히트의 예방에 의한 흰쥐의 반작용을 스트레스 고초균 스트레인

우리는 유익한 박테리아로 경구 전처리를 통해 쥐의 열 스트레스 영향을 예방하기 위한 프로토콜을 설명했습니다. 이 프로토콜은 다양한 투여 경로 및 다양한 화합물의 분석에 수정 및 사용할 수 있습니다.

이 실험의 전반적인 목표는 열 스트레스 후 합병증에 대한 B.subtilis BSB3 균주의 예방 효과를 평가하는 것입니다. 이 방법은 열 스트레스로 인한 부작용을 예방하는 데 있어 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 열 스트레스의 합병증을 완화하기 위한 다양한 접근 방식을 평가하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 Ludmila Globa입니다. 그리고 우리 연구실의 연구원인 Oleg Pusovyy. 우선, 영양 한천 플레이트에서 밤새 자란 Bacillus subtilis BSB3의 단일 식민지

플라스크에 영양 육수 10ml를 접종합니다. 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 문화를 키울 수 있습니다. 여기에 표시된 조리법에 따라 500ml의 포자 형성 배지를 준비합니다.

그리고 섭씨 121도에서 20분 동안 오토클레이브합니다. 다음 멸균 용액을 추가하기 전에 배지를 섭씨 50도까지 냉각시키십시오. 멸균 캐비닛에서 준비된 매체를 실온에서 섭씨 40도까지 20분 동안 냉각합니다.

그리고 20개의 멸균 페트리 접시 각각에 25ml를 붓습니다. 매체가 밤새 굳어지도록 합니다. 다음으로, 하룻밤 사이에 배양된 Bacillus subtilis BSB3 배양 0.5ml를 포자 형성 배지 플레이트의 표면에 펴 바릅니다.

90%포자가 형성될 때까지 5일 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 고해상도 현미경을 사용하여 위상 밝기 포자를 확인합니다. 박테리아를 채취하려면 플레이트에 PBS 1ml를 추가하고 멸균 세포 스프레더를 사용하여 표면에서 박테리아를 긁어냅니다.

필요할 때까지 서스펜션을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 포자 형성 배지 플레이트에 박테리아 현탁액의 적절한 희석액을 0.1 ml로 도금하여 박테리아의 생존 능력을 확인하고 섭씨 37도에서 18-24 시간 동안 배양합니다. 콜로니 카운터를 사용하여 박테리아 콜로니를 계수하고 테스트된 현탁액에서 박테리아의 역가를 계산합니다.

그런 다음 PBS에서 밀리리터당 8번째 CFU의 1 곱하기 10의 최종 농도로 박테리아 현탁액을 준비합니다. 2일 동안 B.subtilis BSB3 또는 PBS로 구강 배기로 쥐를 치료한 후 동물을 세분화하고 체온을 측정한 후 그룹 1과 2의 쥐를 실온에서 25분 동안 유지합니다. 3군과 4군의 동물을 섭씨 45도, 상대 습도 55%의 기후 챔버에 25분 동안 두세요.

각 쥐의 직장 온도를 다시 측정 한 후 모든 동물을 4 시간 동안 실온에 두십시오. 그런 다음 동물을 안락사시키고, 줄기 혈액을 채취하고, 텍스트 프로토콜에 따라 장기를 분리한 후 각 장기 샘플을 미리 계량된 멸균 튜브에 넣고 무게를 잰다. 각 튜브에 멸균 PBS를 추가하여 샘플의 부피 희석당 1-10 중량을 얻고 멸균 유리 조직 균질기를 사용하여 균일한 조직 현탁액을 생성합니다.

다음으로, 멸균 PBS를 사용하여 각 시료를 연속 희석합니다. 그런 다음 모든 희석액 0.1ml를 MacConkeys와 5%혈액 한천 표면에 도금합니다. 그리고 브루셀라 혈액 한천과 헤민과 비타민 K1. 플레이트를 배양한 후 콜로니 카운터를 사용하여 각 플레이트 그룹의 콜로니를 계산합니다.

결과를 조직 1g당 집락 형성 단위(CFU)의 수로 표현합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 소장의 일부를 준비하고 염색한 후 고해상도 현미경을 사용하여 장 융모와 총 점막 벽 두께를 측정합니다. 각 쥐에서 최소 4개의 샘플을 분석하고 각 샘플에서 최소 20개의 측정을 수행합니다.

혈액 샘플에 대한 고해상도 광학 현미경 검사를 수행하려면 비디오 카메라와 컴퓨터가 있는 현미경 시스템의 기반으로 진동 차단 플랫폼을 사용하여 실시간 이미지를 기록하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 테스트 이미지를 보정한 후, 각 쥐에서 갓 채취한 혈액 7마이크로리터를 유리 슬라이드에 놓고 커버슬립을 추가합니다. 그런 다음 각 샘플에 72 x 53.3마이크로미터 제곱의 이미지 프레임 10개를 촬영하고 기록합니다.

마지막으로, 고해상도 직접보기 광학 이미지를 실시간으로 제공하는 소프트웨어를 사용하여 소포의 농도를 측정합니다. 열 스트레스 전과 직후 동물의 평균 체온은 각각 섭씨 36.7도 ±07도, 섭씨 40.3도 ±0.17도였다. 쥐를 열에 노출시키면 융모 높이와 총 점막 두께가 현저히 억제되었습니다.

그러나 스트레스 전에 BSB3 균주로 치료하면 열의 유해한 영향으로부터 장을 보호할 수 있습니다. 장에서 박테리아의 전좌를 위해 장간막 림프절, 간 및 비장을 분석했습니다. 여기에 예시된 바와 같이, 박테리아는 열에 노출된 PBS 처리된 쥐의 장간막 림프절 및 간에서 채취한 샘플에서만 조직 1g당 2개의 CFU에 대해 1.7 곱하기 10 곱하기 4.6 곱하기 10의 농도로 분리되었습니다.

반면에, BSB3 균주를 투여받은 대조군 및 열 스트레스 동물의 모든 테스트 샘플은 불임 상태였습니다. 열 스트레스를 받은 쥐에서 IL 1beta, IL-6, TNFalpha 또는 인터페론 감마 사이토카인 수치의 변화는 등록되지 않았습니다. 그러나 열처리 전에 PBS 처리 동물에서 IL-10 및 LPS 수치가 상승했습니다.

따라서 B.subtilis BSB3 전처리는 열처리 후 혈청 내 IL-10 및 LPS의 상승을 방지했습니다. 마지막으로, 열 스트레스 전에 PBS를 투여받은 쥐의 혈액에서는 유리 소포 농도의 유의한 증가가 발견되었지만, BSB3 처리된 동물에서는 그렇지 않았습니다. 혈액 채취 및 정밀도를 위해 발열성 물질을 사용하는 것을 기억하고 혈청 액체를 섭씨 영하 20도로 유지하고 반복적인 동결 및 해동을 수행하고 박테리아 전좌를 분석하는 동안 멸균 절차를 따르는 것이 중요합니다.

열 스트레스의 합병증에 대한 추가 질문에 답하기 위해 열 스트레스 후 박테리아 투여와 같은 이 절차를 수행할 수 있습니다.