Name: 사이트 감독 스핀 라벨 및 펜타 머 리간드 - 게이 티드 이온 채널의 EPR 분광 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 배우세요 EPR 분광법을 이용한 펜타머 리간드 게이트 이온 채널의 사이트 특이적 스핀 라벨링 및 재구성 방법을 통해 막 단백질 동역학을 연구하는 기법을 익히세요.

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우리는 원고의 중요한 읽기와 의견의 차크라 실험실의 현재와 전 회원들에게 매우 감사하고 있습니다. 이 작품은 보건 부여의 국립 연구소 (1R01GM108921)와 미국 심장 협회 (NCRP 과학자 개발 그랜트 12SDG12070069)에 의해 SC에 지원되었다.

저자는 공개할 것이 없습니다.

EPR 스펙트럼을 거의 네이티브 환경에서 막 단백질의 구조적 변화를 정량화에서 타의 추종을 불허하는 구조적 접근 것으로 입증되었습니다. 이러한 접근 방식은 우리에게 X 선 결정학 및 곳을 알아내는 - 전자 현미경에서 고해상도 구조에 가려하는 단백질 역학의 분자 세부 사항에 엿봄을 할 수 있습니다. 그러나, 다른 시스템으로 일반적인 적용에 영향을 미칠 수 있으며 마음에 길을 따라 잠재적 실험 장애물을 유지하기 위해이 방법의 기술적 한계를 고려하는 것이 중요합니다. 우리는 아래의 문제 해결을위한 권장 전략과 함께 이러한 측면 중 일부에 대해 설명합니다. 일반적인 문제 중 하나는 광범위한 돌연변이 교란이 낮은 수율과 단백질의 가난한 올리고머 안정성이다 관련된 기술로 발생하는. 이온 채널과 같은 복잡한 다량 막 단백질로 작업 할 때 이러한 양상은 더욱 악화된다. 그것은 일입니다대폭적인 돌연변이에 착수하기 전에이 두 가지 생화학 적 측면을 최적화하는 것이 중요 erefore. 우리는 ...

