2016년 6월 23일
폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 아비딘 코팅 유리 표면에 테더링되고 미세유체 전단 흐름으로 늘어난 형광 단백질 DNA 결합 펩타이드(FP-DBP) 염색 대형 DNA 분자를 시각화하는 접근 방식을 제시합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 변형된 유리 표면에서 단일 분자 DNA를 조작하기 위해 에피형광 현미경을 위한 편리한 DNA 분석 시스템을 만드는 것입니다. 이 방법은 DNA 시각화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. DNA 자체뿐만 아니라 DNA 결합 단백질 및 기타 작은 분자를 검사 할 때.
이 기술의 주요 장점은 움직이는 DNA를 쉽게 관찰하고 분석할 수 있다는 것입니다. 시작하려면 유리 커버슬립을 PTFE 랙에 놓고 PTFE 나사산 밀봉 테이프 조각을 사용하여 제자리에 고정합니다. 커버 슬립을 감싼 후 청소 절차 중에 랙을 처리하는 데 사용할 5cm 길이의 테이프 조각을 남겨 둡니다.
흄 후드에서 350밀리리터의 황산과 150밀리리터의 과산화수소를 1리터 유리 비커에 결합하여 피라냐 에칭 용액을 만듭니다. 그런 다음 커버슬립 랙을 용액에 넣습니다. 2시간 후 비커를 비우고 커버슬립을 탈이온수로 철저히 헹굽니다.
비커에 있는 물의 PH가 중성 PH에 도달할 때까지 커버슬립을 계속 헹굽니다. 그런 다음 비커 콘탠 워터에 커버 슬립 랙을 30 분 동안 초음파 처리하여 유리 기판을 청소하고 파생시킵니다. 아미노실란화 직전의 비커에서 물을 비웁니다. 먼저 깨끗한 폴리프로필렌 용기에 200ml의 메틸 알코올에 2ml의 알콕시실란과 10ml의 빙초산을 첨가하여 아미노실란화 용액을 준비합니다.
그런 다음 깨끗한 커버 슬립을 용액에 넣습니다. 그런 다음 세척된 커버슬립을 준비된 용액에 넣고 실온에서 100rpm으로 30분 동안 흔듭니다. 다음으로, 유도체화된 커버슬립으로 용기를 75와트에서 15분 동안 초음파 처리합니다.
그런 다음 실온에서 100rpm으로 최소 30분 동안 다시 흔듭니다. 완료되면 비커에서 용액을 비우고 커버슬립을 조심스럽게 세 번 헹굽니다. 한 번은 메틸 알코올로, 두 번은 에틸 알코올로 복용하십시오.
최종 헹굼 후 커버슬립을 에틸 알코올에 보관하고 2주 이내에 사용하십시오. 먼저 0.1 어금니의 중탄산나트륨 용액 10ml를 만들고 0.22 미크론 주사기 필터를 통해 여과합니다. 그런 다음 비오틴 PEG 숙시니미딜 카보네이트 2mg과 PEG 숙시니미딜 발레레이트 80mg을 여과된 중탄산나트륨 용액 350마이크로리터에 용해시킵니다.
차광 튜브를 사용하여 빛으로부터 용액을 보호하십시오. 관을, 10 초 동안 격렬하게 소용돌이치고, 그 후에, 어떤 거품든지 제거하기 위하여 10, 000 x g에 1 분 동안 그것을 원심분리하십시오. 다음으로, 유리 슬라이드를 아세톤으로 헹구고 에틸 알코올을 헹굽니다.
헹구면 슬라이드를 공기 중에서 완전히 건조시킵니다. PEG 용액 50마이크로리터 방울을 깨끗한 유리 슬라이드에 떨어뜨립니다. 아미노 실란화된 커버슬립을 약간의 각도로 물방울에 천천히 내려 커버슬립 아래에 기포가 생성되지 않도록 합니다.
그런 다음 슬라이드를 실온에서 최소 3시간에서 하룻밤 동안 평평하고 어둡고 가습된 챔버에 놓습니다. 완료되면 잔류 PEG 용액을 차광 튜브에 밀봉하고 섭씨 4도로 유지합니다. 배양 후 PEGylated 커버슬립을 탈이온수로 철저히 헹구고 사용할 때까지 어둡고 건조한 곳에 보관하십시오.
