Name: 생존 시간의 측정에 Brachionus 로티퍼 : 산모 조건의 동기화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: 학습하세요 Brachionus 로티퍼의 생존 시간 측정 방법을 산모 조건 동기화를 통해 정확하게 측정하는 기술입니다. 이 프로토콜은 노화 연구와 생태독성학 연구에서 높은 재현성과 통계적 검정력을 제공합니다.

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우리는 촬영에 그들의 도움을, 조지 자비스, 마사 복, 그리고 베티 Hecox - 레아, 해양 생물 연구소에 감사하고 있습니다.

미디어의 1. 준비 참고 : 사용에게 염분 16.5 PPT (PSU)의 반 희석 Brujewicz 인공 해수를. 다른 인공 seawaters도 자주 문화 Brachionus의 로티퍼 (25), (26)에 사용된다. <ol><li> 454 mM의 염화나트륨을 추가, 26 밀리미터의 MgCl 2, 27 mM의 황산, 10 밀리미터의 KCl, 증류수 10 mM의 CaCl2를 4.5 L은 (최종 부피 5 L 될 것입니다). 또한, 탈 희석 물 대신에 증류수를 사용합니다. 다른 모든 염을 용해 후 CaCl2를 추가합니다. </li><li> 0.48 M의 NaHCO3 원액 (200 배 농도)를 준비합니다. 상기 용액에 25 ML을 추가합니다. NaHCO3을 최종 농도가 2.4 mm이다. </li><li> 0.4 M NaBr은 원액 (500 배 농도)를 준비합니다. 상기 용액에 10 ㎖를 추가합니다. NaBr은 최종 농도가 0.8 mm이다. 증류수로 5 L까지합니다. </li><li> 0.45 ㎛ 멤브레인 필터 솔루션 필터.사용하기 전에 그것을 멸균 수로 2 회 희석 (v / v)로. 참고 :이 원액으로 Brujewicz 인공 해수의 2 배 농도를 할 수있다. </li></ol> 2. 일반 문화 조건 <ol><li> 문화 실험실 제기 또는 20 및 30 °의 C 사이의 멸균 100 ㎖ 비이커에 야생 캡처 로티퍼. 높은 온도는 더 짧은 수명 가속 재생을 초래한다. 실험의 편의를 위해 25 ° C를 사용합니다. 로티퍼 밀도 또는 인공 해수의 부피는 여기에 큰 문제가되지 않습니다. </li><li> 인공 해수 (11) 문화식이 미세 조류 종. 스넬 등의 알을 참조하십시오. (2014) 자세한 내용은 11. 일반적으로, Tetraselmis의 tetrathele 사용 (~ 2 × 10 5 세포 / ㎖ 27,28), T. suecica (~ 6 × 10 5 세포 / ㎖ 25,29), 및 Nannochloropsis의 oculata (~ 7 × 10 6 세포 / ㎖ 30, 31). 다이어트 조류 때문에 (종, 문화 CONDIT이온, 생화학 적 조성물은) 상당히 모든 실험군에서 microalga 같은 많이 사용, Brachionus의 로티퍼의 생존 기간에 영향을 미친다. </li><li> 먹이 (예를 들어, 2 일마다 먹이를 매주 접종) 가끔 미디어를 변경하여 배치 문화에 로티퍼의 재고 인구를 유지합니다. 로티퍼가 최적의 상태에있을 때 많은 신생아 2-3 계란 베어링 성인 관찰 할 수있다. 참고 : 실험 로티퍼를 얻기 위해 또 다른 방법은 휴식 달걀을 부화하는 것입니다. 휴식 계란에서 부화 로티퍼 잘 동기화 된 것으로 간주, 그들의 수명은 amictic 계란 (11) 부화 로티퍼의 그것과 크게 다르지 않다된다. 그러나, 휴식 계란에서 로티퍼 이전 amictic 계란에서보다 재생을 시작합니다. 따라서,주의는 생식 특성의 측정이 필요하다. </li></ol> 사전 문화에 의해 로티퍼 3. 동기화 <ol><li> 보안 목표 명세서에서 하나의 로티퍼를 선택옥토퍼스의 인구와 문화로 실험에 사용되는 하위 집단을 설정 2.1-2.3에 설명. 2 주 동안 일반적으로 문화. </li><li> 하위 집단에서 계란 베어링 로티퍼를 수집 (실험에 사용되는 개인의 이중 번호를 수집). 단일 코호트 같은 배양을 (농도 : ~ 50 개인 / ㎖) 광고 무제한 공급하에 신선한 배지에서 2.1-2.3에서 설명한 바와 같이, 6 웰 배양 플레이트이다. 조절 된 매체가 Brachionus의 로티퍼 (32, 33)의 생식 생리에 영향을주기 때문에 인구 밀도를 제어하는 것이 중요합니다. </li><li> 새로 준비 문화 매체에 성인의 첫번째 계란에서 부화 신생아를 전송합니다. 2 ~ 3 세대에 걸쳐이 절차를 반복합니다. </li><li> 생존 시간을 측정하기위한 소정의 시간주기 (예를 들어, &lt;3 시간)에서 빗금 신생아를 사용한다. , 색인 전압 여러 가지를 사용하여 재현성을 확인 매우 희한하지만, 하나의 개인을 선택할 가능성 편견을 방지하기 위해늘어진 하위 집단. 참고 : 로티퍼는 일반적으로이 조건으로 만 무성 생식으로, 어떤 남성이 실험을 통해 존재하지 않는 확인합니다. 남성은 신생아보다 작은 일반적으로 빠른 여성보다 이동합니다. Mictic 여성은 특정 조건 (29)에서 amictic 여성 다른 수명을 가지고있다. </li></ol> 생존 시간 4. 측정 <ol><li> 플라스틱 접시에 배치 신생아 (인공 해수의 각 웰 포함 1 mL를 일반적으로 24 또는 48 웰 플레이트). </li><li> 24 시간 간격으로, 만약 높은 온도 (위 30 ° C 이상)에서 새로 제조 된 배양 배지 또는 12 시간 간격으로 로티퍼를 전송합니다. 자손의 수를 기록하고 각 개인은 죽은이나 살아 있는지 여부. 코로나의 섬모 운동이 완전히 정지했을 때 죽은로 로티퍼를 기록합니다. 참고 피퍼 종종 웰의 측벽에 부착. 물을 부드러운 피펫 그들을 찾는 데 도움이됩니다. 로티퍼를 찾을 또는 아칸소되지 않은 경우전자는 실수로 &quot;검열​​&quot;라고하지 &quot;죽은&quot;로, 그들을 기록, 피펫에 의해 손상. </li><li> 실험 로티퍼 적극적으로 재생 될 때 신생아를 제거합니다. 신생아 빠르게 성장하고 실험 피퍼 구별 때때로 어렵다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 카플란 - 마이어 생존 곡선 (도 1 및 2)를 X 축, Y 축 및 시간을 누적 생존율을 플로팅하여 만들기. 이 생존 데이터의 일반적인 표현이다. 생존 시간 (34)의 통계 비교 (또한 벽난로 - 콕스 테스트라고도 함) 비모수 로그 순위 테스트를 사용합니다. 로그 순위 테스트는 또한 JMP와 R. 같은 다른 표준 통계 패키지에 포함되어 있습니다 주 : 정규 분포는 일반적으로 생존 데이터 (35)에 의해 충족되지 않기 때문에 학생의 t- 테스트 또는 파라 메트릭 다중 비교 다음 분산 (ANOVA) 분석을 사용하지 마십시오. 또한, 이러한 운전 방식DS는 계정에 검열 개인을하지 않습니다. 더 검열 데이터가없는 경우 맨 - 휘트니 U 시험을 이용할 수있다. </li></ol>