지난 10 년간, 펜타 머 리간드 관문 이온 채널의 구조 이해 (pLGIC)는 여러 가족 구성원의 고해상도 구조 군중에 의해, 비약적으로 성장했다. 분야에서 현재 발전을 주도하는 중요한 요소는 구조 결정 방법의 원핵 pLGIC 채널 발견, 진핵 생물의 세포막 단백질 발현 1-3 주요 진행됨 4-6 엄청난 돌파구를 포함한다. (7) 이러한 구조가 명확한 합의 제공 pLGIC의 3 차원 구조의 전체적인 보존. 그러나 뒤에 흔적 것 두 가지 주요 영역이 채널 준비의 기능적 특성 및 채널 기능의 기계 론적 설명이다. 게이팅 구조적 변화는 복잡하고, 채널의 길이를 따라 60 Å 거리에 걸쳐 발생하고 이러한 전환을 광범위에 의해 조절되는막 지질. 특히, 음의 지질, 콜레스테롤 및 인지질 pLGIC 8-11의 기능을 조절하는 것으로 나타났다. 채널 기능에서 이러한 지질 성분의 정확한 역할을 알 수없는 남아 있지만, 게이트의 완전한 분자 이해는 그 나라의 환경에서 이러한 채널을 연구 필요합니다. 사이트 감독 스핀 라벨 (SDSL) 및 전자 스핀 공명 (EPR) 분광법은 재구성 시스템에서 단백질 역학 연구를위한 선택의 기술이다. (형광 스펙트럼은 그대로), 이로써 천연 지질 조건 재구성 전장 구조체의 측정이 가능 EPR 분광법은 분자 크기에 의해 제한 (NMR처럼) 또는 시료의 광학 특성 아니다. 이 기술은 매우 민감하고 (피코 몰 범위에서) 상대적으로 낮은 샘플 요구 사항이 있습니다. 이 두 측면은 밀리그램 이상에서 표현하기 어려운 큰 막 단백질 연구에 대한 기술이 적합하다수량. 부위 - 스핀 표지와 함께 EPR 분광법의 사용 웨인 Hubbell의 연구진에 의해 개발되었고, 단백질 종류의 범위를 학습하도록하고있다. 12-24 EPR 데이터 이차 구조를 조사하기 위해 사용 된, 단백질의 변화 형태, 막 - 삽입 깊이 및 단백질 - 단백질 / 단백질 - 리간드 상호 작용. 상기 방법은 부위 - 특이 적 돌연변이 유발에 의해 주목 위치의 시스테인의 치환을 포함한다. 부위 - 특이 적 표지를 보장하기 위해, 시스테인이없는 템플릿을 생성하기 위해 다른 아미노산과 (예., 세린) 천연 시스테인을 대체 할 필요가있다. 이황화 결합 다리를 통해 부착 단백질 (1- 옥실-2,2,5,5- 테트라 메틸 - 피 롤린 Δ3 -3- 메틸) methanethiosulfonate : 지금까지, 가장 인기 스핀 라벨 티올 특정 MTSL이다. 그것의 높은 특이성, (트립토판보다 약간 큰) 비교적 작은 크기, 플렉시에링커 영역의 부 합성,이 스핀 라벨에도 매립 시스테인 우수한 반응성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 또한, 반응성을 극대화하기 위해, 단백질의 표지 반응은 세제 - 가용화 된 형태로 수행된다. 크기 배제 크로마토 그래피에 의한 과잉 자유 스핀 라벨 분리 후, 단백질 또는 리포좀 정의 지질 조성물의 이중층 흉내 낸 시스템으로 재구성된다. 일반적으로, 시스테인 돌연변이가 아니라 단백질의 대부분의 부분에서 허용되고, 스핀 프로브의 상대적으로 작은 크기의 2 차 및 3 차 구조로 최소한의 혼란을 일으키는. 수정이 야생형 기능을 유지하도록하려면 표지 및 재구성 된 채널은 패치 클램프 측정에 의해 공부하실 수 있습니다. 표지 된 기능성 단백질은 다음 본질적으로 정보의 세 가지 주요 유형을 제공 분광 측정을 실시 : linesh에 의해 12,14,15,20,22,23,25-27 스핀 프로브 역학을원숭이 분석; 상자성 이완 에이전트 프로브의 접근성; 거리 분포. 27 EPR 거리는 두 개의 서로 다른 접근 방법에 의해 측정된다. 첫번째는 스핀 라벨 간의 극성 상호 작용에서 발생하는 스펙트럼의 폭이 넓어합니다 (8 - 20 Å 거리 범위) 연속파 (CW) 기술에 기초한다. 거리를 결정하는 데 사용되는 28, 29 번째 펄스-EPR 인 거리 측정 이중 전자 전자 공명 (DEER) 70 Å. 30-34까지 연장 될 수있어서, 상기 스핀 에코 진폭의 진동이 거리와의 거리 분포를 결정하기 위해 분석된다. 여기 스핀 에코는 쌍극 상호 작용의 주파수로 변조된다. 함께, 이러한 파라미터는 단백질 토폴로지 이차 구조 요소 및 단백질 구조적 변화를 결정하기 위해 사용된다.