플로우 챔버를 만들려면 아크릴 홀더에 양면 접착 테이프 스트립을 올려 입구 및 출구 구멍에 수직으로 정렬되고 채널 구멍을 흔들지 않도록 합니다. 그런 다음 피펫 팁을 사용하여 테이프를 문질러 채널을 밀봉합니다. 다음으로, PEGylated 면이 아래를 향하도록 PEGylated 커버슬립을 테이프 상단에 놓아 흐름 챔버를 만듭니다.
용액이 누출되는 것을 방지하려면 양면 테이프가 놓인 부분 위로 커버슬립 상단을 누르십시오. 그런 다음 챔버 가장자리에 빠르게 건조되는 에폭시 접착제를 추가하여 제자리에 고정합니다. 그런 다음 2.5cm 길이의 튜브 조각을 가스 밀폐 주사기에 연결하고 에폭시 접착제로 조인트를 밀봉합니다.
그런 다음 주사기에서 나오는 튜브에 길고 유연한 튜브를 연결합니다. 그리고 다시, 에폭시 접착제로 조인트를 밀봉하십시오. 주사기에 연결된 튜브에 탈이온수를 채우고 기포가 없는지 확인합니다.
다음으로, 에폭시 접착제로 밀봉된 플로우 챔버의 구멍에 튜브를 삽입합니다. 그리고 저장소로 사용할 200마이크로리터 피펫 팁을 다른 구멍에 놓습니다. 주사기 펌프의 유속을 분당 50마이크로리터로 설정합니다.
그런 다음 20마이크로리터의 아비딘 단백질 용액을 챔버에 넣고 10분 동안 그대로 둡니다. 다음으로, 20마이크로리터의 비오틴화 올리고 데옥시 뉴클레오티드를 주사기에 로드합니다. 챔버로 흘러 넣고 10분 동안 그대로 두십시오.
말단 전이효소를 사용하는 경우 올리고 데옥시 뉴클레오티드의 로딩을 건너뜁니다. 그런 다음 20마이크로리터의 DNA 용액을 주사기에 넣고 분당 10마이크로리터의 속도로 챔버로 흘려 넣은 다음 30분 동안 그대로 둡니다. 30분 배양 후 분당 50마이크로리터로 40마이크로리터의 1X TE 버퍼로 플로우 챔버를 세척합니다.
세척이 완료되면 80 나노 어금니의 농도에서 동일한 FP-DBP 40 마이크로 리터를 챔버에 로드하고 1X TE.To 에서 DNA 분자의 전체 스트레치 범위를 확인하고 사용 된 DNA 길이에 따라 다른 유속을 적용합니다. 형광 현미경을 사용하여 60X 대물 렌즈로 DNA를 관찰합니다. 다음은 표면에 묶여 있는 박테리오파지 람다 DNA 분자가 비오틴화된 상보적 올리고 뉴클레오티드와의 결찰 후 흐름에 의해 늘어나는 것을 보여주는 형광 현미경 비디오입니다.
유동 하에서 완전히 길쭉한 DNA 분자는 길이가 16.5미크론입니다. 대조적으로, 박테리오파지 T4 DNA 뭉레큘은 유동 상태에서 56.4미크론 길이로 늘어났습니다. 이 신장은 되돌릴 수 있으며 DNA는 여러 번 확장되고 이완될 수 있습니다.
이 동영상을 시청한 후에는 대규모 DNA 분석에서 FP-DBP를 사용하는 방법과 DNA 폴리머의 스트레칭 및 이완을 시연하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 기사는 형광 단백질 DNA 결합 펩타이드(FP-DBP)로 염색된 큰 DNA 분자를 시각화하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 이러한 분자를 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 아비딘 코팅된 유리 표면에 고정하고 미세유체학적 전단 흐름을 사용하여 이를 늘이는 것을 포함합니다.
Direct visualization of surface-tethered large DNA molecules using fluorescent protein DNA binding peptides (FP-DBP) enables precise interrogation of DNA-protein interactions at the single-molecule level. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma discovery pipelines. The method enhances predictive confidence for downstream assay development and screening workflows.
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to assay development and preclinical research, supporting lead identification and target validation.