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<li>Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+inhibition+of+TOR+and+JNK+pathways+interacts+to+extend+the+lifespan+of+Brachionus+manjavacas+%28Rotifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera).</a> Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+nematode+Caenorhabditis-elegans+-+major+biological+and+environmental-factors+influencing+life-span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span.</a> Mech. Ageing Dev. 6 (6), 413-429 (1977).</li>
<li>Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+parental+age+effects+on+the+evolution+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">The role of parental age effects on the evolution of aging.</a> Evolution. 56 (5), 927-935 (2002).</li>
</ol>

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현재의 프로토콜 Brachionus 피퍼의 생존 시간을 측정하는 방법을 설명한다. 중요한 단계는 여러 세대에 걸쳐 로티퍼 상태의 동기화이다. 실험 피퍼 잘 동기화되면 여러 선행 연구 18,24,37,38에보고 된 일반적인 유형 I 생존 곡선은 거의 조기 사망이 관찰된다. 생존 시간의 표준 편차 따라서 높은 통계 전력의 결과로 가난하게 동기화 로티퍼에 비해 작아진다. 동기화는 또한 생존 시간 측정의 재현성을 향상 할 것으로 예상된다 - 엄마 최적 조건에서 배양되므로, 현재 프로토콜 모체 세대의 가능한 해로운 효과를 상쇄. 조기 사망률이 여전히 조심 동기화 후 관찰되는 경우, 새로 준비 문화 미디어 사용을 고려, 즉 먹이 조류, 또는 새로 설립 된 실험 집단의 다른 많은 (,) 프로토콜 3.1에서 시작합니다. 이 프로토콜의 제한은 잘 동기화 로티퍼 잠재적 통해 문자를 구분한다는 것입니다. 예를 들어, 수명을 연장...