<table><tbody><tr><td>부위 지시 돌연변이 유발 및 Cys 돌연변이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PfuUltra HF 반응 완충액</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-52</td><td></td></tr><tr><td>dNTPS</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>N0447L</td><td>10 mM 각 dNTP</td></tr><tr><td>pfu Ultra DNA 중합효소</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-51</td><td>2.5 U/ul</td></tr><tr><td>DPNI</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>R0176S</td><td>20,000 U/ml</td></tr><tr><td>XL10 GOLD</td><td>Agilent Technologies</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>SOC 미디어</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP905</td><td></td></tr><tr><td>LB 미디어</td><td>Invitrogen</td><td>127957084</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep 키트</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>C43 유능한 세포</td><td>Lucigen</td><td>60446</td><td></td></tr><tr><td>발현 및 정제</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>Fisher Scientfic</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>피셔 생물 시약</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Amresco</td><td>J850</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>피셔 생물 시약</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0705</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0781</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (이소 프로필 - 티오 -& 베타, - 갈락토 시드)</td> <td>골드 생명 공학</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>시그마 생명 과학</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>시그마 생명 과학</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Amresco</td><td>M145</td><td></td></tr><tr><td>류펩틴</td><td>Amresco</td><td>J580</td><td></td></tr><tr><td>펩스타틴</td><td>Amresco</td><td>J583</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-docecyl-&beta;-D-Maltopyranoside)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>아밀로스 수지</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td>, <td>Amresco</td><td>K831</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>맥토스</td><td>아크로스 유기물</td><td>329915000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr><tr><td>빈 폴리프로필렌 크로마토그래피 컬럼</td><td>BioRad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>현장 지정 스핀 라벨링</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1- 옥실 -2,2,5,5- 테트라 메틸 -3- 피롤린 -3- 메틸) 메탄 에티 오 설포 네이</td>트 <td>토론토 Reaserch 화학 물질</td><td>O873900</td><td></td></tr> <tr><td>(1- 아세톡시 -2,2,5,5- 테트라 메틸 - 델타; 3-pyrroline-3-methyl) 메탄에티오설포네이</td>트 <td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>A167900</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>Reconstitution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asolectin lipid</td><td>Avanti polar lipids Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads (폴리스티린 비드)</td><td>Bio Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher chemicals</td><td>A413</td><td></td></tr><tr><td>FRET</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인-말레이미드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸로다민-말레이미드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T-6027</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti 극성 지질 Inc</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti 극성 지질 Inc</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td> E.coli 극성 지질 추출물</td><td>Avanti polar lipids Inc</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EPR 측정</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPX 플라스틱 모세관</td><td>Bruker</td><td>ER221</td><td></td></tr><tr><td>EDDA(Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid)</td><td>Aldrich</td><td>158186</td><td></td></tr><tr><td>Ni(OH)2</td><td>올드리치</td><td>283622</td><td></td></tr></tbody></table>

사이트 감독 스핀 라벨 및 펜타 머 리간드 - 게이 티드 이온 채널의 epr 분광 연구

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

이온 채널 게이팅은 단백질 운동의 자극 주도 오케스트레이션으로, 닫힌 상태, 열린 상태 및 둔감한 상태 사이의 전환으로 이어집니다. 이러한 전이의 기본은 단백질의 고유한 유연성이며, 이는 막 지질 조성에 의해 비판적으로 조절됩니다. 채널 기능의 구조적 기초를 더 잘 이해하려면 생리학적 막 환경에서 단백질 역학을 연구해야 합니다. EPR(Electron Paramagnetic Resonance) 분광법은 기능 상태 간의 구조적 전이를 특성화하는 중요한 도구입니다. NMR 및 X선 결정학과 비교할 때 EPR에서 얻은 정보는 본질적으로 해상도가 낮습니다. 그러나 다른 기술과 달리 EPR에서는 단백질의 분자량에 대한 상한이 없고, 샘플 요구 사항이 현저히 낮으며, 더 중요한 것은 단백질이 결정 격자력에 의해 제약되지 않는다는 것입니다. 따라서 EPR은 재구성된 시스템에서 큰 단백질 복합체 및 단백질을 연구하는 데 매우 적합합니다. 이 기사에서는 Gloeobacter violaceus(GLIC)의 원핵생물 양성자 개폐 펜타메릭 리간드 개폐 이온 채널(pLGIC)을 예로 사용하여 부위 지정 스핀 라벨링 및 멤브레인 재구성을 위한 일반적인 프로토콜에 대해 설명합니다. 채널 역학의 완전한 정량적 특성화를 가능하게 하는 정상 상태 연속파(CW) 및 펄스(이중 전자 전자 공명-DEER) EPR 접근 방식의 조합에 대해 설명합니다.

