 DNA 합성 동안 혼입 될 수있다. (7)이 메소드는 표준 포스 탈 보호 조건 하에서 안정한 염료로 제한된다. 대안으로, 사후 합성 수정 방법은 올리고 뉴클레오티드 화학에 설립되었다. 여기, 우리는 우리의 새로운 사진 중 하나의 합성을 보여테이블 에너지 전달 쌍 8,9 및 아 지드와 알킨 (CuAAC) 사이의 구리 촉매 1,3- 사이클로을 사용하여 DNA의 후 합성 라벨. (10)

<table><tbody><tr><td colspan = "4">< 강>합성< / 강></td></tr><tr><td>4-Picoline</td><td>시그마 Aldrich</td><td>239615</td><td></td></tr><tr><td>1,3-Diiodopropane</td><td>시그마 Aldrich</td><td>238414</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td>HPLC 등급</td></tr><tr><td>에틸 아세테이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>10456870</td><td>기술 등급</td></tr><tr><td>아지드 나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>71290</td><td>p.a. 등급</td></tr><tr><td>디클로로메탄</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>10626642</td><td>기술 등급</td></tr><tr><td>인돌-3-카르복스알데히드;98%</td><td>ABCR</td><td>AB112969</td><td></td></tr><tr><td>탄산칼륨, 99+%</td><td>아크로스</td><td>424081000</td><td></td></tr><tr><td>디메틸카보네이</td>트 <td>시그마 알드리치</td><td>517127</td><td></td></tr><tr><td>N,N-디메틸포름아미드, 99.8 %, 분자체</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td></td></tr><tr><td>황산 나트륨</td><td>Bernd Kraft</td><td>12623.46</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 99.5 %</td><td></td> <td>397690010</td><td></td></tr><tr><td>피 페리 딘, 99 %</td> <td>147181000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Fisher Scientific</td><td>10407830</td><td>기술 등급</td></tr><tr><td>2- 페닐 인돌 -3- 카르 복스 알데히드; 97 %</td><td>ABCR</td><td>AB125050</td><td></td></tr><tr><td>4-메틸퀴놀린</td><td>ABCR</td><td>AB117222</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">DNA synthesis</td></tr><tr><td>Expedite 8909 핵산 합성제</td><td>Applied Biosystems</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dA(bz) 포스포라미다이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>A111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dT 포스포라미다이트</td><td>시그마 알드리치</td><td></td><td></td>T111081</tr><tr><td>DMT-dG(dmf) 포스포라미다이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>G11508</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dC(bz) 포스포라미다이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>C11108</td><td></td></tr><tr><td>DNA 합성을 위한 아미다이트 희석제</td><td>시그마 알드리치</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>DNA 합성을 위한 초순수 아세토니트릴</td><td>시그마 알드리치</td><td>L010400</td><td></td></tr><tr><td>캡 A</td><td>시그마 알드리치</td><td>L840000</td><td></td></tr><tr><td>Cap B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L850000</td><td></td></tr><tr><td>CPG dT 칼럼 1.0&nbsp; &마이크로; 두더지</td><td>Proligo 시약</td><td>T461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dA(bz) 열 1.0&nbsp; &마이크로; 두더지</td><td>Proligo 시약</td><td>A461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dG(ib) 열 1.0&nbsp; &마이크로; 두더지</td><td>Proligo 시약</td><td>G461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dC(bz) 칼럼 1.0&nbsp; &마이크로; 암</td>모니아 (수용액)<td>C461010</td><td></td>몰 <td>Proligo 시약</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fluka Analytical</td><td>318612</td><td></td></tr><tr><td>원심 장치 나노셉 0.45&nbsp; &마이크로; m</td><td>Pall</td><td>ODGHPC34</td><td></td></tr><tr><td>5-(벤질티오)-1H-테트라졸(활성제)</td><td>시그마 알드리치</td><td>75666</td><td></td></tr><tr><td>2'-O-프로파르길 데옥시우리딘포스포라미다이트</td><td>화학 유전자</td><td>ANP-7754</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">workup</td></tr><tr><td>vacuum concentrator</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>clicking procedure </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이</td>트 <td>시그마 알드리치</td><td>346276</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>(+)-L-아스코르브산</td><td>나트륨 시그마 알드리치</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 다이소듐 염</td><td>시그마 알드리치</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TBTA-리간드</td><td>&nbsp;-</td><td>&nbsp;-</td><td>문헌 절차에 따라 합성1</td></tr><tr><td colspan="4">HPLC</td></tr><tr><td>HPLC-system</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-Biflex-IV 분광계</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-318 C18 column</td><td>Supelcosil via Sigma Aldrich</td><td>58368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">농도 결정</td></tr><tr><td>ND 1000 분광 광도계</td><td>nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">sample 준비 및 분광학</td></tr><tr><td>Cary 100 Bio</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromax-3 형광계</td><td>Jobin-Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.</td></tr></tbody></table>

