사이트 감독 스핀 라벨 및 펜타 머 리간드 - 게이 티드 이온 채널의 EPR 분광 연구

이 프로토콜의 전반적인 목표는 전자 상자성 공명 연구를 위한 페나메릭 리간드 게이트 채널의 정제, 현장 지시 스핀 라벨링 및 재구성을 입증하는 것입니다. 생리학적으로 관련된 환경에서 막 단백질 역학을 연구하는 것은 이 막 수송 단백질이 어떻게 작동하는지 완전히 이해하는 데 중요합니다. 그리고 이러한 요구 때문에 현장 지시 스핀 라벨링 및 EPR 기술이 이상적으로 적합하다고 생각합니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 단백질의 크기에 제한을 받지 않는다는 것입니다. 따라서 현장 지시 스핀 라벨링 및 EPR 분광법은 큰 단백질 역학 또는 멤브레인에서 재구성된 단백질을 연구하려는 경우 선택되는 기술이 될 것입니다. 부위 지시 돌연변이 유발에 의해 GLIC 유전자에 단일 시스테인 돌연변이를 도입합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 GLIC 시스테인 돌연변이의 하룻밤 배양을 설정합니다. 다음으로, 100ml의 멸균 인산칼륨 완충액을 오토클레이브 훌륭한 육수 매체에 추가합니다. 그런 다음 멸균 포도당, 카나마이신, 10ml의 하룻밤 배양물을 추가합니다.

섭씨 37도의 셰이커에서 250rpm으로 배양합니다. 50ml의 글리세롤을 첨가하고 600나노미터의 광학 밀도가 1.0에서 1.2에 도달할 때까지 배양물을 계속 흔듭니다. 200마이크로몰 IPTG로 세포를 유도한 후 쉐이커를 다시 250rpm으로 재설정하고 섭씨 18도에서 약 16시간 동안 추가로 배양합니다.

1리터 원심분리기 병에 담긴 세포를 8500배 G, 섭씨 4도에서 15분 동안 회전시켜 수확합니다. 상층액을 디캔팅하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 펠릿으로 병의 무게를 잰다. 배양물 1리터당 150ml의 얼음처럼 차가운 완충액 A에 박테리아 펠릿을 재현탁합니다.

세포를 섭씨 4도의 냉장실에서 세포 교란체를 통과시켜 균질화합니다. 대부분의 박테리아가 용해되도록 이 과정을 세 번 반복합니다. 14, 000 시간 G에 15 분 동안 세포를 원심 분리하십시오.

그런 다음 상층액을 피펫으로 빼내고 깨끗한 원심분리기 튜브에 넣습니다. 상등액을 168, 000 회 G에서 1 시간 동안 원심 분리 한 후 멤브레인 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 기울입니다. 1리터의 배양액에서 멤브레인 펠릿을 당겨 10%글리세롤이 보충된 버퍼 A에 최종 부피 50ml까지 재현탁합니다.

멤브레인 현탁액에 0.5g의 DDM을 추가하고 섭씨 4도에서 2시간 동안 영양을 공급합니다. 막 가용화 후에, 168, 1 시간 동안 000 시간 G에 원심분리에 의해 용해물에서 세포 파편을 제거하십시오. 그 동안 아밀로스 수지를 준비합니다.

피펫을 사용하여 3ml의 수지를 빈 폴리프로필렌 크로마토그래피 컬럼으로 옮깁니다. 10 베드 용량의 물을 3 회 통과시킨 다음 0.5 밀리 몰 DDM을 포함하는 10 베드 용량의 버퍼 A를 통과시켜 수지를 세척합니다. 원심분리 후 피펫을 사용하여 상층액을 부드럽게 꺼내고 깨끗한 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

배치 단위 결합을 위해 사전 평형 아밀로스 수지를 원뿔형 튜브에 추가합니다. 추출된 단백질을 섭씨 4도에서 2시간 동안 혼합물에 너트를 넣어 아밀로스 수지에 결합합니다. 다음으로, 전체 슬러리를 크로마토그래피 컬럼에 통과시키고 플로우스루를 수집합니다.

GLIC 단백질을 0.5 밀리몰 DDM 및 05 밀리오몰 TCEP 외에 40 밀리오몰 맥아당을 함유한 10 밀리리터의 버퍼 A로 희석합니다. TCEP는 시스테인 곁사슬의 산화를 방지합니다. 전체 용루석을 수집하십시오.

원심 함량을 사용하여 용출된 단백질을 밀리리터당 4-6mg으로 농축합니다. HRV 3C 프로테아제를 첨가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 현장 지시 스핀 라벨링을 수행하려면 먼저 프로테아제 분해 샘플에 MTSL 스핀 라벨의 10배 여유량을 추가하여 GLIC 단량체 대 MTSL 몰 비율이 1:10이 되도록 합니다.

1시간 배양 후, 5배 몰 초과 비율로 더 많은 스핀 라벨을 추가하고 다시 한 시간 동안 배양합니다. Buffer A 및 0.5 millimolar DDM으로 사전 평형화된 크기 배제 고속 단백질 액체 크로마토그래피 또는 FPLC 컬럼을 통해 샘플을 통과시켜 GLIC pentamers에서 절단된 MBP 태그와 초과 자유 스핀 라벨을 분리합니다. 원심 농축기를 사용하여 단백질 용액을 밀리리터당 약 8-10mg의 최종 농도로 농축하고 얼음 위에 놓습니다.