스핀 표지 GLIC 변이체의 생화학 적 특성 배양 12 ㎎ / ℓ - 일반적으로 10 내지 GLIC-MBP 융합 단백질을 수득 할 상기 프로토콜에 따라. 이 값은 특히 단백질 내에 매립 위치에 대한 다른 돌연변이마다 다를 수 있지만, 수율이 크게 저하 될 수있다. 이 경우, 문화 볼륨 업 스케일링이 필요할 수 있습니다. HRV3C 프로테아제는 편의를 위해 O / N을 수행하여 융합의 분열을 구성. 60 분 - SDS 페이지 젤에 샘플을 실행하면, 우리는이 분열 30 내에서 완료 한 것으로 나타났습니다. (도 1A). 크기 배제 겔 여과 컬럼상에서 정제 GLIC 11.3 ㎖를 보유 부피와 량체로서 주로 용출. MBP에 분획을 15 ml의 용출에 집계 컬럼 (~ 7.0 ㎖)의 공극 부피에서 용출. 스핀 ...

이 기사에서는 전자 상자성 공명 연구를 위한 5층 리간드 게이트 채널의 위치 지정 스핀 라벨링 및 재구성 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 모든 멤브레인 단백질에 적용할 수 있습니다. 여기에 설명된 재구성 방법은 정의된 지질 시스템에서 거시적 및 단일 채널 전류의 패치 클램프 측정에도 사용할 수 있습니다.

