노화의 인간의 질병에 관여 유전자를 연구에 사용 된 유전자 변형 마우스에 대한 표현형 요법

이 테스트 요법의 전반적인 목표는 행동 표현형과 조직의 구조 및 기능에 대한 후속 세부 조사를 지시하기 위해 초기 표현형 파이프라인으로 사용할 수 있는 일련의 간단한 테스트를 확립하는 것입니다. 인간 질병의 행동 및 세포 표현형이 마우스 모델에 다시 요약되어 있는지 여부. 이 기술의 주요 장점은 상당한 투자 없이 이러한 실험에 대한 사전 경험이 없는 실험실에서 테스트를 수행할 수 있지만 추가 세부 연구에 대한 정보를 제공할 수 있다는 것입니다.

출생 후 4일차부터 10일차까지 매일 뒷다리 검사를 실시하여 근위 뒷다리 근육의 근력, 약점 및 피로를 평가합니다. 시작하려면 쥐가 30 분 동안 테스트 영역에 적응하도록합니다. 한편, 500% 에탄올로 씻어낸 다음 하나 또는 두 개의 면봉을 튜브 바닥에 밀어 넣어 새로운 700ml 원추형 튜브를 준비합니다.

테스트를 위해 이 튜브를 수직 위치에 고정합니다. 테스트를 받지 않을 때는 새끼를 댐과 함께 보관하여 온도를 유지하십시오. 30 분 동안 적응 한 후 새장에서 강아지를 꺼내 체중을 기록하십시오.

그런 다음 뒷다리로 신생아를 튜브 가장자리 위로 부드럽게 매달아 강아지가 솜을 향하도록 합니다. 그런 다음 강아지의 당기기 시도 횟수를 세고 떨어지는 대기 시간을 측정합니다. 30초 동안 기다린 후 테스트를 반복합니다.

두 번째 테스트 후 강아지에게 마커로 레이블을 지정합니다. 그런 다음 집 새장에서 가져온 침구로 강아지를 부드럽게 문지르고 댐으로 되돌려 놓습니다. 나이가 많은 P8 강아지는 표시할 수 없기 때문에 발가락 깎기로 식별합니다.

다음 강아지로 진행하기 전에 70% 에탄올로 시험관을 닦아냅니다. P19에서 P21까지 매일 Weanling Observation Test를 실시하여 움직임 및 일반적인 활동 수준을 평가합니다. 쥐가 30분 동안 테스트 영역에 적응하도록 하는 것으로 시작합니다.

새끼들이 적응하는 동안 경기장을 준비하십시오. 플렉시글라스 테스트 박스를 2인치 정사각형의 6x6 그리드로 표시하세요. 상자를 사용하기 전에 70% 에탄올로 청소하십시오.

그런 다음 전체 상자의 측면 보기가 시야를 채우도록 비디오 카메라를 배치합니다. 참신함이 도입되지 않도록 주변 환경의 모양을 표준화합니다. 테스트 전에 이유식을 깨끗한 홀딩 컵에 옮기고 무게를 기록하십시오.

그런 다음 비디오 녹화가 시작되었습니다. 먼저 마우스 식별 번호, 나이 및 현재 날짜가 표시된 테스트 신분증을 촬영합니다. 그런 다음 홀딩 컵에서 중앙 사각형으로 마우스를 옮깁니다.

3분 동안 양쪽 앞발이 교차하는 선의 수를 세십시오. 3분 후 마우스를 깨끗한 케이지에 다시 넣고 비디오 녹화를 종료합니다. 모든 테스트 사이에 70% 에탄올로 상자를 청소하십시오.

비디오에서 마우스가 두 앞발을 지탱하지 않고 서 있는 양육 이벤트를 계산합니다. 또한 양쪽 앞발이 청소에 참여했을 때 발생하는 그루밍 이벤트를 계산합니다. 신경근 강도를 평가하기 위해 P22와 P26 사이의 교일로 악력 테스트를 수행합니다.