광 안정성 시아닌 염료를 사용하여 파장 변환 dna 혼성화 프로브의 합성

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

이 프로토콜에서는 2&#39;- 알킨의 합성 방법은 포스 표준 화학을 사용하여 자동화 고상 합성에 의해 디옥시리보 핵산 (DNA) 가닥을 변성 보여준다. 올리고 뉴클레오티드 후 합성 구리 촉매 클릭 화학 제를 사용하여 두 개의 새로운 광 안정성 시아닌 염료로 표시되어 있습니다. 모두 도너와 억 셉터 염료의 합성을 설명하고, 세 개의 연속 단계로 수행된다. 이들은 혼성화에 접할 때 주변 구조와 같은 DNA,이 두 염료의 에너지 전달을 겪는다. 따라서, 두 개의 단일 가닥의 DNA 가닥의 어닐링 형광 색의 변화에​​ 의해 가시화된다. 이 색상 변화는 형광 분광 특징뿐만 아니라, 직접적으로 휴대용 자외선 (UV) 램프를 이용하여 관찰 할 수있다. 이중 색상 형광 판독 값의 개념은 이러한 올리고 뉴클레오티드 프로브를 분자 이미징 특히 기재된 포위한 우수한 툴을 만든다tostable 염료가 사용된다. 이에 따라, 이미징 프로브 광표백은 방지되고, 생물학적 과정은 긴 시간주기 동안 실시간으로 관찰 할 수있다.

도 4에 도시 된 바와 같이, 단일 및 이중 가닥 DNA의 흡수 및 형광 스펙트럼을 기록한다. 기록 된 흡수 스펙트럼 (그림 4 오른쪽) 단일 가닥 DNA1 (염료 1) 및 단일 가닥 DNA2 (염료 2)에 대한 546 nm의 465 nm에서 쇼 흡수 최대의 λ 최대. 어닐링 DNA1_2 (염료 1 염료 2) 469 nm 내지 567 nm의 모두에서 최대 값을 보여줍니다. 모두 최대 흡수는 장파장 이동, 염료 1 4 nm의 이러한 작은 분광 변화가 이중 나선 DNA 구조 내에서 염료 사이의 엑시톤 상호 작용의 결과 염료 2에 대한 21 나노을 보여줍니다. 하나를위한 607...

광안정 시아닌 염료는 올리고뉴클레오티드에 부착되어 에너지 전달에 의한 혼성화를 모니터링합니다.