사이트 감독 스핀 라벨 및 펜타 머 리간드 - 게이 티드 이온 채널의 EPR 분광 연구

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 전자 상자성 공명(electron paramagnetic resonance) 연구를 위해 펜아머릭(penameric) 리간드 작동 채널의 정제, 부위 특이적 스핀 표지 및 재구성을 시연하는 것입니다. 생리적으로 유의미한 환경에서 막 단백질의 동역학을 연구하는 것은 이 막 수송 단백질의 작동 방식을 완전히 이해하는 데 매우 중요합니다. 이러한 필요성 때문에 부위 특이적 스핀 표지 및 EPR 기술이 가장 적합하다고 생각합니다.이 기술의 주요 장점은 단백질의 크기에 제한을 받지 않는다는 것입니다. 따라서 거대 단백질의 역동성이나 막에 재구성된 단백질을 연구하고자 한다면, 부위 특이적 스핀 표지 및 EPR 분광법이 최적의 기술이 될 것입니다. 부위 특이적 돌연변이 유발법을 통해 GLIC 유전자에 단일 시스테인 돌연변이를 도입하십시오.텍스트 프로토콜에 기술된 대로 GLIC 시스테인 돌연변이체의 하룻밤 배양액을 준비합니다. 다음으로, 오토클레이브 멸균된 terrific broth 배지에 100 milliliters의 멸균 인산칼륨 완충액을 첨가합니다. 그런 다음, 멸균된 glucose, Kanamycin, 그리고 10 milliliters의 하룻밤 배양액을 첨가합니다.37 °C의 셰이커에서 250 rpm으로 배양합니다. 50 mL의 글리세롤을 첨가하고 600 nm에서의 광학 밀도가 1.0에서 1.2에 도달할 때까지 배양을 계속합니다. 200 µM IPTG로 세포를 유도한 후, 셰이커를 다시 250 rpm으로 설정하고 18 °C에서 약 16시간 동안 추가로 배양합니다.1L 원심분리 병에 담긴 세포를 8500 ×g, 4 °C에서 15분 동안 원심분리하여 수확합니다. 상층액을 따라내고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 펠릿이 포함된 병의 무게를 잽니다. 배양액 1L당 150 mL의 차가운 buffer A에 박테리아 펠릿을 재부유시킵니다.4 °C의 저온실에서 세포 파쇄기를 통해 세포를 균질화합니다. 대부분의 박테리아가 용해될 수 있도록 이 과정을 세 번 반복합니다. 세포를 14,000 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다.그다음, 상층액을 피펫으로 옮겨 깨끗한 원심분리 튜브에 넣습니다. 상층액을 168,000 ×g에서 1시간 동안 원심분리한 후, 막 펠릿(membrane pellet)이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 따라냅니다. 1L 배양액에서 얻은 막 펠릿을 10% glycerol이 첨가된 Buffer A에 넣고 최종 부피가 50mL가 되도록 재현탁합니다.막 현탁액에 0.5 g의 DDM을 첨가하고 4 °C에서 2시간 동안 너테이팅(nutate)합니다. 막 가용화 후, 168,000 ×g에서 1시간 동안 원심분리하여 용해물로부터 세포 파편을 제거합니다. 그동안 아밀로오스 레진을 준비합니다.피펫을 사용하여 3 mL의 레진을 빈 폴리프로필렌 크로마토그래피 컬럼으로 옮깁니다. 10 bed volume의 물을 세 번 통과시켜 레진을 세척한 다음, 0.5 mM DDM이 포함된 Buffer A 10 bed volume으로 다시 세척합니다. 원심분리 후, 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 꺼내 깨끗한 50 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.배치식 결합을 위해, 미리 평형화된 amylose 레진을 원뿔형 튜브에 넣습니다. 4°C에서 혼합물을 2시간 동안 너테이팅하여 추출된 단백질을 amylose 레진에 결합시킵니다. 다음으로, 슬러리 전체를 크로마토그래피 컬럼에 통과시키고 통과액을 수집합니다.GLIC 단백질을 0.5 millimolar DDM 및 0.5 millimolar TCEP와 더불어 40 milliomolar maltose가 포함된 Buffer A 10 milliliters로 희석하십시오. TCEP는 시스테인 곁사슬의 산화를 방지합니다. 전체 용출액을 수집하십시오.원심 분리 농축기를 사용하여 용출된 단백질을 4~6 mg/mL 농도로 농축합니다. HRV 3C protease를 첨가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 부위 특이적 스핀 표지를 수행하려면, 먼저 protease로 소화된 샘플에 MTSL 스핀 표지를 10배 몰 과량으로 첨가하여 GLIC 단량체와 MTSL의 몰 비가 1:10이 되도록 합니다.1시간 동안 배양한 후, 5배의 몰 과량 비율로 스핀 라벨을 추가하고 다시 1시간 동안 배양합니다. Buffer A와 0.5 millimolar DDM으로 사전 평형화된 크기 배제 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 컬럼에 샘플을 통과시켜, 절단된 MBP 태그와 과량의 유리 스핀 라벨을 GLIC 오량체로부터 분리합니다. 