3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

이 실험 방법의 전반적인 목표는 자연 조직을 모방한 3차원 하이드로겔 내에 내장된 세포의 FRET 이미징을 사용하여 세포 내 신호전달을 실시간으로 연구할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 최적의 생체 재료 개발 및 엔지니어링된 3D 미세 조직에서 고처리량 약물 스크리닝과 같은 발생 생물학, 약리학 및 재생 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 FRET가 기존의 광시야 현미경 시스템을 사용하여 수많은 하이드로겔 유형의 많은 세포에 사용할 수 있다는 것입니다.

하이드로겔 주조를 위한 주형을 제작하고 배양된 세포를 하이드로겔 용액에 현탁시킨 후, 텍스트 프로토콜에 따라 조직 배양 후드에 멸균 기술을 사용하여 주조 주형에 전구체가 포함된 세포를 추가합니다. 교차결합하기 전에 하이드로겔 전구체에 부유하는 세포를 센터퓨징하여 세포를 단일 초점면에 제한하고 평면 외 신호를 최소화함으로써 이미징을 최적화합니다. 다음으로, PC 하이드로겔을 가교하려면 두께 밀리미터당 제곱센티미터당 3.2줄과 동일한 노출 시간 동안 UVA 광원을 사용하여 전구체가 포함된 세포를 조사합니다.

또는 더 저렴한 휴대용 치과용 램프를 사용하십시오. 하이드로겔을 과도하게 노출시키면 세포 생존율이 감소하므로 피하십시오. 물리적으로 가교하는 하이드로겔은 대신 섭씨 37도에 배치됩니다.

가교 후 PDMS 하이드로겔 주조 금형을 제거하고 이전에 준비된 PDMS 접시로 교체하십시오. 멸균 주걱을 사용하여 PDMS를 유리에 눌러 부착합니다. 하이드로겔이 잠긴 상태를 유지하기 위해 커버슬립을 사용하여 PDMS 접시에서 생성된 웰에 페놀이 없는 무혈청 배지 또는 화학적으로 정의된 배지를 추가합니다.

접시를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 하이드로겔이 든 PDMS 접시를 현미경 스테이지에 고정하고 오일을 대물렌즈에 바르면 투과광을 사용하여 이미징을 위한 최소 15개의 세포를 찾고 형광 이미징으로 transfection을 확인합니다. 현미경 소프트웨어에서 시야 중앙 근처의 몇 개의 셀 중에서 선택하여 FRET 이미지 채널에 대한 카메라 설정을 구성하고 텍스트 프로토콜에 따라 이미지 채널당 노출 및 게인을 최적화합니다.

하이드로겔의 중심에 가깝고, 상대적으로 평평한 조명 필드 내에 있고, 너무 밝지도 어둡지도 않으며, 00에서 1.0 사이의 FRET 비율을 가진 셀을 선택하십시오. 그런 다음 여러 시야를 선택하여 최소 15개의 형질 주입된 세포에 대한 이미지를 획득합니다. 노출을 제한하기 위해 완료되면 조명을 끕니다.

타임랩스 이미지 획득에 대한 캡처 속도를 구성하려면 캡처의 주기를 입력합니다. 기준선 신호 캡처에는 빠른 속도(예: 시야당 5초마다)를 사용하고, 후속 장기 신호 동역학에는 더 느린 속도를 사용합니다. 지금 실행을 선택하여 이미지 획득을 시작하고 5분 동안 이미지를 캡처하여 지정된 시야에서 프로브 응답에 대한 기준선을 설정합니다.

5분간의 이미지 획득 후, 원하는 작용제 또는 길항제에 피펫팅하고 피펫팅으로 혼합한 후 이미징을 계속합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 FRET 보정을 수행한 후 현미경 소프트웨어에서 배경 관심 영역 아이콘의 화살표를 선택하고 타원형 배경 관심 영역 그리기를 선택합니다. 셀 근처의 시야당 하나의 관심 영역(ROI)을 그리고 지정하여 배경 수준을 정의합니다.

