사이트 감독 스핀 라벨 및 펜타 머 리간드 - 게이 티드 이온 채널의 EPR 분광 연구

이 프로토콜의 전반적인 목표는 전자 상자성 공명(electron paramagnetic resonance) 연구를 위해 펜아머릭(penameric) 리간드 작동 채널의 정제, 부위 특이적 스핀 표지 및 재구성을 시연하는 것입니다. 생리적으로 유의미한 환경에서 막 단백질의 동역학을 연구하는 것은 이 막 수송 단백질의 작동 방식을 완전히 이해하는 데 매우 중요합니다. 이러한 필요성 때문에 부위 특이적 스핀 표지 및 EPR 기술이 가장 적합하다고 생각합니다.

이 기술의 주요 장점은 단백질의 크기에 제한을 받지 않는다는 것입니다. 따라서 거대 단백질의 역동성이나 막에 재구성된 단백질을 연구하고자 한다면, 부위 특이적 스핀 표지 및 EPR 분광법이 최적의 기술이 될 것입니다. 부위 특이적 돌연변이 유발법을 통해 GLIC 유전자에 단일 시스테인 돌연변이를 도입하십시오.

텍스트 프로토콜에 기술된 대로 GLIC 시스테인 돌연변이체의 하룻밤 배양액을 준비합니다. 다음으로, 오토클레이브 멸균된 terrific broth 배지에 100 milliliters의 멸균 인산칼륨 완충액을 첨가합니다. 그런 다음, 멸균된 glucose, Kanamycin, 그리고 10 milliliters의 하룻밤 배양액을 첨가합니다.

37 °C의 셰이커에서 250 rpm으로 배양합니다. 50 mL의 글리세롤을 첨가하고 600 nm에서의 광학 밀도가 1.0에서 1.2에 도달할 때까지 배양을 계속합니다. 200 µM IPTG로 세포를 유도한 후, 셰이커를 다시 250 rpm으로 설정하고 18 °C에서 약 16시간 동안 추가로 배양합니다.

1L 원심분리 병에 담긴 세포를 8500 ×g, 4 °C에서 15분 동안 원심분리하여 수확합니다. 상층액을 따라내고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 펠릿이 포함된 병의 무게를 잽니다. 배양액 1L당 150 mL의 차가운 buffer A에 박테리아 펠릿을 재부유시킵니다.

4 °C의 저온실에서 세포 파쇄기를 통해 세포를 균질화합니다. 대부분의 박테리아가 용해될 수 있도록 이 과정을 세 번 반복합니다. 세포를 14,000 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다.

그다음, 상층액을 피펫으로 옮겨 깨끗한 원심분리 튜브에 넣습니다. 상층액을 168,000 ×g에서 1시간 동안 원심분리한 후, 막 펠릿(membrane pellet)이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 따라냅니다. 1L 배양액에서 얻은 막 펠릿을 10% glycerol이 첨가된 Buffer A에 넣고 최종 부피가 50mL가 되도록 재현탁합니다.

막 현탁액에 0.5 g의 DDM을 첨가하고 4 °C에서 2시간 동안 너테이팅(nutate)합니다. 막 가용화 후, 168,000 ×g에서 1시간 동안 원심분리하여 용해물로부터 세포 파편을 제거합니다. 그동안 아밀로오스 레진을 준비합니다.

피펫을 사용하여 3 mL의 레진을 빈 폴리프로필렌 크로마토그래피 컬럼으로 옮깁니다. 10 bed volume의 물을 세 번 통과시켜 레진을 세척한 다음, 0.5 mM DDM이 포함된 Buffer A 10 bed volume으로 다시 세척합니다. 원심분리 후, 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 꺼내 깨끗한 50 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.

배치식 결합을 위해, 미리 평형화된 amylose 레진을 원뿔형 튜브에 넣습니다. 4°C에서 혼합물을 2시간 동안 너테이팅하여 추출된 단백질을 amylose 레진에 결합시킵니다. 다음으로, 슬러리 전체를 크로마토그래피 컬럼에 통과시키고 통과액을 수집합니다.

GLIC 단백질을 0.5 millimolar DDM 및 0.5 millimolar TCEP와 더불어 40 milliomolar maltose가 포함된 Buffer A 10 milliliters로 희석하십시오. TCEP는 시스테인 곁사슬의 산화를 방지합니다. 전체 용출액을 수집하십시오.

원심 분리 농축기를 사용하여 용출된 단백질을 4~6 mg/mL 농도로 농축합니다. HRV 3C protease를 첨가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 부위 특이적 스핀 표지를 수행하려면, 먼저 protease로 소화된 샘플에 MTSL 스핀 표지를 10배 몰 과량으로 첨가하여 GLIC 단량체와 MTSL의 몰 비가 1:10이 되도록 합니다.

1시간 동안 배양한 후, 5배의 몰 과량 비율로 스핀 라벨을 추가하고 다시 1시간 동안 배양합니다. Buffer A와 0.5 millimolar DDM으로 사전 평형화된 크기 배제 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 컬럼에 샘플을 통과시켜, 절단된 MBP 태그와 과량의 유리 스핀 라벨을 GLIC 오량체로부터 분리합니다. 원심 농축기를 사용하여 단백질 용액을 최종 농도가 약 8~10 mg/mL가 되도록 농축한 후 얼음에 둡니다.