원심 농축기를 사용하여 단백질 용액을 최종 농도가 약 8~10 mg/mL가 되도록 농축한 후 얼음에 둡니다.이제 시료를 재구성할 준비가 되었습니다. 리포좀을 준비하려면, 깨끗한 25 milliliter 둥근 바닥 플라스크를 5 milliliter의 클로로포름으로 헹구고 흄 후드 내에서 질소 가스 흐름으로 플라스크를 건조합니다. 그 다음, 10 milligrams의 asolectin을 플라스크에 옮기고 지속적인 질소 가스 흐름 하에서 지질을 건조합니다.클로로포름이 증발하면, 완전히 건조시키기 위해 플라스크를 진공 상태로 1시간 동안 둡니다. 그 후, 건조된 지질에 재구성 완충액 A(reconstitution Buffer A) 1 mL를 첨가하고 플라스크를 강하게 볼텍싱하여 지질 펠렛을 현탁시킵니다. 소단일층 소포(small unilamellar vesicles)를 준비하려면, 소포 용액이 대체로 투명해지고 덩어리가 관찰되지 않을 때까지 냉욕 초음파 세척기에서 지질 현탁액을 초음파 처리합니다.이 혼합물에 DDM을 최종 농도가 4 mM이 되도록 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 단백질을 재구성하기 위해, 정제된 단백질을 지질 혼합물에 첨가합니다. 샘플을 4 °C에서 1시간 동안 천천히 회전시키며 배양한 후, Buffer A를 사용하여 샘플을 15 mL로 희석합니다. 세제를 포집하는 소수성 기공이 있는 폴리스티렌 비드를 사용하여 현탁액 내의 잔류 세제를 제거합니다.깨끗한 비드 80 mg을 넣고 리포좀 현탁액을 4 °C의 뉴테이터(nutator)에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 컬럼 필터를 사용하여 비드를 제거하며 리포좀을 25 mL 초원심분리 튜브로 옮기고 샘플을 25 mL까지 추가 희석합니다. 샘플을 168,000 ×g에서 2시간 동안 원심분리한 후, 상층액을 따라내고 100 µL의 Buffer B를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 연속파 EPR 분광법(continuous wave EPR spectroscopy)을 수행하려면, 먼저 리포좀 현탁액을 200 µL 튜브로 옮긴 후 원심분리기를 사용하여 샘플을 펠릿화합니다.상층액을 제거한 후, 샘플은 EPR 측정이 가능한 상태가 됩니다. 리포좀 샘플에서 가능한 한 많은 완충액을 제거하십시오. 완충액 교환을 수행하려면, 피펫을 사용하여 20 microliters의 리포좀 펠릿을 마이크로 원심분리 튜브로 옮기십시오.Buffer D 180 µL를 첨가하고 42 °C에서 5분 동안 배양합니다. 샘플을 원심 분리하고 피펫을 사용하여 상층액을 제거하며, 완벽한 완충액 교환을 위해 이 과정을 세 번 반복합니다. 가스 투과성 플라스틱 모세관은 스펙트럼 선형과 용매 접근성 측정 모두에 적합합니다.모세관을 펠렛 형태의 프로테오리포좀에 닿게 하여 시료를 흡입하고, 끝부분을 본왁스(bone wax)로 밀봉합니다. 여기에는 MBP 태그의 단백질 분해 절단 후 스핀 라벨링된 GLIC의 젤 여과 크로마토그램을 통한 스핀 라벨링된 GLIC 돌연변이체의 생화학적 특성 분석 결과가 나타나 있습니다. 피크는 GLIC 오량체와 유리 MBP에 해당합니다.SDS page 젤은 젤 여과 전의 절단되지 않은 단량체 GLIC-MBP 융합 단백질과, 젤 여과를 통해 분리된 MBP 및 GLIC 분획을 보여줍니다. 다양한 막 지질에 재구성된 GLIC의 응집 상태를 모니터링하기 위해 FRET 기반 분석이 수행되었습니다. FRET 측정은 하룻밤 동안 재구성을 거친 샘플과 여러 차례의 동결-해동 사이클을 거친 샘플을 대상으로 이루어졌습니다.재구성된 asolectin 소포에서 절제된 inside-out 패치에서, 신속 용액 교환기를 이용한 pH 점프를 통해 GLIC을 활성화합니다. 채널은 약 10 milliseconds 내에 활성화되며, 1~3초의 시간 상수로 탈감작되는 것이 관찰됩니다. 채널 활성화 과정 동안 구조적 재배열이 관찰됩니다.본 연구에서는 pH 변화에 따른 진폭 변화와 선폭 변화를 나타내는 기공 내벽 M2 헬릭스 위치의 연속파 전자 상자성 공명 스펙트럼을 제시합니다. EPR 분광법은 천연 환경에서 막 단백질의 구조적 변화를 측정할 수 있는 독보적인 구조 분석법이며, 고해상도 X선 구조 또는 cryo-EM 구조로는 확인하기 어려운 단백질 역학의 분자적 세부 사항을 보여줍니다. 이 기술을 사용할 때는 돌연변이로 인해 단백질의 올리고머 안정성이 낮아지거나 저하되는 경우가 빈번하다는 점을 유념하는 것이 중요합니다.따라서 이러한 문제들을 해결하기 위한 전략을 세워야 할 수도 있습니다. 이러한 EPR 연구 결과와 기능적 측정값을 결합하면 구조-기능 관계를 연구하는 데 더 완전한 그림을 얻을 수 있으며, 향후 기술적 발전은 더욱 정교한 지질 조건에서 더 복잡한 인간 채널을 연구하기 위해 이 강력한 접근 방식을 사용하는 것을 목표로 하고 있습니다.