광 안정성 시아닌 염료를 사용하여 파장 변환 DNA 혼성화 프로브의 합성

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

이 실험의 전반적인 목표는 염료가 수식된 한 DNA 가닥에서 다른 가닥으로의 에너지 전달을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 살아있는 세포 내에서 siRNA의 처리 과정과 무결성을 실시간으로 모니터링하여 RNA 간섭과 같은 분자생물학 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 형광의 확산과 색 변화를 쉽게 모니터링할 수 있어 결과가 명확하다는 것입니다. 따라서 위양성 결과가 제거됩니다. 이 절차를 시작하려면, 텍스트 프로토콜에 명시된 적절한 시약을 마그네틱 교반 바와 환류 냉각기가 장착된 20 milliliter 라운드 바텀 플라스크에 첨가하십시오.그런 다음, piperidine 0.06 mL를 첨가합니다. 그리고 반응 혼합물을 80 °C에서 4시간 동안 가열합니다. 반응액이 상온으로 식으면, 여과를 통해 생성된 침전물을 수집합니다.이후 디에틸 에테르로 3회 세척합니다. 다음으로, 상층액에 100 mL의 디에틸 에테르를 첨가합니다. 그리고 생성된 침전물을 여과하여 수집합니다.디에틸 에테르로 3회 세척한 후, 침전물을 1차 여과에서 분리한 고형분과 합칩니다. DNA 합성기와 연결된 컴퓨터를 사용하여 원하는 DNA 서열과 커플링 방법을 입력합니다. 제조사의 프로토콜에 따른 안내 지침을 따릅니다.다음으로, 1 µmol의 첫 번째 face로 변형된 controlled pour glass가 포함된 컬럼을 합성기에 장착하십시오. 이제 DNA 합성기에서 합성을 시작합니다. DNA 가닥의 워크업(workup) 후, 텍스트 프로토콜에 명시된 대로 디에틸화된 알카인(diethylized alkyne)으로 변형된 DNA 샘플에 적절한 시약을 첨가하십시오.시료를 60 °C에서 1.5시간 동안 배양합니다. 그 후, 시료를 10 mL 튜브로 옮깁니다. 상온으로 냉각한 후, DNA 시료에 0.05 M EDTA disodium salt 용액 150 µL와 0.3 M sodium acetate 용액 450 µL를 첨가합니다.이어서 샘플에 ethanol 10 milliliters를 첨가합니다. 그리고 -32 °C에서 16시간 동안 보관합니다. 다음으로 샘플을 1000 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다. 완료되면 상층액을 제거합니다.결과물인 DNA 펠렛을 2 mL의 차가운 80% ethanol로 세척합니다. 그 다음 동결 건조기를 사용하여 감압 상태에서 펠렛을 건조합니다. HPLC를 통해 조 DNA 펠렛을 정제합니다. 260 nm와 Dye one의 459 nm를 확인하여 분석 과정을 모니터링합니다.또는 Dye two의 경우 542 nanometers를 사용합니다. 두 파장 채널 모두에서 흡수를 보이는 분획을 수집합니다. 단일 가닥 흡수 분광 측정의 경우, 200 millimolar sodium chloride와 50 millimolar sodium phosphate buffer만 포함된 블랭크 측정값을 기록합니다.다음으로, 앞서 준비한 DNA1 용액을 1 cm 쿼츠 유리 큐벳으로 옮깁니다. 흡광도를 기록한 후, 염료 흡광도의 최대값을 결정합니다.단일 가닥 형광 분광 측정의 경우, Dye one의 들뜸 파장을 사용하여 200 millimolar 염화나트륨과 50 millimolar 인산나트륨만 포함된 공시료(blank) 측정값을 기록합니다. 그 다음, DNA1 용액이 담긴 큐벳을 분광광도계에 넣습니다. 형광 스펙트럼을 기록합니다.이중 가닥 형광 분광 측정법을 수행하려면, DNA1 및 DNA2 이중 가닥 용액이 담긴 큐벳을 분광계에 넣으십시오. 그다음 Dye one의 들뜸 파장을 사용하여 형광 스펙트럼을 기록하십시오. 기록된 스펙트럼이 나타내는 내용을 더 잘 이해하려면, 휴대용 UV 램프로 큐벳을 조사하십시오.단일 가닥 DNA에서 이중 가닥 DNA로 변함에 따른 형광 색상의 변화를 관찰하십시오. 기록된 흡수 스펙트럼을 보면 단일 가닥 DNA1은 465 nanometers에서, 단일 가닥 DNA2는 546 nanometers에서 최대치를 나타냅니다. 어닐링된 DNA1과 DNA2의 이중 가닥은 469 nanometers와 567 nanometers 모두에서 최대치를 나타냅니다.두 흡수 극대값 모두 장파장 이동(bathochromic shift)을 보입니다. 그리고 가장 작은 분광학적 변화는 이중 나선 DNA 구조 내 염료 간의 엑시톤 상호작용(excitonic interactions)의 결과입니다. 그에 해당하는 형광 스펙트럼은 단일 가닥 DNA1에 대해 537 nanometers에서 극대값을 나타냅니다.단일 가닥 DNA2의 경우 607 nanometers에서, 그리고 어닐링된 DNA1과 DNA2의 이중 가닥의 경우 615 nanometers에서 나타납니다. DNA1과 DNA2의 이중 가닥에서는 Dye one이 선택적으로 여기되었음에도 불구하고 오직 Dye two의 최대 방출 파장만이 관찰되며, 이는 Dye one에서 Dye two로 에너지 전달이 효율적으로 일어남을 입증합니다.이 영상을 시청하고 나면, A 측면을 가진 알카인 표지 DNA 가닥의 몇 가지 촉매 반응을 통해 DNA를 합성적으로 수정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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