대사 표현형을 각기 다른 미성숙, 성숙 및 Tolerogenic 수지상 세포의 생성

이 프로토콜의 전반적인 목표는 실험 또는 백신 개발을 위해 단핵구에서 내성 및 성숙한 수지상 세포를 생성하는 것입니다. 이 방법은 수지상 세포의 발달, 성숙 및 항원 제시를 연구하기 위한 모델을 제공함으로써 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 실험을 위해 체외에서 많은 수의 수지상 세포를 생성할 수 있다는 것입니다.

세포분석기를 사용하여 살아있는 세포의 수를 계산하기 위해 미리 준비된 20마이크로리터의 말초 혈액 단핵세포 또는 PBMC 세포 현탁액을 20마이크로리터의 트리판 블루와 혼합하여 단핵구 농축을 시작합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상층액을 완전히 흡인하고 세포 펠렛을 10 내지 7번째 세포에 대해 80마이크로리터의 염색 완충액 농도로 다시 현탁합니다.

7번째 셀에 10개당 20마이크로리터의 CD-4 마이크로 비드를 추가합니다. 잘 섞어 섭씨 4도에서 15분 동안 세포를 배양합니다. 7번째 세포에 10개당 1ml의 염색 완충액으로 세포를 세척하고 세포를 원심분리합니다.

상등액을 완전히 흡인하고 세포 펠렛을 다시 현탁시킵니다. 최대 2배의 10에서 8번째 총 셀에 대한 중간 컬럼을 얻고 컬럼을 분리기의 자기장에 배치합니다. 다음으로, 500마이크로리터의 염색 완충액으로 컬럼을 헹굽니다.

세포 현탁액을 컬럼에 피펫으로 주입하고 컬럼을 통과하는 라벨링되지 않은 세포를 15ml 튜브에 수집합니다. 컬럼 아래에 새 15ml 튜브를 교체하고 500마이크로리터의 염색 완충액으로 컬럼을 세 번 세척합니다. 세척 사이에 새 염색 완충액을 추가하기 전에 컬럼 저장소가 비어 있는지 확인하십시오.

분리기에서 컬럼을 제거하고 새 15ml 튜브에 놓습니다. 1ml의 염색 완충액을 컬럼에 피펫팅하고, 플런저를 컬럼 안으로 단단히 밀어 자기 라벨링된 셀을 즉시 씻어냅니다. 그런 다음 새 컬럼에서 illuded fraction을 사용하여 자기 분리 단계를 반복하여 CD14 plus 세포의 순도를 높입니다.

CD14 플러스 단핵구 4세트를 0점 3에서 0점 5배, 10에서 6분의 1 농도로 6개의 웰 플레이트에 IL-4의 세포 배양 배지를 파종합니다. 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에서 5%의 CO2로 세포를 배양합니다. 4일차에 배양액에서 850마이크로리터의 배지를 제거하고 원심분리기를 합니다.

상등액을 흡입하고 펠릿을 1ml의 세포 배양 배지에 다시 현탁시킵니다. 세포 혼합물을 배양액에 다시 추가합니다. 5일째에 배지 1리터당 1마이크로리터의 비타민 D3 스톡과 1마이크로리터의 덱사메타존 스톡을 2세트에서 2세트로 첨가하여 내성 moDC를 생성합니다.

6일차에 GMCSF 밀리리터당 200나노그램과 IL-4 밀리리터당 200나노그램을 모든 세트에 추가합니다. GMCSF 및 IL-4로만 처리된 세트 중 하나에 LPS 밀리리터당 1마이크로그램을 추가하여 성숙한 moDC를 생성합니다. LPS 밀리리터당 1마이크로그램을 톨러겐 moDC 한 세트에 추가하여 LPS 톨러겐 moDC를 생성합니다.

마지막으로, 7일차에 PVS EDTA로 배양 접시를 세척하여 다양한 유형의 moDC를 수확합니다. 미성숙 moDC는 0일, 4일, 6일에 정제된 CD-14와 단핵구에 GMCSF 및 IL-4를 첨가하여 생성되었습니다. GMCF 및 IL-4 이후 비타민 D3와 덱사메타존을 첨가하면 미성숙 moDC가 내성 moDC로 분화되었습니다.

LPS는 미성숙 moDC의 성숙을 성숙 moDC로 유도하기 위해 추가되었습니다. 그리고 성숙에 대한 저항성을 확인하기 위해 LPS로 내성 moDC를 자극했습니다. DC 표면 마커를 분석한 결과, 성숙한 moDC는 가장 높은 수준의 성숙 마커인 HLA-DR, CD80, CD83 및 CD86을 발현하는 것으로 나타났습니다.

반대로, 내성 moDC는 미성숙 및 성숙 moDC에 비해 CD14, BDCA3 및 면역글로불린 유사 전사체의 발현이 증가한 것으로 나타났습니다. mytocondrial 활성을 반영하기 위해 빨간색 CMXRos를 사용하여 tolerogenic moDCs는 다른 moDC 분화 아형에 비해 더 높은 mytocondrial 활성을 갖는 것으로 관찰되었습니다. 개발 후 이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 백신 및 면역 요법 개발을 위해 수지상 세포의 대사 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.