휴대용 FRET 분석과 고감도 및 고속 형광 검출

이 프로토콜의 전반적인 목표는 상업적으로 이용 가능한 음료의 당 함량을 정량화하여 최적의 조건에서 FRET 분석기의 일반적인 적용 가능성을 입증하는 것입니다. 이 방법은 설탕과 같은 작은 분자의 감지 및 모니터링 분야에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 값비싼 고급 형광계 없이 작은 분자에 응답하는 새로운 신호를 효율적으로 모니터링할 수 있다는 것입니다.

시연은 저희 연구실의 Dr.Han이 맡습니다. 먼저, 맥아당 또는 자당 특이적 시안 및 황색 형광 바이오센서 플라스미드를 준비합니다. 그런 다음 5ml의 Luria 육수에 DE3 E.coli 단일 콜로니를 접종하고 섭씨 37도의 진탕 인큐베이터에서 16시간 동안 배양합니다.

다음으로, 100ml의 LB가 들어 있는 플라스크에 배양액 1밀리리터를 넣습니다. 섭씨 37도의 플라스크를 진탕 인큐베이터에서 600나노미터의 광학 밀도가 약 0.5가 될 때까지 배양합니다. 섭씨 4도에서 20분 동안 배양물을 원심분리합니다. 펠릿을 얼음처럼 차가운 증류수 50ml에 빠르게 재현탁시키고 다시 20분 동안 원심분리합니다.

펠릿을 50마이크로리터의 10부피 퍼센트 용액에 글리세롤과 얼음처럼 차가운 증류수에 재현탁합니다. 600나노미터의 광학 밀도가 100에 도달할 때까지 혼합물을 부드럽게 휘젓습니다. 얼음처럼 차가운 전기천공법 큐벳에 혼합물을 10나노그램의 CMY 플라스미드와 결합합니다.

혼합물을 전기천공합니다. 큐벳에서 SOC 배지 1밀리리터에 세포를 재현탁시킨 다음 15밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 37도에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 세포를 회복합니다.

암피실린 1밀리리터당 100마이크로그램이 든 LB 한천 플레이트에 세포를 펴 바릅니다. 세포를 37도에서 12시간 동안 배양합니다. 루프를 사용하여 단일 콜로니를 밀리리터당 100마이크로그램의 암피실린을 포함하는 10밀리리터의 LB로 이동합니다.

혼합물을 37도에서 배양하면서 12시간 동안 흔들어 종자 배양을 만듭니다. 종자 배양액 5ml를 암피실린이 함유된 LB 500ml로 옮기고 진탕 인큐베이터에서 37도의 세포를 배양합니다. 600나노미터의 광학 밀도가 0.5에 도달하면 IPTG를 첨가하여 최종 농도 0.5밀리몰을 만듭니다.

배양액을 24시간 동안 배양한 후 세포를 20분 동안 원심분리합니다. 상등액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 5ml의 결합 완충액에 다시 현탁시킵니다. 얼음 위에서 10초 동안 세포를 초음파 처리한 다음 10초 동안 세포를 식힙니다.

초음파 처리와 냉각을 5회 더 반복합니다. 용해물을 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 다른 수집 튜브로 옮깁니다.

니켈 NTA 친화성 컬럼에서 상등액을 정제합니다. 10, 000 밀리와트 농축기에 20 밀리리터의 정제된 시료를 채웁니다. 샘플을 10분 동안 원심분리한 다음 농축기에 0.8% 인산염 완충 식염수를 다시 채웁니다.

모든 단백질이 농축되고 탈염될 때까지 한 번에 20ml씩 이러한 방식으로 샘플의 나머지 부분에 대해 이 과정을 반복합니다. 정제된 FRET 바이오센서를 섭씨 80도에서 보관하십시오. CMY 바이오센서 단백질의 0.2 마이크로몰 용액과 0.8%PBS를 검출 용액으로 준비합니다.

휴대용 FRET 분석기를 켭니다. 분석 온도를 섭씨 53도로 설정합니다. 그런 다음 기기를 보정 모드로 설정합니다.

큐벳을 0.8%PBS로 배경으로 채웁니다. 분석기에서 샘플을 섭씨 53도로 예열한 다음 배경을 설정합니다. 다음으로, 큐벳에 검출 용액을 채웁니다.

큐벳을 분석기에 놓고 기준선을 설정합니다. 큐벳을 검출 용액이 포함된 큐벳과 1밀리몰 설탕으로 교체하십시오. 포화 상태에서 강도를 설정하여 보정을 마칩니다.

당 함량 분석을 위한 음료 시료 준비를 시작하려면 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 사용하여 1mL의 음료를 원심분리합니다. 1ml 주사기로 상층액을 제거하고 0.2마이크로미터 주사기 필터로 상층액을 여과합니다. 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 0.1ml의 여과액과 0.9ml의 0.8%PBS를 결합합니다.

완전한 희석을 보장하기 위해 혼합물을 부드럽게 와류로 만듭니다. 5마이크로리터의 희석된 음료 샘플과 495마이크로리터의 검출 용액을 큐벳에 넣습니다. 큐벳을 분석기에 넣고 샘플을 섭씨 53도로 예열합니다.

설정 버튼을 눌러 샘플의 설탕 함량을 측정합니다. 이 방법에서 FRET 효율은 바이오센서에서 청록색 형광 단백질에 대한 황색 형광 단백질의 방출 강도의 비율로 측정됩니다. 이러한 CMY 바이오센서의 최적 측정 온도는 섭씨 50도에서 55도 사이이며, 이는 제어 용액과 맥아당의 포화 용액 사이의 방출 강도 비율의 차이가 가장 크기 때문입니다.

CMY-BII 바이오센서를 사용하여 53도에서 세 가지 음료의 맥아당 함량을 평가했습니다. 용량 반응 곡선은 주어진 온도에서 다양한 맥아당 농도에서 이 비율을 구함으로써 생성됩니다. 방출 비율은 보정 중에 얻은 값을 사용하여 맥아당 농도와 관련이 있습니다.

측정된 맥아당 함량은 음료 제조업체에서 보고한 총 설탕 함량과 함께 표시됩니다. 음료 A에는 쌀과 보리와 같은 맥아당 공급원이 포함되어 있습니다. 이에 상응하여, 관찰된 맥아당의 양은 보고된 총 설탕 함량의 약 절반을 차지합니다.

스포츠 음료인 C 음료는 맥아 함량이 매우 낮았습니다. 이 절차를 시도하는 동안 장치와 FRET 센서를 섭씨 50도에서 55도 사이에서 작동해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 맞춤형 휴대용 FRET 분석기를 사용하여 이러한 작은 분자를 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.