이제 시료를 재구성할 준비가 되었습니다. 리포좀을 준비하려면, 깨끗한 25 milliliter 둥근 바닥 플라스크를 5 milliliter의 클로로포름으로 헹구고 흄 후드 내에서 질소 가스 흐름으로 플라스크를 건조합니다. 그 다음, 10 milligrams의 asolectin을 플라스크에 옮기고 지속적인 질소 가스 흐름 하에서 지질을 건조합니다.

클로로포름이 증발하면, 완전히 건조시키기 위해 플라스크를 진공 상태로 1시간 동안 둡니다. 그 후, 건조된 지질에 재구성 완충액 A(reconstitution Buffer A) 1 mL를 첨가하고 플라스크를 강하게 볼텍싱하여 지질 펠렛을 현탁시킵니다. 소단일층 소포(small unilamellar vesicles)를 준비하려면, 소포 용액이 대체로 투명해지고 덩어리가 관찰되지 않을 때까지 냉욕 초음파 세척기에서 지질 현탁액을 초음파 처리합니다.

이 혼합물에 DDM을 최종 농도가 4 mM이 되도록 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 단백질을 재구성하기 위해, 정제된 단백질을 지질 혼합물에 첨가합니다. 샘플을 4 °C에서 1시간 동안 천천히 회전시키며 배양한 후, Buffer A를 사용하여 샘플을 15 mL로 희석합니다. 세제를 포집하는 소수성 기공이 있는 폴리스티렌 비드를 사용하여 현탁액 내의 잔류 세제를 제거합니다.

깨끗한 비드 80 mg을 넣고 리포좀 현탁액을 4 °C의 뉴테이터(nutator)에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 컬럼 필터를 사용하여 비드를 제거하며 리포좀을 25 mL 초원심분리 튜브로 옮기고 샘플을 25 mL까지 추가 희석합니다. 샘플을 168,000 ×g에서 2시간 동안 원심분리한 후, 상층액을 따라내고 100 µL의 Buffer B를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 연속파 EPR 분광법(continuous wave EPR spectroscopy)을 수행하려면, 먼저 리포좀 현탁액을 200 µL 튜브로 옮긴 후 원심분리기를 사용하여 샘플을 펠릿화합니다.

상층액을 제거한 후, 샘플은 EPR 측정이 가능한 상태가 됩니다. 리포좀 샘플에서 가능한 한 많은 완충액을 제거하십시오. 완충액 교환을 수행하려면, 피펫을 사용하여 20 microliters의 리포좀 펠릿을 마이크로 원심분리 튜브로 옮기십시오.

Buffer D 180 µL를 첨가하고 42 °C에서 5분 동안 배양합니다. 샘플을 원심 분리하고 피펫을 사용하여 상층액을 제거하며, 완벽한 완충액 교환을 위해 이 과정을 세 번 반복합니다. 가스 투과성 플라스틱 모세관은 스펙트럼 선형과 용매 접근성 측정 모두에 적합합니다.

모세관을 펠렛 형태의 프로테오리포좀에 닿게 하여 시료를 흡입하고, 끝부분을 본왁스(bone wax)로 밀봉합니다. 여기에는 MBP 태그의 단백질 분해 절단 후 스핀 라벨링된 GLIC의 젤 여과 크로마토그램을 통한 스핀 라벨링된 GLIC 돌연변이체의 생화학적 특성 분석 결과가 나타나 있습니다. 피크는 GLIC 오량체와 유리 MBP에 해당합니다.

SDS page 젤은 젤 여과 전의 절단되지 않은 단량체 GLIC-MBP 융합 단백질과, 젤 여과를 통해 분리된 MBP 및 GLIC 분획을 보여줍니다. 다양한 막 지질에 재구성된 GLIC의 응집 상태를 모니터링하기 위해 FRET 기반 분석이 수행되었습니다. FRET 측정은 하룻밤 동안 재구성을 거친 샘플과 여러 차례의 동결-해동 사이클을 거친 샘플을 대상으로 이루어졌습니다.

재구성된 asolectin 소포에서 절제된 inside-out 패치에서, 신속 용액 교환기를 이용한 pH 점프를 통해 GLIC을 활성화합니다. 채널은 약 10 milliseconds 내에 활성화되며, 1~3초의 시간 상수로 탈감작되는 것이 관찰됩니다. 채널 활성화 과정 동안 구조적 재배열이 관찰됩니다.

본 연구에서는 pH 변화에 따른 진폭 변화와 선폭 변화를 나타내는 기공 내벽 M2 헬릭스 위치의 연속파 전자 상자성 공명 스펙트럼을 제시합니다. EPR 분광법은 천연 환경에서 막 단백질의 구조적 변화를 측정할 수 있는 독보적인 구조 분석법이며, 고해상도 X선 구조 또는 cryo-EM 구조로는 확인하기 어려운 단백질 역학의 분자적 세부 사항을 보여줍니다. 이 기술을 사용할 때는 돌연변이로 인해 단백질의 올리고머 안정성이 낮아지거나 저하되는 경우가 빈번하다는 점을 유념하는 것이 중요합니다.

따라서 이러한 문제들을 해결하기 위한 전략을 세워야 할 수도 있습니다. 이러한 EPR 연구 결과와 기능적 측정값을 결합하면 구조-기능 관계를 연구하는 데 더 완전한 그림을 얻을 수 있으며, 향후 기술적 발전은 더욱 정교한 지질 조건에서 더 복잡한 인간 채널을 연구하기 위해 이 강력한 접근 방식을 사용하는 것을 목표로 하고 있습니다.