Keep Updating Background Offset(배경 오프셋 업데이트 유지)이 선택되어 있는지 확인한 다음 Background Region of Interest(배경 관심 영역) 아이콘을 클릭하여 배경 관심 영역 보기를 활성화합니다. 또는 관심 영역 아이콘을 선택하고 관심 영역 속성을 배경 관심 영역으로 사용으로 설정하면 관심 영역이 각 멀티 포인트에서 다릅니다. 관심 영역 배경 아이콘을 사용하여 관심 영역을 사용하여 배경 빼기를 선택합니다.

팝업 창의 Subtract Background Region of Interest(관심 배경 영역 빼기)에서 Every Image(모든 이미지)를 선택하고 Apply To(적용 대상)에서 All Frames(모든 프레임)를 선택합니다. 각 시야에 대해 수용체 방출 채널과 이진 마스크를 사용하여 셀 주변의 관심 영역을 정의하려면 Binary, Define Threshold 메뉴를 사용하고 Apply To Current Frame을 선택합니다. 그런 다음 하한 임계값을 조정하여 셀을 선택합니다.

그런 다음 필요한 경우 Binary Close 함수를 사용하여 이진 마스크의 구멍을 채웁니다. 그런 다음 Region of Interest 아이콘을 사용하여 Copy Binary to Region of Interest를 선택하여 이진 마스크를 관심 영역으로 저장합니다. 후속 보기 영역에 대한 관심 영역을 기존 관심 영역 풀에 추가합니다.

관심 있는 가상 영역을 삭제합니다. 그런 다음 관심 영역(Regions of Interest)을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 해당 속성이 표준 관심 영역으로 사용(Use as Standard Region of Interest)과 관심 영역(Regions of Interest)이 각 멀티 포인트에서 다른지 확인합니다. 관심 있는 셀 영역은 수동으로 그릴 수 있지만 가짜 값을 제거하려면 주의해야 합니다.

이 프로토콜에는 평면 조명 필드 밖에 있는 셀과 평면 필드가 없는 현미경에 대한 절차가 포함되어 있습니다. 겔화 전 하이드로겔 전구체의 원심분리는 커버슬립 근처의 한 초점면에서 세포의 수를 최대화했습니다. 이를 통해 배경 소음을 최소화하고 이미징 처리량을 높일 수 있었습니다.

이 FRET 실험에서는 담금질 방출 또는 QE, FRET 비율 계산을 위해 단일 사슬 이진 ICUE1 프로브에 대해 QE가 여기 및 방출에 대해 CFP CFP와 같고 여기 및 방출에 대해 수용체 방출이 YFP YFP와 같은 두 개의 이미지만 필요했습니다. 여러 개의 세포가 여기에 표시된 바와 같이 균질한 조명 영역 내에 상주하는 다중 시야를 선택했습니다. 채널 신호의 백그라운드 보정 및 세포 분석을 위한 ROI는 실험 시작부터 임계값 수용체 방출 이미지를 사용하여 지정되었습니다.

또한, 본 명세서에서 볼 수 있듯이, 충분한 probe를 발현하는 세포를 선택하였다. 픽셀당 QE 및 민감 방출 FRET 비율 및 셀당 평균 FRET 비율을 계산했습니다. SE 비율의 역을 계산하고 두 비율을 모두 정규화했습니다.

포스콜린 자극의 밑에, QE와 SE에 근거한 Fret 비율은 둘 다 연골 세포에 있는 증가한 주기적인 AMP 활동을 검출합니다. 물리적으로 가교결합된 겔과 화학적으로 가교결합된 겔은 모두 시간이 지남에 따라 QE FRET 비율의 증가를 보였으며, 이는 포스콜린 첨가에 대한 증가된 순환 AMP 신호 반응을 나타냅니다. 이 절차는 FRAP, flim fret, fret 및 이방성 측정과 같은 다른 현미경 기술과 함께 사용하여 서로 다른 미조직 유형 간의 투과성 및 세포 단일화의 차이점이 무엇인지와 같은 질문에 답할 수 있습니다.

가교결합은 PDMS 근처에서 소멸되기 때문에 하이드로겔 자체보다 직경이 약간 더 큰 광가교결합 하이드로겔용 금형을 설계하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.