펩타이드를 결합 형광 단백질 DNA와 표면 닿는 큰 DNA 분자의 시각화

본 절차의 전반적인 목표는 에피형광 현미경을 위한 편리한 DNA 분석 시스템을 구축하여, 개질된 유리 표면 위에서 단일 분자 DNA를 조작하는 것입니다. 이 방법은 DNA 자체뿐만 아니라 DNA 결합 단백질 및 기타 소분자를 검토할 때, DNA 시각화 분야의 핵심 질문에 대한 해답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 이동하는 DNA를 용이하게 관찰하고 분석할 수 있다는 점입니다. 우선, PTFE 랙 위에 유리 커버슬립을 놓은 다음, PTFE 나사 밀봉 테이프를 사용하여 고정합니다. 커버슬립을 감싼 후, 세척 과정 중 랙을 다루는 데 사용할 수 있도록 테이프를 5 cm 길이로 남겨둡니다.

흄 후드 내에서, 1L 유리 비커에 황산 350 millileters와 과산화수소 150 milliliters를 혼합하여 피라냐 식각액을 조제합니다. 그다음, 커버슬립 랙을 해당 용액에 넣습니다. 2시간 후, 비커를 비우고 커버슬립을 탈이온수로 충분히 세척합니다.

비커 속 물의 pH가 중성이 될 때까지 커버슬립을 계속 헹굽니다. 그다음, 유리 기판을 세척하고 유도체화하기 위해 물이 담긴 비커에 커버슬립 랙을 넣고 30분 동안 초음파 처리합니다. 아미노실란화 직전에 비커의 물을 비웁니다. 우선, 깨끗한 폴리프로필렌 용기에 methyl alcohol 200 milliliters와 alkoxysilane 2 milliliters, 그리고 glacial acetic acid 10 milliliters를 넣어 아미노실란화 용액을 준비합니다.

이어서 깨끗한 커버슬립을 용액에 넣습니다. 그런 다음, 세척된 커버슬립을 준비된 용액에 넣고 실온에서 100 rpm으로 30분 동안 흔들어 줍니다. 다음으로, 유도체화된 커버슬립이 들어 있는 용기를 75 watts에서 15분 동안 초음파 처리합니다.

그 다음, 상온에서 100 rpm으로 최소 30분 동안 다시 흔들어 줍니다. 완료되면 비커에서 용액을 비우고 커버스립을 세 번 조심스럽게 헹굽니다. 메틸 알코올로 한 번, 에틸 알코올로 두 번 헹굽니다.

최종 세척 후, 커버슬립을 에틸 알코올에 보관하고 2주 이내에 사용하십시오. 먼저, 0.1 M 탄산수소나트륨 용액 10 mL를 제조하고 0.22 µm 시린지 필터로 여과하십시오. 그다음, 여과된 탄산수소나트륨 용액 350 µL에 biotin PEG succinimidyl carbonate 2 mg과 PEG succinimidyl valerate 80 mg을 녹이십시오.

차광 튜브를 사용하여 용액을 빛으로부터 보호하십시오. 튜브를 10초 동안 강하게 볼텍싱한 후, 10,000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 기포를 제거하십시오. 다음으로, 유리 슬라이드를 아세톤으로 헹군 후 에틸알코올로 헹구십시오.

세척 후 슬라이드를 완전히 자연 건조하십시오. 깨끗한 유리 슬라이드 위에 PEG 용액 50 microliter 한 방울을 떨어뜨립니다. 커버글라스 아래에 기포가 생기지 않도록 아미노 실란 처리된 커버글라스를 약간 기울여 액적 위에 천천히 내립니다.

그런 다음, 슬라이드를 수평이 맞고 어두우며 습도가 유지되는 챔버에 넣고 실온에서 최소 3시간에서 하룻밤 동안 보관합니다. 작업이 끝나면 남은 PEG 용액을 차광 튜브에 밀봉하여 4°C에서 보관하십시오. 배양 후, PEG화된 커버슬립을 탈이온수로 충분히 헹구고 사용 전까지 어둡고 건조한 곳에 보관합니다.

유동 챔버를 제작하려면 양면 접착테이프 조각을 아크릴 홀더 위에 배치하되, 유입구 및 유출구 구멍과 수직으로 정렬되도록 하고 채널 구멍을 방해하지 않도록 합니다. 그 다음, 피펫 팁을 사용하여 테이프를 문질러 채널을 밀봉합니다. 이어서, PEG화된 커버슬립의 PEG화된 면이 아래로 향하게 하여 테이프 위에 놓아 유동 챔버를 만듭니다.

용액의 누출을 방지하려면 양면테이프가 부착된 영역 위에 커버슬립 상단을 눌러 고정하십시오. 그런 다음, 챔버의 가장자리에 속건성 에폭시 접착제를 도포하여 위치를 고정합니다. 다음으로, 2.5 centimeter 길이의 튜브 조각을 가스 밀폐형 주사기에 연결하고 접합부를 에폭시 접착제로 밀봉합니다.

그 다음, 주사기에서 연결된 튜브에 길고 유연한 튜브를 연결합니다. 그리고 다시 한번 접합부를 에폭시 접착제로 밀봉합니다. 주사기에 연결된 튜브에 기포가 생기지 않도록 주의하며 탈이온수로 채웁니다.

다음으로, 에폭시 접착제로 밀봉된 유동 챔버의 구멍에 튜브를 삽입합니다. 그리고 다른 구멍에는 저장소로 사용할 200 µL 피펫 팁을 배치합니다. 시린지 펌프의 유속을 50 µL/min으로 설정합니다.

그 다음, 20 µL의 avidin 단백질 용액을 챔버에 흘려주고 10분 동안 유지합니다. 이어서, 20 µL의 biotinylated oligo deoxy nucleotides를 시린지에 로딩합니다. 이를 챔버에 흘려주고 10분 동안 유지합니다.

말단 전이효소(terminal transferase)를 사용하는 경우, 올리고 데옥시 뉴클레오타이드(oligo deoxy nucleotides) 로딩 단계는 생략합니다. 그런 다음, 20 µL의 DNA 용액을 시린지에 넣어 분당 10 µL의 속도로 챔버에 흘려 넣고 30분 동안 유지합니다. 30분간의 배양 후, 1X TE 버퍼 40 µL를 분당 50 µL의 속도로 흘려 플로우 챔버를 세척합니다.

세척이 완료되면 1X TE에 80 nM 농도로 희석한 동일한 FP-DBP 40 µL를 챔버에 주입합니다. DNA 분자의 전체 신장 범위를 관찰하려면 사용된 DNA 길이에 따라 서로 다른 유속을 적용하십시오. 형광 현미경의 60배 대물렌즈로 DNA를 관찰합니다. 다음은 비오틴화된 상보적 올리고뉴클레오타이드와 라이게이션 후, 표면에 고정된 박테리오파지 람다 DNA 분자가 유동에 의해 신장되는 모습을 보여주는 형광 현미경 영상입니다.

흐름 하에서 완전히 신장된 DNA 분자의 길이는 16.5 µm입니다. 이와 대조적으로, 박테리오파지 T4 DNA 분자는 흐름 하에서 56.4 µm의 길이로 신장됩니다. 이러한 신장은 가역적이며, DNA는 여러 번 신장과 이완을 반복할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 귀하는 대형 DNA 분석에서 FP-DBP를 사용하는 방법과 DNA 폴리머의 신장 및 이완을 실증하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.