휴대용 FRET 분석과 고감도 및 고속 형광 검출

본 프로토콜의 전반적인 목적은 시판 음료의 당 함량을 정량화함으로써 최적 조건 하에서 FRET 분석기의 일반적인 적용 가능성을 입증하는 것입니다. 이 방법은 당과 같은 소분자의 감지 및 모니터링 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고가의 고성능 형광 광도계 없이도 소분자에 반응하는 신선한 신호를 효율적으로 모니터링할 수 있다는 점입니다.

본 실험 절차는 저희 실험실의 Han 박사님이 시연하겠습니다. 먼저, 말토스 또는 수크로스 특이적 시안 및 옐로우 형광 바이오센서 플라스미드를 준비하십시오. 그런 다음 5 mL의 Luria broth에 DE3 E.Coli 단일 콜로니를 접종하고, 진탕 배양기에서 37 °C로 16시간 동안 배양하십시오.

다음으로, 배양액 1 mL를 100 mL의 LB가 들어 있는 플라스크에 넣습니다. 600 nm에서의 광학 밀도가 약 0.5가 될 때까지 37 °C의 진탕 배양기에서 플라스크를 배양합니다. 배양액을 4 °C에서 20분 동안 원심 분리합니다. 펠렛을 얼음처럼 차가운 증류수 50 mL에 빠르게 재현탁시킨 후, 다시 20분 동안 원심 분리합니다.

펠릿을 10 volume % 글리세롤과 얼음처럼 차가운 증류수 혼합액 50 µL에 재현탁합니다. 600 nm에서의 광학 밀도가 100에 도달할 때까지 혼합물을 부드럽게 흔들어 섞습니다. 얼음처럼 차가운 전기천공 큐벳에 혼합물과 10 ng의 CMY 플라스미드를 함께 넣습니다.

혼합물을 전기천공합니다. 큐벳에서 1 mL의 SOC 배지로 세포를 재현탁한 후, 15 mL 라운드 바텀 튜브로 옮깁니다. 37 °C에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 세포를 회복시킵니다.

100 µg/mL ampicillin이 포함된 LB agar 플레이트에 세포를 도말합니다. 세포를 37 °C에서 12시간 동안 배양합니다. 루프를 사용하여 단일 콜로니를 100 µg/mL ampicillin이 포함된 10 mL LB 배지로 옮깁니다.

종균 배양액을 만들기 위해 혼합물을 37°C에서 12시간 동안 진탕 배양합니다. 종균 배양액 5 mL를 ampicillin이 포함된 LB 배지 500 mL에 옮기고, 진탕 배양기에서 37°C로 세포를 배양합니다. 600 nm에서의 흡광도(optical density)가 0.5에 도달하면, IPTG를 첨가하여 최종 농도가 0.5 mM이 되도록 합니다.

배양액을 24시간 동안 배양한 후, 세포를 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 5 mL의 결합 버퍼에 재현탁합니다. 얼음 위에서 세포를 10초 동안 초음파 처리한 후, 10초 동안 냉각합니다.

초음파 처리와 냉각 과정을 5회 더 반복합니다. 용해물을 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 다른 수집 튜브로 옮깁니다.

니켈 NTA 친화성 컬럼으로 상층액을 정제합니다. 10,000 milliwatt 농축기에 정제된 샘플 20 milliliters를 채웁니다. 샘플을 10분 동안 원심분리한 후, 농축기에 0.8% 인산염 완충 식염수를 다시 채웁니다.

샘플의 나머지 부분에 대해 이 과정을 20 milliliters씩 반복하여, 모든 단백질이 농축되고 탈염될 때까지 진행합니다. 정제된 FRET 바이오센서를 80 degrees Celsius에서 보관하십시오. CMY 바이오센서 단백질 0.2 micromolar 용액과 0.8%PBS를 혼합하여 검출 용액으로 준비합니다.

휴대용 FRET 분석기를 켭니다. 분석 온도를 53 °C로 설정합니다. 그런 다음 기기를 교정 모드로 설정합니다.

배경값 측정을 위해 큐벳에 0.8% PBS를 채웁니다. 분석기 내에서 샘플을 53°C로 예열한 다음, 배경값을 설정합니다. 이어서 큐벳에 검출 용액을 채웁니다.

큐벳을 분석기에 넣고 베이스라인을 설정하십시오. 큐벳을 검출 용액과 1 mM 당분이 포함된 것으로 교체하십시오. 포화 상태에서의 강도를 설정하여 보정을 완료하십시오.

당 함량 분석을 위한 음료 시료 준비를 시작하려면, 1.5 mL 마이크로원심분리관에 음료 1 mL를 넣고 원심분리합니다. 1 mL 시린지를 사용하여 상층액을 제거하고, 0.2 µm 시린지 필터로 상층액을 여과합니다. 여과액 0.1 mL와 0.8% PBS 0.9 mL를 1.5 mL 마이크로원심분리관에 혼합합니다.

혼합물을 가볍게 볼텍싱하여 완전히 희석합니다. 희석된 음료 시료 5 µL와 검출 용액 495 µL를 큐벳에 넣습니다. 큐벳을 분석기에 넣고 시료를 53 °C로 예열합니다.

set 버튼을 눌러 시료의 당 함량을 측정합니다. 이 방법에서는 바이오센서 내 황색 형광 단백질과 청록색 형광 단백질의 방출 강도 비율을 통해 FRET 효율을 측정합니다. 대조 용액과 포화 말토스 용액 간의 방출 강도 비율 차이가 가장 크기 때문에, 이 CMY 바이오센서의 최적 측정 온도는 50에서 55 °C 사이입니다.

CMY-BII 바이오센서를 사용하여 53 °C에서 세 가지 음료의 말토스 함량을 평가하였습니다. 특정 온도에서 다양한 말토스 농도에 따라 이 비율을 구함으로써 용량-반응 곡선을 생성합니다. 방출 비율은 보정 과정에서 얻은 값을 사용하여 말토스 농도와 연관됩니다.

측정된 말토스 함량은 음료 제조업체가 보고한 총 당 함량과 함께 표시되었습니다. 음료 A에는 쌀과 보리 같은 말토스 공급원이 포함되어 있었습니다. 이에 따라, 관찰된 말토스 양은 보고된 총 당 함량의 약 절반을 차지합니다.

스포츠 음료인 Beverage C는 맥아당 함량이 매우 낮았습니다. 이 절차를 수행할 때는 장치와 FRET 센서를 50~55°C 사이에서 작동시켜야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 맞춤 제작된 휴대용 FRET 분석기를 사용하여 이러한 소분자를 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.