이제 샘플을 재구성할 준비가 되었습니다. 리포좀을 준비하려면 깨끗한 25ml 둥근 바닥 플라스크에 클로로포름 5ml를 헹구고 흄 후드의 질소 가스 흐름에서 플라스크를 건조시킵니다. 그런 다음 10mg의 아솔렉틴을 플라스크에 옮기고 지속적인 질소 가스 흐름으로 지질을 건조시킵니다.

클로로포름이 증발하면 플라스크를 한 시간 동안 진공 상태에 두어 완전히 건조되도록 합니다. 그런 다음 건조된 지질에 1ml의 재구성 버퍼 A를 추가하고 플라스크를 격렬하게 소용돌이쳐 지질 펠릿을 현탁액으로 만듭니다. 작은 단층 소포를 준비하려면 소포 용액이 다소 반투명해지고 덩어리가 관찰되지 않을 때까지 냉수 초음파 발생기에서 지질 현탁액을 초음파 처리합니다.

이 혼합물에 DDM을 최종 농도 4 밀리 몰로 첨가하고 실온에서 30 분 동안 배양합니다. 단백질을 재구성하려면 정제된 단백질을 지질 혼합물에 첨가하십시오. 온화한 교체를 가진 1 시간 동안 4 섭씨 온도에 표본을 배양한 다음, 완충기 A.Remove를 가진 15 밀리리터에 세제를 가두는 소수성 숨구멍을 가진 폴리스티렌 구슬을 사용하여 현탁액에 있는 잔여 세제를 묽게 하십시오.

80mg의 깨끗한 구슬을 추가하고 섭씨 4도의 너트레이터에서 밤새 리포좀 현탁액을 배양합니다. 다음 날, 컬럼 필터를 사용하여 리포솜을 25ml 초원심분리 튜브로 옮겨 비드를 제거하고 샘플을 25ml로 더 희석합니다. 168, 000 시간 G에서 샘플을 2 시간 동안 원심 분리 한 후, 상등액을 기울이고 100 마이크로 리터의 버퍼 B.To 사용하여 펠릿을 재현 탁탁하여 연속파 EPR 분광법을 수행하고 먼저 리포솜 현탁액을 200 마이크로 리터 튜브로 옮기고 원심 분리기를 사용하여 샘플을 펠릿

상등액을 버린 후 샘플은 EPR 측정 준비가 된 것입니다. 리포좀 샘플에서 가능한 한 많은 버퍼를 제거합니다. 완충액 교환을 수행하려면 피펫을 사용하여 20마이크로리터의 리포좀 펠릿을 마이크로분리 튜브로 옮깁니다.

180마이크로리터의 버퍼 D를 넣고 섭씨 42도에서 5분 동안 배양합니다. 샘플을 원심분리하고, 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고, 이 과정을 3회 반복하여 완전한 완충액 교환을 보장합니다. 가스 투과성 플라스틱 캐필러리는 스펙트럼 라인 모양과 용매 접근성을 모두 측정하는 데 적합합니다.

펠릿화된 프로테오리포솜에 모세관을 두드려 샘플을 내부로 끌어당기고 끝을 뼈 왁스로 밀봉합니다. 여기에 표시된 것은 MBP 태그의 단백질 분해 절단 후 스핀 표지된 GLIC의 겔 여과 크로마토그램을 통한 스핀 표지된 GLIC 돌연변이의 생화학적 특성입니다. 피크는 GLIC 펜타머 및 자유 MBP에 해당합니다.

SDS 페이지 겔은 겔 여과 전의 절단되지 않은 단량체 GLIC-MBP 융합 단백질과 겔 여과에서 추출한 MBP 및 GLIC 분획을 보여줍니다. 다양한 막 지질에서 재구성된 GLIC의 응집 상태를 모니터링하기 위한 FRET 기반 분석법을 수행했습니다. FRET 측정은 하룻밤 사이에 재구성한 후 샘플을 여러 번 동결-해동한 후 샘플에 대해 수행되었습니다.

재구성된 아솔렉틴 소포에서 절제된 인사이드 아웃 패치에서 GLIC는 신속한 용액 교환체를 사용하여 pH 점프에 의해 활성화됩니다. 채널은 약 10밀리초 후에 활성화되고 1-3초의 시간 상수로 둔감해지는 것으로 보입니다. 채널 활성화 중에 구조적 재배열이 관찰됩니다.

여기서, 공극 라이닝 M2 나선의 위치에 대한 연속파 전자 상자성 공명 스펙트럼은 pH 변화에 반응하여 진폭 및 블라인드 모양의 변화를 변위합니다. EPR 분광법은 당사의 고유 환경에서 막 단백질의 구조적 변화를 측정하기 위한 탁월한 구조 접근법이며, 고해상도 X선 구조 또는 Cryo-EM 구조에서 가려진 단백질 역학의 분자 세부 사항을 엿볼 수 있습니다. 이 기술을 사용하는 동안 돌연변이가 단백질의 올리고머 안정성이 낮고 좋지 않은 경우가 많다는 점을 명심하는 것이 중요합니다.

따라서 이러한 문제를 해결하기 위한 전략을 마련해야 할 수도 있습니다. 이러한 EPR 연구의 이러한 결과를 기능 측정과 결합하면 구조-기능 관계를 연구하기 위한 보다 완전한 그림을 얻을 수 있으며, 향후 기술 발전은 이 강력한 접근 방식을 사용하여 보다 정교한 지질 조건에서 더 복잡한 인간 채널을 연구하는 것을 목표로 합니다.