로티퍼는 문 Rotifera 1을 구성하는 미세한 국제 동물 플랑크톤 (&lt;1mm)입니다. 이들은 약 1000 체세포과 특성 차륜 형 섬모 장치 이루어지는 간단한 신체 운동 계획 및 공급을 위해 사용되는 코로나라고있다. 대부분의 로티퍼는 약 1,600과 500 종 각각 2를 포함하는 클래스 단 소강 또는 질 형목에 속한다. bdelloid 로티퍼가 의무 처녀 생식 (3)에 의해 재생하는 동안 단 소강 로티퍼는 일반적으로 모두 성적과 무성 생식 단계 (순환 처녀 생식)가 있습니다. 이 실험에서 높은 재현성을 보장 전적으로 동일한 로티퍼 개인을 얻는 것이 가능하다. 또한, 그들은 짧은 수명, 배양 용이성, 게놈과 transcriptomic 4-7 시퀀스 데이터의 가용성, 및로부터 떨어진 독특한 계통 위치로서 모델 생물 여러 다른 장점을 가지고rthropods 및 선충 8. 로티퍼 따라서 생태 학적, 독성의 무척추 동물 모델을 약속하고, 연구 9-12 노화된다. 환경 스트레스 또는 화학 물질에 노출 하에서 생존 시간이 13-19 연구 분야에서 자주 측정 된 파라미터이다. 이 어머니의 환경 조건에 민감하기 때문에 피퍼의 생존 시간을 측정하는 경우에는주의가 필요하다. 즉, 단 소강 로티퍼 Brachionus의 manjavacas에 세 어머니에서 여성 자손은 젊은 산모에서보다 짧은 수명을 가지고, 그러나 산모의 칼로리 제한 (CR)은 부분적으로 고급 산모의 나이 (20)의 해로운 효과를 상쇄. B.에서 plicatilis, 산모 CR은 자손의 수명, 기아에서 오래 생존 기간 및 항산화 효소 (21, 22)의 강화 된 표현과 관련된 높은 산화 스트레스 저항을 제공한다. 임산부 연령 효과또한 bdelloid 로티퍼 (23)에서 관찰되었다. 따라서, 실험 로티퍼의 조건을주의 깊게 생존 시간을 측정하기 전에 몇 세대에 걸쳐 동기화되어야합니다. 여기에서 우리는 여러 세대에 걸쳐 배양 조건의 동기화 다음 Brachionus의 로티퍼의 생존 시간의 측정을위한 프로토콜을 제공합니다. 간헐적 단식 (IF), 피퍼 주기적으로 공급되는 CR의 변형은 22, 24에 의한 장수 IF의 잘 알려진 효과 동기화의 효과를 나타 내기 위해 적용 하였다.

<table><tbody><tr><td>염화나트륨</td><td>Wako</td><td>190-13921</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Wako</td><td>136-03995</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘</td><td>Wako</td><td>131-00427</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Wako</td><td>168-22111</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Wako</td><td>035-00455</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Wako</td><td>199-05985</td><td></td></tr><tr><td>브롬화나트륨</td><td>Wako</td><td>190-01515</td><td></td></tr><tr><td>멤브레인 필터(0.45 &마이크로; m 기공 크기)</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Culture plate, 6-well, non-treated</td><td>Thomas Scientific</td><td>6902D01</td><td>Flat bottom</td></tr><tr><td>Culture plate, 48-well, non-treated</td><td>Thomas Scientific</td><td>6902D07</td><td>Flat bottom</td></tr><tr><td>Tetraselmis, Living</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>152610</td><td></td></tr><tr><td>PRISM 6</td><td>GraphPad Software</td><td>Version 6.0d</td><td></td></tr></tbody></table>