평소와 같이 쥐가 테스트 영역에 적응할 수 있도록 30분을 줍니다. 테스트 장치는 메쉬 그리드가 있는 플렉시 유리 상자입니다. 70% 에탄올로 둘 다 청소하십시오.

그런 다음 상자 바닥에 패딩용 버블 랩 층을 깔고 버블 랩을 종이로 덮어 배설물을 흡수합니다. 테스트 마우스를 분리하여 개별 컵에 넣습니다. 이제 첫 번째 마우스를 철망 중앙에 놓고 메쉬를 상자의 부드러운 표면에서 10-20cm 위로 천천히 반전시킵니다.

떨어지는 대기 시간을 측정하거나 마우스가 떨어지지 않는 경우 60초 후에 테스트를 종료합니다. 그런 다음 첫 번째 마우스를 홀딩 컵에 다시 넣습니다. 테스트 사이에 메쉬를 70% 에탄올로 닦고 버블 랩 위에 종이를 교체합니다.

그런 다음 그룹의 다른 두 마리의 마우스에 대해 테스트를 수행합니다. 각 마우스를 한 번 테스트한 후 마우스당 세 번 시도하기 위해 프로세스를 두 번 더 반복합니다. 한 그룹에 생쥐가 3마리 미만인 경우, 임상시험 간 회복 시간을 최소 5분 이상 확보해야 합니다.

NADH Diaphorase Stain의 경우 새로 만든 NADH 용액과 새로 만든 NBT 용액을 동일한 부피로 결합하십시오. 그런 다음 각 슬라이드에 1ml의 염색 용액을 추가하고 섭씨 37도의 가습 챔버에서 30분 동안 슬라이드를 배양합니다. 숙시네이트 수소 분해 효소 염색의 경우, 0.1 몰 숙시네이트 나트륨, 1.25 몰 NBT 및 0.2 몰 인산염 완충액의 용액을 준비합니다.

그런 다음 각 슬라이드에 1밀리리터를 추가합니다. 슬라이드를 가습실에 넣고 섭씨 37도에서 한 시간 동안 배양합니다. 두 염색 중 하나로 배양한 후 염색 용액을 흡인하고 증류수로 슬라이드를 세 번 세척합니다.

그런 다음 농도를 높이거나 낮추는 일련의 아세톤 수조를 통해 슬라이드를 씻으십시오. 아세톤의 각 농도에 대해 세척당 2분씩 3회 세척을 수행합니다. 마지막으로 증류수로 슬라이드를 세 번 헹굽니다.

그런 다음 수성 매체로 슬라이드를 장착합니다. HTRA2 발현이 없는 마우스는 설명된 테스트 배터리를 사용하여 검사하고 깔짚 짝 대조군과 비교했습니다. P4와 P6 사이에는 풀 횟수나 낙하 지연 시간의 변화가 나타나지 않았습니다. P7과 P10 사이에서는 신경근 근력의 감소가 관찰되었다.

활성 테스트에서 HTRA2 녹아웃 마우스의 활성이 감소했습니다. HTRA2 녹아웃 마우스는 또한 철망 그립 테스트에서 강도 감소를 보였습니다. H 및 E 염색은 HTRA2 녹아웃 마우스가 P35의 대조군에 비해 망막 구조에 뚜렷한 변화가 없음을 보여줍니다.

마지막으로, 전자 수송 사슬 복합체 활성에 대한 조직화학적 염색을 사용하여 호흡 효소 기능의 변화를 확인했습니다. HTRA2 녹아웃 마우스는 대조군에 비해 염색이 감소했습니다. 이것은 소뇌와 선조체에서는 관찰되었지만 피질에서는 나타나지 않았습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 유전자 변형 마우스의 활동과 신경근 강도를 평가하는 방법과 이러한 연구를 세포 축과 결합하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.