환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

여기서 우리는 프로토콜이 메틸 바인딩 DNA 캡처 시퀀싱 (MBDCap-서열 또는 MBD-SEQ) 기술과 이후의 생물 정보학 분석 파이프 라인을 사용하여 대규모 임상 환자 스크리닝 연구에서 게놈 전체 DNA 메틸화를 조사하기 위해 제시한다.

이 기술의 전반적인 목표는 대규모 환자 코호트에서 게놈 전체의 DNA 메틸화 환경을 체계적으로 조사하는 것입니다. 이 방법은 후성유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 특히 DNA 메틸화 환경의 어느 영역이 환자에서 조절이 해제되는지와 관련하여 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비용 효율적인 방식으로 많은 수의 환자를 조사할 수 있다는 것입니다.

이 기술은 기존 바이오마커를 조사하고 새로운 바이오마커를 식별할 수 있기 때문에 환자의 치료 및 진단에 긍정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이 방법은 환자 코호트에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 마우스 유래 샘플에서 배양된 세포주에서 유래한 세포의 DNA 메틸화와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. Ya-Ting Hsu 박사와 함께 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 기술자인 Mr.Joseph Liu가 맡을 것입니다.

염기서열분석 부분은 염기서열분석 코어의 기술자인 Ms.Dawn Garcia가 시연할 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 종양 또는 정상 조직에서 게놈 DNA를 분리한 후 1.2마이크로그램의 총 게놈 DNA를 96마이크로리터의 TE 버퍼와 24마이크로리터의 5X 바인드 세척 버퍼에 추가하여 120마이크로리터 용액을 만듭니다. DNA 용액을 30초 동안 초음파 처리한 다음 30초 동안 그대로 둡니다.

초음파 처리를 총 20-25 회 반복합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 고감도 DNA 키트가 있는 바이오분석기 시스템을 사용하여 1마이크로리터의 초음파 처리된 DNA 용액을 실행하여 단편의 크기를 확인합니다. 150에서 350 염기 쌍 범위에 있어야 합니다.

단일 분획 용리를 수행하려면 저염 완충액과 고염 완충액의 일대일 용액을 만들어 용출 완충액을 준비합니다. 200마이크로리터의 용리 완충액을 사용하여 메틸 결합 DNA 또는 MBD 비드를 재현탁하고 회전 믹서에서 3분 동안 현탁액을 배양합니다. 배양 후 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 놓은 다음 비드의 피펫 끝을 건드리지 않고 액체를 조심스럽게 피펫으로 주입하고 깨끗한 DNase가 없는 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

이 샘플을 얼음에 보관하십시오. 두 번째 샘플에 대해 용리를 반복하고 첫 번째 샘플과 동일한 튜브에 수집합니다. 포획되지 않은 각 세척 및 희석 분획에 1마이크로리터의 글리코겐, 3몰 아세트산 나트륨 부피의 10분의 1, pH 5.2 및 100% 에탄올 2개의 샘플 부피를 추가합니다.

용액을 잘 혼합한 후 섭씨 영하 80도에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 11, 363 회 g 및 섭씨 4도에서 15 분 동안 반응을 원심 분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 버리고 500마이크로리터의 차가운 70% 에탄올을 첨가합니다.

에탄올 세척을 반복하기 전에 튜브를 다시 돌립니다. 펠릿을 5분 동안 자연 건조시킵니다. 그런 다음 DNase가 없는 물이나 완충액을 사용하여 다시 현탁시킵니다.

텍스트 프로토콜에 따라 DNA의 총량이 20나노그램 이상인지 확인합니다. 그런 다음 DNA를 얼음에 넣거나 나중에 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. DNA 염기서열분석 라이브러리 준비를 위해 완전 자동화된 라이브러리 구성 시스템을 사용하고 제조업체에서 제공한 표준 프로토콜을 따르십시오.

라이브러리 준비를 위해 200 - 400 염기쌍 길이의 DNA 단편을 선택합니다. DNA 염기서열분석 라이브러리를 준비한 후 반응을 제거하고 형광 정량 분석 시스템을 사용하여 DNA 염기서열분석 라이브러리를 정량화합니다. PCR 증폭 반응을 설정하려면 PCR 튜브에 15마이크로리터의 DNA 염기서열분석 라이브러리, 25마이크로리터의 PCR 마스터 믹스, 2마이크로리터의 PCR 프라이머 믹스 및 8마이크로리터의 물을 추가합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 프로그램을 사용하여 PCR 믹스 제조업체의 권장 사항에 따라 필요에 따라 조정합니다. 2-10 밀리몰의 라이브러리 DNA를 생성하기에 충분한 사이클을 수행합니다. PCR 반응을 세척한 후 각 샘플에 바코드를 부착하고 4개의 샘플을 플로우 셀의 한 레인으로 끌어옵니다.

염기서열분석의 표준 50 염기쌍 single-read 프로토콜을 사용하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 생물정보학을 수행합니다. 정상 조직에 관하여 종양에서 차별적으로 메틸화되는 다른 게놈 지구의 맞은편에 CpG 섬을 확인하기 위하여 MBD 모자 탐색을 사용하여, 이 학문은 유전자 프로모터에서 있는 총 CpG 섬 중에서, 19.5%가 정상과 비교된 종양에 있는 차별적인 메틸화를 보였다는 것을 계시했습니다.

유사하게, 조사된 인트라인성 CpG 섬의 55.2%가 차등 메틸화를 보여주었습니다. 인트라제닉 프로모터는 28.1%를 보였고, CpG 섬이 없는 유전자 프로모터의 경우 1.8%가 차등 메틸화를 보였다. 이 히트 맵은 77개의 유방 종양, 10개의 유방 정상 조직 및 38개의 유방암 세포주에 걸쳐 차등적으로 메틸화된 영역을 명확하게 보여줍니다.

이 그림에서 메틸화는 확인된 표적 유전자 SFRP1의 프로모터 CpG 섬의 서로 다른 CpG 부위에 있는 두 명의 환자에서 비재발성 대 재발성의 두 자궁내막암 하위 그룹에서 정량화되었습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4-5일 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 먼저 테스트 중인 게놈 DNA의 품질을 테스트해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 파이로시퀀싱과 같은 추가 방법을 수행하여 변경된 식별된 차등 농축 영역에서 정확한 CpG는 무엇입니까? 개발 후 이 기술은 후성유전학 분야의 연구자들이 대규모 환자 코호트에서 DNA 메틸화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 MBD 캡 염기서열분석 기술을 사용하여 환자 샘플에서 게놈 전체 DNA 메틸화를 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 때때로 FFP 및 DNA 샘플과 같은 DNA의 고품질을 포착하기 어려울 수 있으므로 절차를 수행할 때 항상 게놈 DNA에 대한 적절한 평가가 이루어져야 합니다.