생존 시간의 측정에<em&gt; brachionus</em&gt; 로티퍼 : 산모 조건의 동기화

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

윤충류는 짧은 수명, 배양의 용이성, 클론 배양을 가능하게 하는 단성형성과 같은 몇 가지 장점으로 인해 생태독성학 및 노화 연구에서 모델로 사용되는 미세한 코스모폴리탄 동물성 플랑크톤입니다. 그러나 생존 시간을 측정할 때는 모계의 나이와 모계의 섭식 조건에 영향을 받기 때문에 주의가 필요합니다. 여기에서는 여러 세대에 걸친 배양 조건의 신중한 동기화에 따라 Brachionus 윤충류의 생존 시간을 강력하고 재현 가능하게 측정할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 경험적으로 볼 때, 동기화가 불량하면 조기 사망률이 발생하고 생존율이 점진적으로 감소하여 통계적 검정력이 약해집니다. 실제로, 이러한 조건 하에서, 칼로리 제한(CR)은 B. plicatilis의 수명을 크게 연장하지 못했지만, 과거와 현재의 연구에서 잘 동기화된 윤충류 샘플로 CR로 유도된 수명이 입증되었습니다. 이 프로토콜은 초파리 Drosophila melanogaster와 선충 Caenorhabditis elegans를 포함한 다른 무척추 동물 모델에 유용 할 수 있습니다.

그림 1은 제대로 동기화 인구 (두 개의 복제 만점)의 대표적인 생존 곡선을 보여줍니다. 이 실험에서, 로티퍼이었다 중 공급 일상 [광고 무제한 (AL) 그룹] 또는 (그룹 IF) 매일. 평균 생존 기간은 각각 그룹화 AL 및 IF (13) 18 일이었다. 이를 잘 IF는 로티퍼의 수명을 연장하는 것이 알려져 있지만,이 실험은 AL 및 그룹 IF 수명 사이의 유의 한 차이를 검출하지 못했다. 경험적 조기 사망률과 생존율의 점진적인 감소가 불충분 동기화 결과는이 실험에서 관찰했다. 하위 집단에 대한 부적절한 처리 또는 낮은 수질로 인한 로티퍼 손상과 유사한 결과를 얻을하는 경향이있다. 로티퍼 조건이 최적 잘 동기화되면, 조기 사망은 거의 관찰되지 및 accordin된다의 Gly 로티퍼 실험 ...

윤충류는 생태독성학 및 노화 연구에서 모델로 사용되는 미세한 동물성 플랑크톤입니다. 여기에서는 Brachionus 윤충류의 생존 시간을 강력하고 재현 가능하게 측정하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 여러 세대에 걸친 배양 조건의 동기화는 모계 조건이 자손의 생활사에 영향을 미치기 때문에 특히 중요합니다.

생존 시간의 측정에<em&gt; Brachionus</em&gt; 로티퍼 : 산모 조건의 동기화

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short ...

본 절차의 전체적인 목표는 모계 세대의 잠재적인 유해한 영향을 배제하여 Brachionus 윤충의 생존 시간을 정확하게 측정하는 것입니다. 이 방법은 노화 연구의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.로티퍼(rotifers)의 생존 시간을 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 재현성이 높고 통계적 검정력이 크다는 점입니다. 우선, 4.5 L의 증류수 또는 탈이온 희석수에 454 mM sodium chloride, 26 mM magnesium chloride, 27 mM magnesium sulfate, 10 mM potassium chloride, 그리고 10 mM calcium chloride를 첨가하십시오.0.48 M 중탄산나트륨 표준 용액을 준비합니다. 그리고 준비된 염 용액에 이 용액 25 mL를 첨가합니다. 0.4 M 브롬화나트륨 표준 용액을 준비합니다.그리고 그것을 10 mL 취해 염 용액에 추가합니다. 그다음 증류수를 사용하여 염 용액의 최종 부피를 5 L로 맞춥니다. 그리고 0.45 µm 필터 막을 사용하여 용액을 여과합니다.실험실에서 배양하거나 야생에서 채집한 윤각동물을 배양하려면, 멸균된 100 milliliter 비커에 인공 해수를 채워 넣습니다. 그리고 25 °C에서 배양합니다. Snell의 방법에 따라, 인공 해수에서 먹이용 미세조류 종을 배양합니다.모든 실험군에 동일한 배치의 미세 조류가 사용되도록 합니다. 2일마다 먹이를 공급하고 매주 배지를 교체하여 배치 배양 방식으로 로티퍼의 스톡 집단을 유지합니다.轮虫이 최적의 조건에 있을 때, 2~3개의 알을 가진 많은 신생아와 성체를 관찰할 수 있습니다. 사전 배양을 통해 轮虫의 주기를 동기화하려면, 스톡 집단에서 단일 轮虫을 선택하십시오. 그리고 앞서 설명한 대로 100 milliliter 비커의 인공 해수에서 약 2주 동안 배양하십시오.배양 후, 하위 집단에서 알을 품은 로티퍼를 수집합니다. 6-웰 플레이트의 각 웰에 해수 1밀리리터당 약 50마리의 로티퍼를 넣어 단일 코호트로 배양하고, 먹이를 충분히 제공합니다. 알이 부화하면 신생 개체들을 새로 준비한 배양 배지로 옮깁니다.신생 개체의 배양 및 전이를 2~3세대 동안 반복합니다. 생존 시간을 측정하려면, 3시간 이내에 부화한 신생 개체들을 1 mL의 인공 해수가 담긴 24웰 또는 48웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 12시간 또는 24시간