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연구

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화학

우리는 ATP - 문이 P2X2 수용체의 전체 길이 C 터미 너스에 바인딩 뇌 단백질을 식별하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 모든 P2X 수용체에 대한 확장 및이 방법의 체계적인 응용 프로그램은 P2X 수용체 신호의 더 나은 이해로 이어질 것으로 예상된다.

P2X2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 Proteomics

우리는 하나의 세포에서 형광을 사용하여 conformational 변화의 특정 사이트 분석과 함께 막 단백질의 이온 전달의 속도론을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 이온 채널 전송기 및 이온 펌프에 적응하고 단백질 subunits 사이의 거리 제한을 결정하기 위해 이용하실 수 있습니다.

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

우리의 GPCR의 다양한 타겟 위치에 부 자연스러운 아미노산, P-아지도-L-페닐알라닌을 유전자 인코딩 및 다른 응용 프로그램에서 아지 그룹의 다양성을 보여줍니다. 이들은 GPCR의 리간드 결합 주머니에 잔류를 확인하는 대상으로 광 가교 기술 및 펩티드 에피토프 태그 또는 형광 프로브의 GPCR의 특정 사이트 bioorthogonal 수정이 (가) 있습니다.

유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는

단일 분자 수준에서 고정밀 FRET 실험을위한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 또한,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 결합 도메인에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용될 수있다. 정확한 거리를 결정하는 것은 FRET 실험에 기반한 구조 모델을 구축하기위한 첫 번째 단계입니다.

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

이 문서에는 분 광 분석에 대 한 세제 solubilized TRPV1의 생 화 확 적인 수량을 얻기 위해 특정 방법을 설명 합니다. 결합 된 프로토콜 막 제어 환경에서 포유류 이온 채널에 대 한 구조 및 기능 연구를 촉진 하기 위하여 적응 시킬 수 있다 생 화 확 및 생물 도구를 제공 합니다.

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

이 프로토콜은 세포 환경에서 실시간으로 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 측정하는 방법을 제시합니다. 결합은 트리니트로페닐 뉴클레오티드 유도체와 비표준 형광 아미노산으로 표지된 단백질 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)로 측정됩니다.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

본질적으로 무질서한 단백질에서 약하고 일시적인 분자 간 및 분자 내 상호 작용을 감지하기 위한 상자성 이완 강화 NMR 분광법의 적용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)

이 연구는 비천연 아미노산(UAA) 통합을 통한 부위 특이적 표지를 사용하여 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에 대한 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET) 실험을 수행하는 자세한 절차를 제시합니다. 이 프로토콜은 smFRET 샘플 준비, 실험 및 데이터 분석을 위한 단계별 가이드를 제공합니다.

단일 분자 FRET를 사용한 막 수용체의 구조적 역학 시각화

이 프로토콜은 거대분자의 CryoEM 맵에서 소분자 리간드를 모델링하는 데 사용할 수 있는 도구를 소개합니다.

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy(전자 극저온 현미경에서 파생된 맵으로 리간드 모델링)

전기생리학은 이온 채널 활성을 조사하기 위한 황금 표준입니다. 그러나 광학적 방법을 포함하여 많은 대체 접근 방식이 있습니다. 여기에서는 FRET(inter-subunit Förster 공명 에너지 전달) 기반 방법을 사용하여 8채널(LRRC8) 형성된 음이온 채널을 포함하는 류신이 풍부한 반복의 활성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

SE-FRET(Sensitized-Emission Förster Resonance Energy Transfer)를 사용하여 8채널(LRRC8/VRAC) 활성을 포함하는 류신이 풍부한 반복 모니터링

배우세요 EPR 분광법을 이용한 펜타머 리간드 게이트 이온 채널의 사이트 특이적 스핀 라벨링 및 재구성 방법을 통해 막 단백질 동역학을 연구하는 기법을 익히세요.

사이트 감독 스핀 라벨 및 펜타 머 리간드 - 게이 티드 이온 채널의 EPR 분광 연구

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