measurement-survival-time-brachionus-rotifers-synchronization

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서에서 우리는 UV - 살해 박테리아 음식 고체 미디어에 유지 nematodes의 수명을 측정하는 일반적인 프로토콜을 제시한다.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em솔리드 미디어> 수명

이 비디오에서는 불임 성인 예쁜꼬마선충의 발달 동기화된 개체군을 생산하는 방법을 보여줍니다. 예제 프로토콜은 살아있는 동물의 산소 소비율을 연구하기 위해 벌레를 동기화합니다.

선충 동기화(Nematode Synchronization): 동일한 발달 단계에 있는 벌레 개체군을 얻는 방법

이 비디오는 예쁜꼬마선충의 수명을 측정하는 전통적인 플레이트 기반 방법을 설명합니다. 예시 프로토콜은 RNAi로 처리된 기생충의 수명을 측정합니다.

수명 분석: 예쁜꼬마선충(C. elegans) 수명 측정

여기에서는 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장의 초기 및 후기 단계에서 발생하는 형태 생성 결함을 모니터링하기 위해 특별히 고안된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 궁극적으로, 이러한 프로토콜은 이러한 단계를 조절하는 유전자를 식별하고 배아의 전후 축을 따라 차등 요구 사항을 특성화하도록 설계되었습니다.

소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

장기 연구는 진화의 과정 및 적응의 메커니즘을 이해 하는 데 필수적입니다. 일반적으로, 이러한 연구는 연구자의 생활 시간 넘어 약속 필요합니다. 여기, 강력한 방법은 극적으로 자연 시스템에 경도 데이터를 생성 하기 위해 최신의 데이터 수집을 진행 하는 설명 합니다.

부활의 휴면 벼룩 마그나: 프로토콜 및 응용 프로그램

여기 우리가 설명 복제 설정 방법, 양적 측정 C. 선 충 수명/생존 하 접근법 및 healthspan 높은 처리량 및 강력한 방법으로 데이터 품질을 희생 하지 않고도 많은 조건의 심사 되므로. 이 프로토콜은 전략 하 고 데이터 복제 집합의 분석을 위한 소프트웨어 도구를 제공 합니다.

복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량

미토 콘 드리 아 호흡은 중요 organismal 생존; 따라서, 산소 소비 속도 미토 콘 드리 아 건강의 훌륭한 지표 이다. 이 프로토콜에 기저 측정 하는 상업적으로 사용할 수 있는 respirometer 사용 하 여 설명 하 고 최대 산소 소비 속도에 라이브, 그대로, 그리고 자유롭게 운동 꼬마 선 충.

그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정

여기서, 우리는 선충 C. 예쁜꼬마선충에서 세포 단백질 독성 스트레스 반응을 형광 전사 기의 활성화를 측정하고 생리적 스트레스에 대한 감수성을 측정하여 특성화한다.

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

Caenorhabditis elegans는 건강, 수명 및 스트레스에 대한 탄력성을 조사하기위한 강력하고 저렴한 방법을 갖춘 우수한 모델 시스템 역할을합니다.

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

여기에서 우리는 모델 유기체 C. elegans를 사용하여 배아 생존력과 생산된 배아(새끼)의 총 수를 결정하는 일반적인 방법을 제시합니다.

Caenorhabditis elegans의 배아 생존력 및 무리 크기 측정

학습하세요 Brachionus 로티퍼의 생존 시간 측정 방법을 산모 조건 동기화를 통해 정확하게 측정하는 기술입니다. 이 프로토콜은 노화 연구와 생태독성학 연구에서 높은 재현성과 통계적 검정력을 제공합니다.

생존 시간의 측정에

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